用于改善工程改造的微生物的方法和组合物

用于改善工程改造的微生物的方法和组合物

　　交叉引用

　　本申请要求2017年8月9日提交的美国临时申请62/543,288的权益，其通过引用纳入本文。

　　背景技术

　　到2050年，联合国粮食及农业组织预测，粮食总产量必须增加70％才能满足不断增长的人口的需求，这一挑战由于许多因素而加剧，包括淡水资源减少，对耕地的竞争加剧，能源价格上涨，投入成本增加以及作物可能需要适应干旱、炎热和更加极端的全球气候的压力。

　　感兴趣的领域之一是改进氮固定。氮气(N2)是地球大气的主要成分。此外，元素氮(N)是构成活生物体的许多化学化合物的重要组成部分。但是，许多生物体不能直接使用N2来合成生理过程诸如生长和繁殖中使用的化学物质。为了利用N2，N2必须与氢结合。氢与N2的结合称为氮固定。无论是通过化学方法还是生物方法实现的氮固定都需要大量能源的投入。在生物系统中，称之为固氮酶的酶催化反应，从而导致氮固定。氮固定研究的一个重要目标是将该表型扩展到非豆科植物，特别是重要的农艺草，如小麦、水稻和玉米。虽然在了解根际细菌和豆类之间的固氮共生关系的研究方面取得了巨大进展，但是将该知识用于在非豆科作物上诱导固氮结节的途径仍不清楚。同时，随着对增加粮食产量不断增加的需求，提供足够的氮补充源(如肥料)的挑战将继续增加。

　　发明概述

　　一方面中，本公开提供了一种细菌组合物，其包含：至少一种在农业系统中固定大气氮的基因工程改造的细菌菌株，其中所述细菌菌株包含选自bcsll、bcslll、yjbE、fhaB、pehA、glgA、otsB、treZ和cysZ的一种或多种基因中的修饰。

　　另一方面中，本公开提供了一种细菌组合物，其包含：植物生长促进性细菌菌株，其中所述菌株已经重构以增加所述植物生长促进性细菌菌株在植物上的定殖。在一些情况中，所述植物生长促进性细菌菌株的所述定殖发生在所述植物的根上。在一些情况中，所述细菌菌株在胞外多糖产生涉及的酶或途径中包含遗传修饰。在一些情况中，所述遗传修饰在选自下组的基因中：bcsII、bcsIII和yjbE。在一些情况中，所述细菌菌株在丝状血凝素产生涉及的酶或途径中包含遗传修饰。在一些情况中，所述遗传修饰在fhaB基因中。在一些情况中，所述细菌菌株在内聚半乳糖醛酸酶(endo-polygalaturonase)产生涉及的酶或途径中包含遗传修饰。在一些情况中，所述遗传修饰在pehA基因中。在一些情况中，所述细菌菌株在海藻糖产生涉及的酶或途径中包含遗传修饰。在一些情况中，所述遗传修饰是在选自下组的基因中：otsB和treZ。在一些情况中，所述细菌组合物被配制用于田间。在一些情况中，其中所述植物生长促进性细菌向所述植物提供营养。在一些情况中，所述植物生长促进性细菌向所述植物提供固定的氮。在一些情况中，所述植物选自下组：玉米，大麦，小麦，高粱，大豆和水稻。

　　在另一方面中，本公开提供了增加植物生长促进性细菌菌株在植物上的定殖的方法，所述方法包括：向所述植物生长促进性细菌菌株中引入选自下组的途径所涉及的基因的遗传修饰：胞外多糖产生，内聚半乳糖醛酸酶产生和海藻糖产生

　　在另一方面中，本公开提供了增加植物可用氮的方法，所述方法包括：向植物施加多个重构细菌，所述多个重构细菌的glgA表达降低。

　　在一些情况中，相较于所述重构细菌相同物种的非重构细菌的同化程度，所述重构细菌在所述重构细菌内具有较低的氮同化程度。

　　在另一方面中，本公开提供了增加植物可用氮固定的方法，所述方法包括：向植物施加多个重构细菌，所述多个重构细菌增加至少一种固氮酶辅因子的表达。在一些情况中，所述增加的固氮酶辅助因子是硫。在一些情况中，所述重构细菌的cysZ表达增加。在一些情况中，cysZ是硫转运体。

　　通过引用纳入

　　本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。

　　附图说明

　　所附权利要求书中具体说明了本发明的新特征。可参考以下详述更好地理解本发明的特征和优点，这些详述列出利用本发明原理的说明性实施方式和附图：

　　图1A描述了用于测试定殖的各种田间土壤的土壤质地图。几种微生物最初来源的土壤标为星号。

　　图1B描述了在四种不同土壤类型(圆形)中测试的菌株1和菌株5的定殖率。两种菌株在不同的土壤类型中表现出相对强健的定殖特性。

　　图1C描述了整个生长季节的田间试验中对菌株1的定殖。菌株1直到播种后的第12周持续存在于玉米组织，并且此后开始显示出定殖率下降。

　　图2A描述了根据实施方式的微生物育种的示意图。

　　图2B描述了图2A中所示微生物组合物的测量的展开图。

　　图2C描述了实施例7中利用的根的采样。[可以文字讨论，然后取出]

　　图3A-3C显示了在类似于高硝酸盐农业土壤条件下体外固定和分泌氮的衍生微生物。图3A显示了显示在PBC6.1中的控制氮固定和同化的调节网络，包括关键节点NifL，NifA，GS，GlnE，描述为双结构域AT酶(ATase)-AR酶和AmtB。图3B显示了蔗糖小迫氏菌(Kosakonia sacchari)分离株PBC6.1的基因组。围绕基因组的三个轨道分别传递了来自PBC6.1，PBC6.38的转录数据以及菌株之间的差异表达。图3C显示了氮固定基因簇，并扩展转录数据以获得更详细的信息。

　　图4显示了PBC6.1定殖到玉米根中与根相关的微生物群接近21％的丰度。丰度数据基于接种PBC6.1并在温室条件下生长的玉米植物的根际和内生物的16S扩增子测序。

　　图5显示了在蔗糖小迫氏菌(K.sacchari)的重构菌株中三个感兴趣的基因的表达增加，通过qPCR显示。在含有5mM谷氨酰胺的培养基中培养菌株。

　　图6显示了在存在或不存在谷氨酰胺的情况下，几种重构菌株的氮还原活性。

　　图7显示了使用本文所述的几种菌株的体外附着试验的结果。

　　图8A显示了使用如本文所述fhaB表达增加的重构菌株的体外附着试验的结果。该菌株相较于亲本菌株，6-848显著地显示出增加倍数的恢复(2.3x，P＝0.013)。

　　图8B显示了使用本文所述几种菌株的体外附着试验的结果。

　　图9显示了通过具有yjbE2基因和bcsIII操纵子上调的菌株增加附着。相较于6-848，两个重构菌株显示出略有增加：6-112(6-848+yjbE2-prm1):1.9x(p＝0.07)和6-1126(6-848+bcsIII-prm2):1.7x(p＝0.06)。菌株6-1127(6-848+bcsIII-prm9)显示出相对6-848显著地2.5倍增加(p＝0.0005)。

　　图10显示了体外附着试验的结果。0是没有微生物添加到水中，462是DH10B大肠杆菌(一种非植物相关的对照)添加到了水中，6-848和6-881是本文所述试验中使用的其他菌株的亲本菌株(阳性对照)。在未接种的和大肠杆菌对照表现出一些背景，然而，野生型菌株6和亲本对照6-848和6-881相对于阴性对照显示出显著的附着(P<0.05)。

　　图11显示了pehA基因、yjbE2基因和bcsII操纵子中具有修饰的菌株的附着增加。

　　图12显示了在存在和不存在谷氨酰胺的情况下，重构菌株中修饰基因的过表达。

　　图13A显示了在存在和不存在谷氨酰胺的情况下，重构菌株中修饰基因的过表达。

　　图13B显示了在存在和不存在谷氨酰胺的情况下，重构菌株中修饰基因的过表达。

　　图13C显示了在存在和不存在谷氨酰胺的情况下，重构菌株中修饰基因的过表达。

　　图14显示了在厌氧条件下本文所述的三种菌株的铵分泌。

　　图15显示了本文所述的几种菌株的铵分泌。

　　图16显示了本文所述的其他菌株的铵分泌。

　　图17显示了本文所述的其他菌株的铵分泌。

　　图18显示了本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图19显示了本文所述的其他菌株的铵分泌。

　　图20显示了本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图21显示了本文所述的其他菌株的铵分泌。

　　图22A显示了在存在或不存在氮的情况下本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图22B显示了在存在或不存在氮的情况下本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图23A显示了本文所述菌株的铵分泌。

　　图23B显示了本文所述菌株的铵分泌。

　　图24显示了在存在或不存在氮的情况下本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图25显示了本文所述菌株的铵分泌。

　　图26A显示了在存在或不存在氮的情况下本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图26B显示了在存在或不存在氮的情况下本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图27A显示了本文所述菌株的铵分泌。

　　图27B显示了本文所述菌株的铵分泌。

　　图28显示了温室试验中本文所述菌株的定殖。用于定殖的温室试验缺乏统计能力来区分差异p<0.05。

　　图29显示了温室试验中本文所述的其他菌株的定殖。

　　图30显示了温室试验中本文所述菌株的定殖。

　　图31显示了温室试验中本文所述菌株的定殖。

　　图32显示了温室试验中本文所述菌株的定殖。

　　图33显示了本文所述菌株的铵分泌。

　　图34显示了在存在或不存在氮的情况下本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图35显示了本文所述菌株的铵分泌。

　　图36显示了在存在或不存在氮的情况下本文所述的几种菌株的氮还原活性。

　　图37显示了本文所述菌株的定殖。

　　图38显示了本文所述菌株的定殖。

　　发明详述

　　虽然本发明显示和描述了本发明的各自实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于本发明。

　　增加化肥利用带来了环境问题，而且在全球许多经济压力较大的地区也可能无法实现。此外，微生物领域的许多业者正着力打造属间微生物。然而，将微生物表征/分类为属间存在沉重的监管负担。这些属间微生物不仅面临更高的监管负担(这使得广泛采用和实施变得困难)，而且还面临着大量公众审查。

　　当前，市场上没有非属间并能够增加非豆科作物氮固定能力的工程改造的微生物。缺乏这种微生物是帮助引入真正环保且更具可持续性的21世纪农业体系所缺少的要素。

　　本公开解决了上述问题，并提供了一种非属间微生物，其经工程改造以容易地固定农作物中的氮。这些微生物没有被表征/分类为属间微生物，因此不会面临此类微生物的巨大监管负担。此外，所教导的非属间的微生物将有助于帮助21世纪的农民变得不那么依赖于利用不断增加的外源性氮肥量。

　　引导性微生物重构是这样一种最先进的过程，其鉴定、表征和微调微生物，以实现其在作物根部定殖并增加营养吸收的全部潜力。在一些情况中，引导性微生物重构可以使用自然存在于每个微生物中的遗传物质，以增加作物对氮的摄取。更好的营养可用性改善了作物质量和产量潜力。

　　微生物中存在称之为固氮酶的酶复合物，它们负责将大气中的氮还原为氨，并且微生物和植物都通过谷氨酰胺合酶(GS)将氨转化为谷氨酰胺，从而将其转化为对于微生物和植物生长和发育至关重要的氨基酸。所述nif基因是编码固氮酶复合物的基因。除了固氮酶，nif基因还编码涉及氮固定的许多调节蛋白。诱导nif基因的表达作为对根际中低水平的固定氮和氧浓度的应答。在大多数固氮细菌中，nif基因转录的调控通过氮敏感性NifA蛋白。当没有足够的固定的氮供生物使用时，NifA表达被激活，并且NifA激活其余的nif基因。如果根际中存在足够数量还原的氮或氧，那么会激活另一种蛋白质NifL。NifL抑制NifA活性，从而抑制固氮酶的形成。

　　可以被改变以增加谷物作物氮可用性的微生物氮固定方面的实例包括：

　　a)增强根际中作物根部和微生物之间的相互作用。

　　b)通过消除NifA蛋白的负调控来增强微生物氮固定。例如，nifL基因的缺失在氧气和外源性固定的氮存在下的情况下消除了对NifA活性的抑制并改善了nif表达。此外，在不依赖氮的启动子的控制下表达nifA可使固氮酶生物合成与感测环境氮和氧解偶联。

　　c)通过抑制微生物中对谷氨酰胺的氨同化作用以及增加从微生物的氨分泌来增强植物的氨可用性。例如，通过GS将通过微生物固定的氮快速同化至谷氨酰胺由双结构域腺苷酰基转移酶(ATase)酶GlnE可逆地调节，其通过GS的腺苷酰化和去腺苷酰化(deadenylylation)作用，以分别减弱和恢复活性。截短GlnE蛋白以使其腺苷酰基去除(adenyiyi4emoving，AR)结构域缺失将导致组成型腺苷化的谷氨酰胺合成酶，限制微生物的氨同化并增加胞内和胞外氨。最后，使amtB基因缺失将导致更多的氨分泌，该基因编码负责微生物氨摄取的转运体。

　　在一些情况中，通过本文描述的方法产生的最终微生物不包含外来(转基因)遗传物质，并且可以适合释放到田间。微生物中的遗传改变可能包括下述内容，生物体自身基因组内的序列缺失或小序列重排，如在微生物基因组内创建启动子序列的拷贝并将该拷贝插入不同的基因前面。因此，引入微生物基因组中的任何遗传元件都可以源自相同的亲本微生物。此外，引入微生物基因组中的遗传元件可以是非编码遗传元件。所得突变可能是“无标志物的”，这意味着它们不包含引入的抗生素抗性或通常用于在细菌中产生突变的其他可选择标志物基因。在一些情况中，引导性微生物重构的过程可能涉及将一些辅助DNA分子引入细菌细胞，以促进非转基因突变的产生。然而，可以从菌株中彻底去除所有辅助DNA。例如，在一些情况中，在考虑将所述菌株用于田间释放之前，可以从菌株中除去所有外来DNA。可以确认所有辅助DNA的去除，例如，通过亿明达(illumina)测序，这是一种甚至可以检测辅助DNA序列单个分子的灵敏方法。因此，通过引导性微生物重构产生的微生物可能不包含转基因或外来DNA，并且菌株中的遗传变化仅由序列缺失和启动子重排组成，这已证明是自然发生的。

　　定义

　　术语“多核苷酸”，“核苷酸”，“核苷酸序列”，“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸聚合形式，不论是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以进行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性例子：基因或基因片段的编码或非编码区域，由连锁分析定义的基因座，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转移RNA，核糖体RNA，短干扰RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)，微RNA(miRNA)，核酶，cDNA，重组多核苷酸，支链多核苷酸，质粒，载体，任意序列的分离DNA，任意序列的分离RNA，核酸探针和引物。多核苷酸可包括一种或多种修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，对核苷酸结构的修饰可在聚合物的组装之前或之后赋予。核苷酸序列可间插有非核苷酸组分。多核苷酸聚合后可以被进一步修饰，如通过与标记组分偶联。

　　如本文所用，“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(例如转录成mRNA或其他RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录本和编码的多肽可以共同称之为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。

　　术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是线性或支化聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，并且可间插有非氨基酸。该术语也包括修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作，如与标记组分偶联。如本文所用，术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和肽模拟物。

　　本文所用术语“约”与术语“大致/大约”同义。说明性地，相对于数量使用术语“约”表示值稍微超出引用的值，例如，正负0.1％到10％。

　　粮食作物中及其周围的微生物会影响这些作物的性状。可能受微生物影响的植物性状包括：产量(例如，谷物生产，生物质生成，果实发育，花序形成)；营养(例如氮，磷，钾，铁，微量营养素获取)；非生物胁迫管理(例如，耐旱，耐盐，耐热)；和生物胁迫管理(例如，害虫，杂草，昆虫，真菌和细菌)。改变农作物性状的策略包括：增加关键代谢物的浓度；改变微生物对关键代谢物影响的时间动态；将微生物代谢物生产/降解与新的环境线索相关联；减少负代谢物；和改善代谢物或基础蛋白质的平衡。

　　在一些实施方式中，本公开的基因的天然或内源控制序列被一个或多个属内控制序列替代。

　　如本文所用，“引入”是指通过现代生物技术的引入，而不是自然发生的引入。

　　在一些实施方式中，本公开的细菌已经被修饰，使得它们不是天然存在的细菌。

　　在一些实施方式中，本公开的细菌以至少103cfu、104cfu、105cfu、106cfu、107cfu、108cfu、109cfu、1010cfu、1011cfu或1012cfu/克植物鲜重或干重的量存在于植物。在一些实施方式中，本公开的细菌以至少约103cfu、约104cfu、约105cfu、约106cfu、约107cfu、约108cfu、约109cfu、约1010cfu、约1011cfu或约1012cfu/克植物鲜重或干重的量存在于植物。在一些实施方式中，本公开的细菌以至少103-109、103-107、103-105、105-109、105-107、106-1010、106-107cfu/克植物鲜重或干重的量存在于植物。

　　本公开内容的肥料和外源性氮可包含下述含氮分子：铵，硝酸盐，亚硝酸盐，氨，谷氨酰胺等。本公开的氮源可包括无水氨，硫酸氨，尿素，磷酸二铵，尿素-形式，磷酸一铵，硝酸铵，氮溶液，硝酸钙，硝酸钾，硝酸钠等

　　如本文所用，“外性源氮”是指在非氮限制条件下存在于土壤、田地或生长介质中容易获得的非大气氮，包括氨，铵，硝酸盐，亚硝酸盐，尿素，尿酸，铵酸等。

　　如本文所用，“非氮限制条件”指土壤、田地、介质中可用的浓度大于约4mM氮的非大气氮，如Kant等(2010.J.Exp.Biol.62(4):1499-1509)中所公开，其通过引用纳入本文。

　　如本文所用，“属间微生物”是由最初分离自不同分类属的生物体的遗传物质的有意组合形成的微生物。“属间突变体”可以与“属间微生物”互换使用。示例性的“属间微生物”包括这样的微生物，其包含首先在与受体微生物不同的属的微生物中鉴定的可移动遗传元件。

　　如本文所用，“属内微生物”是由最初分离自相同分类属的生物体的遗传物质的有意组合形成的微生物。“属内突变体”可以与“属内微生物”互换使用。

　　如本文所用，“引入的遗传物质”表示添加至受体基因组并作为其组成部分保留的遗传物质。

　　在一些实施方式中，氮固定和同化的遗传调控网络包括：引导、调整和/或调节微生物氮固定和/或同化的非编码序列和编码基因的多核苷酸，并且可以包含nif簇(例如，nifA、nifB、nifC、.......nifZ)的多核苷酸序列，编码氮调节蛋白C的多核苷酸，编码氮调节蛋白B的多核苷酸，glN簇(例如，glnA和glnD)的多核苷酸序列，draT和氨转运体/通透酶。在一些情况中，Nif簇可以包含NifB，NifH，NifD，NifK，NifE，NifN，NifX，hesa和NifV。在一些情况中，Nif簇可以包含NifB，NifH，NifD，NifK，NifE，NifN，NifX，hesa和NifV的子集。

　　在一些实施方式中，本公开的肥料包含至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％氮干重。

　　在一些实施方式中，本公开的肥料包含至少约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％、约31％、约32％、约33％、约34％、约35％、约36％、约37％、约38％、约39％、约40％、约41％、约42％、约43％、约44％、约45％、约46％、约47％、约48％、约49％、约50％、约51％、约52％、约53％、约54％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％、约61％、约62％、约63％、约64％、约65％、约66％、约67％、约68％、约69％、约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％氮干重。

　　在一些实施方式中，本公开的肥料包含约5％-50％、约5％-75％、约10％-50％、约10％-75％、约15％-50％、约15％-75％、约20％-50％、约20％-75％、约25％-50％、约25％-75％、约30％-50％、约30％-75％、约35％-50％、约35％-75％、约40％-50％、约40％-75％、约45％-50％、约45％-75％或约50％-75％氮干重。

　　在一些实施方式中，测量植物中相对于尚未暴露于本公开的细菌的对照植物的氮固定增加和/或氮产生。测量细菌中相对于对照细菌的所有增加或减少。测量植物中相对于对照植物的所有增加或减少。

　　如本文所用，“组成型启动子”是这样的启动子，其在大多数条件下和/或在大多数发育阶段具有活性。在生物技术中所用表达载体中使用组成型启动子有几个优点，例如：高水平产生用于选择转基因细胞或生物体的蛋白质；高水平表达报告物蛋白或可评分标志物，允许容易的检测和定量；高水平产生作为调节转录系统一部分的转录因子；产生需要在生物体中普遍存在的活性的化合物；和产生在发育的所有阶段其间所需的化合物。非限制性示例性组成型启动子包括：CaMV 35S启动子，opine启动子，泛素启动子，醇脱氢酶启动子等。

　　如本文所用，“非组成型启动子”是这样的启动子，其是在某些条件下在某些类型的细胞中和/或在某些发育阶段具有活性的启动子。例如，组织特异性、组织优选、细胞类型特异性、细胞类型优选、诱导型启动子和处于发育控制下的启动子是非组成型启动子。在发育控制下的启动子的实例包括优先在某些组织中启动转录的启动子。

　　如本文所用，“诱导型”或“抑制型”启动子是受化学或环境因素控制的启动子。可能影响诱导型启动子转录的环境条件的实例包括：厌氧条件，某些化学物质，光照、酸性或碱性条件的存在等。

　　如本文所用，“组织特异性”启动子是仅在某些组织中启动转录的启动子。与基因的组成型表达不同，组织特异性表达是基因调控的几个相互作用水平的结果因此，在本领域中，优选使用来自同源或紧密相关物种的启动子以实现特定组织中转基因的高效和可靠的表达。这是从科技和专利文献中发现的分离自特定组织的大量组织特异性启动子的主要原因之一。

　　如本文所用，术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上核酸序列的联合，使得一个的功能被另一个调节。例如，当启动子能够调节该编码序列的表达时(即，编码序列在启动子的转录控制下)，启动子与编码序列可操作地连接。编码序列可以正义或反义方向与调控序列可操作地连接。在另一个实例中，本公开的互补RNA区可以直接或间接地与靶mRNA的5'或与靶mRNA的3'或在靶mRNA内可操作地连接，或者第一互补区是5'且其互补物是靶mRNA的3'。

　　在方面中，“将多种非属间细菌施用于植物”包括使植物(包括植物部分，如种子、根、茎、组织等)与所述细菌在植物生命周期的任何阶段接触(即，暴露)的任何方式。因此，“将多种非属间细菌施用于植物”包括将植物(包括植物部分，如种子、根、茎、组织等)暴露于所述细菌的任何下述方式：喷洒到植物上，淋滴到植物上，作为种皮施用，施用到随后将种植种子的田地，施用到已经种植种子的田地，施用到具有成年植物的田地等。

　　术语mmol为毫摩尔的缩写，它是千分之一(10-3)的摩尔(本文中缩写为mol)。

　　如本文所用，术语“微生物体”或“微生物”应广义地理解。这些术语可以互换使用，包括但不限于，两个原核域：细菌和古细菌。该术语还可以包含真核真菌和原生生物。

　　术语“微生物菌群(microbial consortia)”或“微生物聚生体(microbialconsortium)”指可以被描述为执行共同功能的个体的微生物物种或物种菌株的微生物群落(community)的子集，或者可以被描述为参与、或导致或与可识别参数(如感兴趣的表型性状)相关联。

　　术语“微生物群落(microbial community)”是指包含两种或更多种物种或菌株的一组微生物。与微生物菌群不同，微生物群落不必执行共同的功能，也不必参与，或导致或与可识别的参数(如感兴趣的表型性状)相关联。

　　如本文所用，“分离”、“分离的”，“分离的微生物”和类似术语旨在表示已经与其在特定环境(例如，土壤，水，植物组织等)中相关联的至少一种材料分离的一种或多种微生物。因此，“分离的微生物”在其自然存在的环境中并不存在；而是可以说，通过本文所述的各种技术，微生物已从其自然环境中移出并置于非自然存在的状态中。因此，分离的菌株或分离的微生物可以作为例如生物学上纯的培养物或作为孢子(或菌株的其他形式)存在。在方面中，分离的微生物可以与可接受的运载体相关联，所述运载体可以是农业上可接受的运载体。

　　在本公开的某些方面中，分离的微生物以“分离的和生物学上纯的培养物”存在。本领域技术人员将理解的是特定微生物的分离的和生物学上纯的培养物表示所述培养物基本上不含其他活生物体，并且仅包含所讨论的单个微生物。培养物可以包含不同浓度的所述微生物。本公开指出，分离的和生物学上纯的微生物通常“必然不同于纯度较低或不纯的材料”。参见例如，In re Bergstrom,427F.2d 1394,(CCPA 1970)(讨论纯化的前列腺素)，参见例如，In re Bergy,596F.2d 952(CCPA 1979)(讨论纯化的微生物)，参见例如，Parke-Davis&Co.v.H.K.Mulford&Co.,189F.95(S.D.N.Y.1911)(Learned Hand讨论了纯化的肾上腺素),部分改编,部分修订,196F.496(第2巡回法院.1912)，其各自通过引用纳入本文。此外，在某些方面中，本公开内容提供了必须在分离的和生物学上纯的微生物培养物中存在的浓度或纯度限制的某些定量测量。在某些实施方式中，这些纯度值的存在是将本公开的微生物与以自然状态存在的那些微生物区分开的另一属性。参见例如，Merck&Co.v.Olin Mathieson Chemical Corp.,253F.2d 156(第四巡回法院1958)(讨论微生物产生的维生素B12的纯度限制),通过引用纳入本文。

　　如本文所用，“个体分离物”应被理解为是指在与一种或多种其他微生物分离之后，包含微生物的单个属、种或菌株的优势的组合物或培养物。

　　本公开的微生物可以包括孢子和/或营养细胞。在某些实施方式中，本公开的微生物包括处于存活但不可培养(VBNC)状态的微生物。如本文所用，“孢子”或“芽孢”是指由细菌和真菌产生适于存活和分散的结构。孢子通常被表征为休眠结构；但是，孢子能够通过发芽过程分化。发芽是将孢子分化为能够进行代谢活性、生长和繁殖的营养细胞。单个孢子的发芽导致单个真菌或细菌营养细胞。真菌孢子是无性繁殖的单位，并且在一些情况中是真菌生命周期中必不可少的结构。细菌孢子是通常可能不利于营养细胞存活或生长的存活条件的结构。

　　如本文所用，“微生物组合物”指包含本公开的一种或多种微生物的组合物。在一些实施方式中，将微生物组合物给予植物(包括各种植物部分)和/或农业领域中。

　　如本文所用，“运载体”、“可接受的运载体”或“农业上可接受的运载体”是指可以与微生物一起给予不会有害地影响微生物的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。

　　描述本发明时(特别是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一个”和“一种”和“该”等类似表达应解释为涵盖单数和复数，除非另有说明或者上下文明确另有所指。—术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”应解释为开放式术语(即，表示“包括，但不限于”)，除非另有说明。除非本文中另有说明，本文中对数值范围的引用仅仅是一种速记方法，单独表示落在该范围内的各个独立的值，且各个独立的值包括在说明书范围内，如同它们被单独引用。例如，如果公开了范围10-15，那么还公开了11、12、13和14。本文所述的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非另有说明或者与上下文明显矛盾。本文涉及的任何和所有实施例/实例，或者示例性的语言(例如，“例如/如/诸如”)的使用仅仅是为了更好地阐述本发明，而不是对本发明所要求保护范围的限制，除非另外指出。说明书中的所有语言都不应解释为指示对本发明实践所必需的非权利要求的要素。

　　细菌定殖

　　在一些实施方式中，可以修饰微生物以增加氮向植物的递送。例如，可以修饰微生物以增加植物根的定殖或增加氮固定所需的辅因子。

　　在一些情况中，胞外多糖可能涉及植物的细菌定殖。在一些情况中，植物定殖微生物可能会产生生物膜。在一些情况中，植物定殖微生物分泌分子，所述分子可能有助于与植物的粘附或逃避植物的免疫应答。在一些情况中，植物定殖微生物可能分泌信号转导分子，所述信号转导分子改变植物对微生物的应答。在一些情况中，植物定殖微生物可能分泌分子，所述分子改变局部微环境。在一些情况中，植物定殖微生物可能改变基因的表达，以适应所述微生物邻近的植物。在一些情况中，植物定殖微生物可能会在局部环境中检测到植物的存在，并可能响应而改变基因的表达。

　　氮固定的调节

　　在一些情况中，氮固定途径可能会作为基因工程改造和优化的目标。可以通过本文描述的方法调控而靶向的一种性状是氮固定。氮肥是农场最大的运营费用，也是玉米和小麦等行作物较高产量的最大推动力。本文描述了可以在非豆科作物中递送可再生形式的氮的微生物产品。尽管某些内生菌具有在纯培养中固定氮所需的遗传，但根本的技术挑战是谷物和草类的野生型内生菌在施肥田中停滞氮固定。田间土壤中化肥的施用和残留的氮水平向微生物发出信号以关闭固氮的生化途径。

　　氮固定调节网络中组分的转录水平和翻译后水平的变化可能有利于开发能够在肥料存在的情况下将氮固定并转移至玉米的微生物。为此，本文描述了宿主-微生物进化(Host-Microbe Evolution，HoME)技术，以精确地进化调节网络并引出新型表型。本文还描述了分离自玉米的固氮内生菌的独特专有文库，并与不同环境条件(如氮胁迫和过量)下微生物与宿主植物相互作用的大量组学数据配对。在一些实施方式中，该技术能够使内生菌的遗传调控网络精确进化，以产生即使在田间存在肥料的情况下也能主动固定氮的微生物。本文还描述了定殖于玉米根部组织并为已经施肥的植物产生氮的微生物的技术潜力的评估，以及内生菌与标准制剂实践和多种土壤的相容性的评估，以确定将微生物整合到现代氮管理策略的可行性。

　　为了利用元素氮(N)进行化学合成，生命形式将大气中可用的氮气(N2)与氢通过称为固氮的过程相结合。因为生物氮固定的能量密集型性质，固氮生物(diazotroph)(固定大气中的氮气的细菌和古细菌)对nif基因簇具有进化的精细且严格的调节，响应环境氧气和可用氮。Nif基因编码参与氮固定的酶(如固氮酶复合物)和调节氮固定的蛋白质。Shamseldin(2013.Global J.Biotechnol.Biochem.8(4):84-94)公开了nif基因及其产物的详细描述，并通过引用纳入本文。本文描述了产生具有改良性状的植物的方法，其包括由第一植物分离细菌，将遗传变异引入分离细菌的基因中以增加氮固定，将第二植物暴露于变体细菌，由相对于第一植物具有改良的性状的第二植物分离细菌，和使用分离自第二植物的细菌重复该步骤。

　　在变形菌门(Proteobacteria)中，氮固定的调节围绕结合σ54依赖性增强子的蛋白质NifA(nif簇的阳性转录调节剂)。活性NifA的胞内水平受两个关键因素控制：nifLA操纵子的转录，和通过与NifL的蛋白质间相互作用来抑制NifA活性。这两个过程经由PII蛋白信号转导级联响应胞内谷氨酰胺水平。这种级联通过GlnD介导，GlnD可以直接感测谷氨酰胺并催化两种PII调节蛋白GlnB和GlnK的尿苷酰基化(uridylylation)或去尿苷酰基化(deuridylylation)，分别响应是否存在结合的谷氨酰胺。在氮过量的条件下，未修饰的GlnB信号指示nifLA启动子的失活。然而，在氮限制的条件下，翻译后修饰GlnB，从而抑制了其活性并导致nifLA操纵子的转录。这样，通过PII蛋白信号转导级联响应环境氮，严格控制nifLA转录。在NifA调节的翻译后水平上，GlnK以依赖于细胞内游离GlnK总体水平的方式抑制NifL/NifA相互作用。

　　NifA转录自nifLA操纵子，所述nifLA操纵子的启动子由磷酸化的NTRC，另一个σ54依赖性调节剂激活。NtrC的磷酸化状态通过组氨酸激酶NtrB介导，其与去尿苷酰基化的GlnB相互作用，而不与尿苷酰基化的GlnB相互作用。在氮过量的条件下，高胞内水平的谷氨酰胺会导致GlnB的去尿苷酰基化，然后其与NtrB相互作用以使其磷酸化活性失活并激活其磷酸酶活性，从而导致NtrC的去尿苷酰基化并使nifLA启动子失活。然而，在氮限制的条件下，低水平的胞内谷氨酰胺会导致GlnB尿苷酰基化，这会抑制其与NtrB的相互作用并允许NtrC磷酸化和nifLA操纵子的转录。这样，通过PII蛋白信号转导级联响应环境氮，严格控制nifLA表达。nifA、ntrB、ntrC和glnB都是可以在本文所述方法中突变的基因。这些过程也可能响应氨、尿素或硝酸盐的胞内或胞外水平。

　　响应环境氮，NifA的活性也被翻译后调节，最典型地是通过NifL介导的NifA活性抑制。通常，NilL和NifA的相互作用受到经由GlnK的PII蛋白信号转导级联的影响，尽管GlnK和NifL/NifA之间相互作用的性质在固氮生物之间差异很大。在肺炎链球克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中，两种形式的GlnK抑制NifL/NifA相互作用，而GlnK与NifL/NifA之间的相互作用取决于细胞内游离的GlnK的总体水平。在氮过量的条件下，去尿苷酰基化的GlnK与铵转运体AmtB相互作用，其有助于阻止AmtB的铵摄取以及螯合GlnK至膜，从而使NifL抑制NifA。另一方面中，在棕色固氮菌(Azotobacter vinelandi)中，NifL/NifA相互作用和NifA抑制需要与去尿苷酰基化的GlnK相互作用，而GlnK的尿苷酰基化抑制其与NifL的相互作用。在缺乏nifL基因的固氮生物中，有证据表明，在氮过量条件下，通过与GlnK和GlnB的去尿苷酰基化形式相互作用直接抑制了NifA活性。在某些细菌中，Nif簇可能受glnR调控，并且在一些情况中，这可能包含负调控。无论机制如何，NifA的翻译后抑制作用是大多数已知固氮生物中nif簇的重要调节剂。此外，nifL、amtB、glnK和glnR是可以在本文所述方法中突变的基因。

　　除了调节nif基因簇的转录以外，许多固氮生物已经进化了直接翻译后修饰和抑制固氮酶本身的机制，称之为固氮酶关闭。这是通过氮过量条件下Fe蛋白(NifH)的ADP核糖基化介导的，其破坏了它与MoFe蛋白复合物(NifDK)的相互作用并消除了固氮酶活性。DraT催化Fe蛋白的ADP-核糖基化和固氮酶的关闭，而DraG催化ADP-核糖的去除和固氮酶的重新激活。与nifLA转录和NifA抑制一样，固氮酶关闭也经由PII蛋白信号转导级联调节。在氮过量的条件下，去尿苷酰基化的GlnB与DraT相互作用并激活DraT，而去尿苷酰基化的GlnK与DraG和AmtB相互作用以形成复合物，螯合DraG至膜。在氮限制条件下，GlnB和GlnK的尿苷酰基化形式分别不与DraT和DraG相互作用，从而导致DraT的失活和DraG扩散至Fe蛋白，其中其去除ADP核糖并激活固氮酶。本文所述的方法还预期将遗传变异引入nifH、nifD、nifK和draT基因。

　　虽然某些内生菌具有体外固定氮的能力，但是高水平的外源化肥在田间常常使基因沉默。可以将外源性氮的感测与固氮酶的表达去偶联以促进基于田间的固氮。随着时间的推移提高固氮酶活性的整体水平还有助于增加氮的产量，以供农作物利用。使用本文所述方法进行遗传变异以促进基于田间的氮固定的特定靶标包括选自下组的一个或多个基因：nifA、nifL、ntrB、ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB和nifQ。

　　使用本文所述方法进行遗传变异以促进基于田间的氮固定的另一靶标是NifA蛋白。NifA蛋白通常是表达氮固定基因的激活剂。增加NifA的产量(组成型地或在高氨条件下)绕过天然氨感测途径。此外，减少NifA蛋白(一种已知的NifA抑制剂)的产生也会导致游离的活性NifA的水平增加。此外，增加nifAL操纵子的转录水平(组成型或在高氨条件下)也会导致整体较高水平的NifA蛋白。通过改变启动子自身或通过降低NtrB(在高氮条件下原本会导致nifAL操纵子关闭的ntrB和ntrC信号转导级联的部分)的表达来实现nifAL表达水平的提高。通过本文所述的这些或任何其他方法实现的高水平的NifA增加了内生菌的氮固定活性。

　　使用本文所述方法进行遗传变异以促进基于田间的氮固定的另一靶标是GlnD/GlnB/GlnK PII信号转导级联。通过GlnD/GlnB/GlnK PII信号转导级联来感测胞内谷氨酰胺水平。GlnD中的活性位点突变消除了GlnD的尿苷酰基去除活性，从而破坏了氮感测级联。此外，降低GlnB浓度会使谷氨酰胺感测级联短路。这些突变“欺骗”细胞进入感知氮限制状态，从而增加了氮固定水平活性。这些过程也可能响应氨、尿素或硝酸盐的胞内或胞外水平。

　　amtB蛋白也是使用本文所述方法进行遗传变异以促进基于田间的氮固定的靶标。可以通过降低amtB蛋白的表达水平来减少从环境中的氨摄取。在没有胞内氨的情况下，内生菌就无法感测到高水平的氨，从而阻止了氮固定基因的下调。设法进入胞内区室的任何氨都会转化为谷氨酰胺。胞内谷氨酰胺水平是氮感测的主要手段。降低胞内谷氨酰胺水平防止细胞感知环境中的高铵水平。可以通过增加谷氨酰胺酶(一种将谷氨酰胺转化为谷氨酸的酶)的表达水平来实现这种作用。此外，还可以通过减少谷氨酰胺合成酶(一种将氨转化为谷氨酰胺的酶)来减少胞内谷氨酰胺。在固氮生物中，固定的氨会迅速被同化为谷氨酰胺和谷氨酸，以用于细胞过程。对氨同化作用的破坏可以使固定的氮转移，以氨的形式从细胞中输出。固定的氨主要通过glnA编码的谷氨酰胺合成酶(GS)同化成谷氨酰胺，然后被谷氨酰胺氧化戊二酸氨基转移酶(GOGAT)同化成谷氨酰胺。在一些实例中，glNS编码谷氨酰胺合成酶。GS通过GS腺苷酰基转移酶(GlnE)的翻译后调控，GlnE是由glnE编码的双功能酶，其分别通过其腺苷酰基转移酶(AT)和腺苷酰基去除(AR)的活性催化GS的腺苷酰化作用和去腺苷酰化作用。在氮限制条件下，表达glnA，GlnE的AR结构域使GS去腺苷酰化，从而使其具有活性。在氮过量的条件下，glnA表达被关闭，且GlnE的AT结构域被谷氨酰胺变构激活，从而导致GS的腺苷酰基化和失活。

　　此外，draT基因也可以是使用本文所述方法进行遗传变异以促进基于田间的氮固定的靶标。一旦通过细胞产生了氮固定酶，那么固氮酶关闭代表了另一个水平，在该水平下，细胞在高氮条件下下调了固定活性。可以通过降低DraT的表达水平来消除这种关闭。

　　用于赋予新微生物表型的方法可以在转录、翻译和翻译后水平上进行。转录水平包括启动子的改变(如改变sigma因子亲和力或转录因子的结合位点，包括全部或部分启动子的缺失)或改变转录终止子和衰减子。翻译水平包括核糖体结合位点的变化和mRNA降解信号的变化。翻译后水平包括使酶的活性位点突变和改变蛋白质间相互作用。这些变化可以通过多种方式实现。可以通过将天然核糖体结合位点(RBS)或启动子与强度/效率较低的另一个交换来实现表达水平的降低(或完全废除)。可以将ATG起始位点交换为GTG、TTG或CTG起始密码子，从而导致编码区的翻译活性降低。完全消除表达可以通过敲除(缺失)基因编码区来完成。使开放阅读框(ORF)移码可能会导致沿ORF的提早终止密码子，从而产生无功能的截短产物。插入框内终止密码子同样会产生无功能的截短产物。也可以在N或C末端添加降解标签以降低特定基因的有效浓度。

　　相反，本文所述基因的表达水平可通过使用更强的启动子来实现。为了确保高氮水平条件下(或其他条件下)的高启动子活性，可以获取高氮水平条件下整个基因组的转录谱，并可以从该数据集中选择具有所需转录水平的活性启动子来替代弱启动子。为了更好的翻译起始效率，弱起始密码子可与ATG起始密码子互换。弱核糖体结合位点(RBS)也可以换成具有更高翻译起始效率的其他RBS。另外，还可以进行位点特异性诱变以改变酶的活性。

　　除了调节固氮酶基因和氮同化基因外，分泌的氮的水平还可能受到固定和/或同化中所涉及的辅助因子的可用性的影响。例如，硫是某些固氮酶的组分。通常，硫必须通过细胞膜转移。在百脉根(L.japonicus)中，硫酸盐转运体LjSST1对于氮固定是必不可少的；敲除突变体无法发展出功能性结节。在一些实施方式中，可以通过上调转运体来增加固氮酶活性，其增加了辅因子如硫的可用性。例如，可以增加硫转运体cysZ的表达或活性。

　　增加植物中氮固定的水平可以导致用于作物生产所需的化学肥料数量减少并减少温室气体排放量(例如，一氧化二氮)。

　　细菌群的产生

　　细菌的分离

　　可以通过从天然植物的表面或组织中提取微生物来获得可用于本文公开的方法和组合物中的微生物。可以通过研磨种子以分离微生物来获得微生物。可以通过在各种土壤样品中种植种子并从组织中回收微生物来获得微生物。此外，可以通过使用外源性微生物接种植物并确定哪些微生物出现在植物组织中来获得微生物。植物组织的非限制性实例可包括：种子，幼苗，叶，插条，植物，鳞茎或块茎。

　　获得微生物的方法可以通过从土壤中分离细菌。细菌可以从各种土壤类型中收集。在一些实例中，土壤的特征可以在于这样的性状，诸如高或低肥力，水分水平，矿物水平和各种耕作实践。例如，土壤可能涉及轮作，在连续的种植季节中，不同的农作物种植在同一土壤中。不同作物在同一土壤上的连续生长可以防止某些矿物质的过度消耗。可以从选定土壤中生长的植物中分离出细菌。可以在生长2-6周后收获幼苗植物。例如，在一轮收获中可以收集至少400个分离株。土壤和植物类型揭示了植物表型以及条件，这些条件允许某些表型的下游富集。

　　可以从植物组织中分离微生物以评估微生物性状。可以改变用于处理组织样品的参数以分离不同类型的关联微生物(associative microbe)，例如根际细菌，附生植物或内生菌。分离物可以在无氮培养基中培养，以富集进行氮固定的细菌。或者，微生物可以获自全球菌株库(global strain bank)。

　　进行植物中分析以评估微生物性状。在一些实施方式中，可以通过高通量处理DNA和RNA来处理植物组织以进行筛选。此外，非侵入性测量可用于评估植物特性，如定殖。可以逐个植物的基础获取野生微生物的测量值。还可以使用中等通量方法在田间获得对野生微生物的测量。测量可以随时间连续进行。可以使用模型植物系统，包括但不限于，狗尾草(Setaria)。

　　植物系统中的微生物可通过植物系统中微生物的转录谱来筛选。通过转录谱分析进行筛选的实例是使用方法：定量聚合酶链反应(qPCR)，用于转录本检测的分子条形码，下一代测序以及使用荧光标志物进行的微生物标记。可以测量影响因素以评估温室中的定殖，包括但不限于，微生物组，非生物因素，土壤状况，氧气，水分，温度，接种物状况和根部定位。如本文所述，可以通过使用IRMS或NanoSIMS测量15N气体/肥料(稀释)来评估细菌中的氮固定，NanoSIMS是高分辨率二次离子质谱(secondary ion mass spectrometry)。NanoSIMS技术是一种研究生物样品化学活性的方法。可以在细胞、亚细胞、分子和元素水平上研究驱动微生物代谢的氧化反应的还原催化作用。NanoSIMS可以提供大于0.1μm的高空间分辨率。NanoSIMS可以检测同位素示踪剂如13C、15N和18O的使用。因此，NanoSIMS可以用于细胞中的氮化学活性。

　　自动化温室可用于植物分析。响应微生物暴露的植物指标包括但不限于，生物质、叶绿体分析、CCD相机(camera)，体积断层摄影术测量。

　　富集微生物群体的一种方法是根据基因型。例如，使用靶向引物或特异性引物的聚合酶链反应(PCR)分析。针对nifH基因设计的引物可用于鉴定固氮生物，因为固氮生物在氮固定过程中表达nifH基因。也可以通过独立于单细胞培养的方法和趋化性指导的分离方法来富集微生物群体。或者，可以通过在选择培养基上培养微生物来进行微生物的靶向分离。可以通过生物信息学数据指导富集微生物群体所需性状的预先设计的方法，并在本文中进行描述。

　　微生物的驯化

　　分离自自然界的微生物可能经历驯化过程，其中微生物经转化形成为可遗传追踪且可鉴定的形式。驯化微生物的一种方法是将其工程改造具有抗生素抗性。工程改造抗生素抗性的过程可以通过确定野生型微生物菌株中抗生素敏感性开始。如果细菌对抗生素敏感，那么抗生素可以作为抗药性工程改造的良好候选物。随后，可以使用重组工程改造方法将抗生素抗性基因或可反选择的自杀载体纳入微生物的基因组中。可反选择的自杀载体可以由感兴趣的基因的缺失，可选择标志物和可反选择标志物sacB组成。反选择可用于将天然微生物DNA序列与抗生素抗性基因交换。中等通量方法可用于评估多个微生物，同时允许平行驯化。驯化的替代方法包括使用归巢核酸酶以防止自杀载体序列环出(loop out)或获得间插载体序列。

　　可以经由几种方法将DNA载体引入细菌，包括电穿孔和化学转化。可以使用标准的载体文库进行转化。基因编辑方法的实例是CRISPR，之前进行Cas9测试，以确保微生物中的Cas9活性。

　　重构过程可以包括将某些质粒瞬时转染到微生物中。然后可以从微生物中消除(cure)这些质粒以去除它们。已经开发出涉及化学和物理试剂的各种方法以除去质粒。用于消除质粒的方案通常包括将培养物暴露于某些化学试剂(如吖啶橙，吖啶黄和十二烷基硫酸钠)的亚抑制浓度下，或暴露于超适温度下，然后选择消除的衍生物。

　　在质粒稳定或难以确定特性丧失的情况下，可以使用消除剂处理细菌。这些消除剂包括化学和物理试剂，其中一些可以使DNA突变，特异地干扰其复制或影响细菌细胞的特定结构组分或酶。用于消除质粒的方案通常包括将培养物暴露于某些化学试剂(如吖啶橙，吖啶黄和十二烷基硫酸钠)的亚抑制浓度下，或暴露于超适温度下，然后选择固化的衍生物。DNA插入剂(如吖啶橙和溴化乙锭)是最常用的，因为发现它们对多种属中的质粒均有效。虽然所有这些试剂已被用于增强各种细菌较少衍生的质粒的回收，但是它们仅对某些质粒有效并且它们可能的应答是不可预测的。消除的效率也可以根据质粒和携带该质粒的特定细菌宿主的不同而有很大差异。在一些情况中，可以通过引入额外的、更容易消除的质粒来去除难于消除的质粒，所述质粒编码能够靶向并降解难于消除质粒的蛋白质或系统。例如，可以通过引入这样的质粒来消除难于消除的质粒，所述质粒编码针对难于消除质粒的CRIPSR系统。一旦细菌菌株已经消除，那么就可以对样品进行测序，以确保完全去除质粒序列。

　　微生物的非转基因工程改造

　　具有有利性状的微生物群体可以经由定向进化获得。定向进化是这样一种方法，其中模仿了自然选择过程以朝着用户定义的目标进化蛋白质或核酸。定向进化的一个实例是当将随机突变引入微生物群体时，选择具有最有利性状的微生物，并且使所选微生物的生长继续。生长促进根际细菌(PGPR)中最有利的性状可能是氮固定。基于每次迭代后的选择过程，定向进化的方法可以是迭代的和自适应的。

　　可以产生具有高氮固定能力的植物生长促进根际细菌(PGPR)。PGPR的进化可以经由引入遗传变异来进行。可以经由聚合酶链反应诱变，寡核苷酸定向诱变，饱和诱变，片段改组诱变，同源重组，CRISPR/Cas9系统，化学诱变及其组合来引入遗传变异。这些方法可以将随机突变引入微生物群体。例如，可以使用经由寡核苷酸定向诱变的合成DNA或RNA产生突变体。可以使用质粒中包含的工具生成突变体，然后将其固化。可以使用来自性状改善的其他物种的文库来鉴定感兴趣的基因，这些性状包括但不限于，PGPR特性改善，谷物定殖改善，氧敏感性增加，固氮能力增加和氨分泌增加。可以使用诸如Geneious或Platypus设计软件之类的软件基于这些文库设计属内基因。可以借助机器学习来设计变异。可以借助代谢模型来设计变异。可以使用la Platypus完成突变的自动化设计，并将指导Cas定向诱变的RNA。

　　属内基因可以转移到宿主微生物中。此外，报告物系统也可以转移到微生物。报道物系统表征启动子，确定转化成功，筛选突变体，并充当阴性筛选工具。

　　携带突变的微生物可以通过连续传代培养。微生物菌落包含微生物的单个变体。借助于自动菌落选择器和液体处理器来筛选微生物菌落。具有基因重复和增加拷贝数的突变体表达所需性状较高的基因型。

　　基于氮固定的植物生长促进微生物的选择

　　可以使用各种试验筛选微生物菌落以评估氮固定能力。测量氮固定的一种方法是通过单一发酵试验，其测量氮分泌。另一种方法是乙炔还原试验(ARA)，可随时间进行连续采样。ARA可以在微管试验的高通量板中进行。ARA可以使用活植物和植物组织进行。可以改变ARA试验中的培养基配方和培养基氧浓度。筛选微生物变体的另一种方法是使用生物传感器。NanoSIMS和拉曼光谱的使用可用于研究微生物的活性。在一些情况中，也可以使用生物反应器中的发酵方法培养和扩增细菌。生物反应器旨在改善细菌生长的稳健性并降低细菌对氧气的敏感性。基于中至高的TP板的微发酵罐用于评估氧气敏感性，营养需求，氮固定和氮分泌。细菌还可以与竞争性或有益微生物共培养以说明隐藏途径。流式细胞术可用于使用化学、比色或荧光指示剂筛选产生高水平氮的细菌。可以存在或不存在氮源的情况下培养细菌。例如，可以将细菌与谷氨酰胺、氨、尿素或硝酸盐一起培养。

　　微生物育种(breeding)

　　微生物育种是系统性识别和改善作物微生物组中物种的作用的方法。该方法包括三步：1)通过绘制植物-微生物相互作用并预测与特定表型关联的调控网络来选择候选物种；2)通过调控网络和基因簇的种内杂交对微生物表型进行实用且可预测的改善，和3)筛选和选择产生所需农作物表型的新微生物基因型。为了系统性评估菌株的改善，创建了一个模型，该模型将微生物群落的定殖动力学与关键物种的遗传活性联系起来。该模型用于预测遗传靶标育种并改善选择微生物组-编码的农艺相关性状的频率。参见，图2A，表示该过程的一个实施例的图像。具体地，图2A描述了根据实施方式的微生物育种的示意图。如图2A所示，作物微生物合理的改进可用于增加土壤的生物多样性，调谐关键物种的影响，和/或改变重要代谢途径的定时和表达。为此，发明人已经开发了微生物育种路线以鉴定和改善菌株在微生物组内的作用。该方法包括三步：1)通过绘制植物-微生物相互作用并预测与特定表型关联的调控网络来选择候选物种；2)通过基因调控网络和基因簇的基因组内杂交对微生物表型进行实用且可预测的改善，和3)筛选和选择产生所需农作物表型的新微生物基因型。为了系统性评估菌株的改善，发明人采用了这样的模型，该模型将微生物群落的定殖动力学与关键物种的遗传活性联系起来。该过程代表了用于育种和选择农艺学相关的微生物组编码的性状中改良的方法。

　　可以通过连续传代来生产细菌以改善植物性状(例如，氮固定)。除了鉴定能够赋予一种或多种植物一种或多种改良的性状的细菌和/或组合物外，还可通过选择具有受微生物菌群影响的特定改良性状的植物来完成该细菌的生产。生产细菌以改善植物性状的一种方法包括下述步骤：(a)由第一株植物的组织或土壤分离细菌；(b)将遗传变异引入一种或多种细菌以产生一种或多种变体细菌；(c)将多种植物暴露于变体细菌；(d)由多种植物中的一种的组织或土壤分离细菌，其中分离出细菌的植物相对于多种植物中的其他植物具有改良的性状；和(e)使用分离自具有改良的性状的植物的细菌(步骤(d))重复步骤(b)至(d)。步骤(b)至(d)可以重复任何次数(例如，一次，两次，三次，四次，五次，十次或更多)，直到植物中改良的性状达到所需水平。此外，多种植物可以是两种以上的植物，如10至20种植物，或20种或更多种，50种或更多种，100种或更多种，300种或更多种，500种或更多种或1000种或更多种植物。

　　除了获得具有改良的性状的植物之外，还获得了包含细菌的细菌群体，所述细菌包含引入一个或多个基因(例如，调节氮固定的基因)中的一个或多个遗传变异。通过重复上述步骤，可以获得这样的细菌群体，其包含与感兴趣的植物性状相关的群体最合适的成员。可以鉴定该群体中的细菌并确定其有益特性，如通过遗传和/或表型分析。步骤(a)中可能会对分离的细菌进行遗传分析。可以使用技术获得表型和/或基因型信息，所述技术包括：高通量筛选植物来源的化学成分，测序技术，包括遗传物质的高通量测序，差异显示技术(包括DDRT-PCR和DD-PCR)，核酸微阵列技术，RNA测序(全转录组短枪测序)和qRT-PCR(定量实时PCR)。所获得的信息可用于获取关于存在的细菌的种类和活性的群落概况信息，如系统发育分析或基于微阵列筛选编码rRNA操纵子组件或其他生物分类信息基因座的核酸。分类信息基因座的实例包括16S rRNA基因，23S rRNA基因，5S rRNA基因，5.8S rRNA基因，12S rRNA基因，18S rRNA基因，28S rRNA基因，gyrB基因，rpoB基因，fusA基因，recA基因，coxl基因，nifD基因。US20140155283中描述了确定群体中存在的分类单元的分类学概况的示例过程。细菌鉴定可包括表征一种或多种基因或一种或多种信号传导途径(如与氮固定途径相关的基因)的活性。细菌群体中也可能存在不同细菌物种之间的协同相互作用(其中两种组分由于其结合而使所需作用增加的程度超过累加量)。

　　遗传变异–基因组改变的位置和来源

　　遗传变异可以是选自下组的基因：nifA、nifL、ntrB、ntrC、glnA、glnB、glnK、draT、amtB、glnD、glnE、nifJ、nifH、nifD、nifK、nifY、nifE、nifN、nifU、nifS、nifV、nifW、nifZ、nifM、nifF、nifB、nifQ、bcsII、bcsIII、yjbE、fhaB、pehA、glgA、otsB、treZ和cysZ。遗传变异可以是编码具有选自下组的功能的蛋白质的基因中的变异：谷氨酰胺合成酶，谷氨酰胺酶，谷氨酰胺合成酶腺苷酰基转移酶，转录激活因子，抗转录激活因子，丙酮酸黄素氧还蛋白氧化还原酶，黄素氧还蛋白，NAD+-二氮还原酶aDP-D-核糖基转移酶，胞外多糖产生，丝状血球凝集素，糖原合酶，海藻糖合成或硫酸盐转运体。遗传变异可以是导致下述内容中一种或多种的突变：NifA谷氨酰胺酶，bcsII，bcsIII，yjbE，fhaB，pehA，otsB，treZ或CysZ的表达或活性增加；NifL，NtrB，谷氨酰胺合成酶，GlnB，GlnK，DraT，AmtB或glgA的表达或活性降低；GlnE去除腺苷酰基的活性降低；或GlnD去除尿苷酰基的活性降低。引入遗传变异可以包括在靶位点插入和/或缺失一个或多个核苷酸，如1、2、3、4、5、10、25、50、100、250、500或更多个核苷酸。引入本文所公开的方法的一种或多种细菌的遗传变异可以是敲除突变(例如，启动子的缺失，插入或缺失以产生提早终止密码子，整个基因的缺失)，或者可以是清除或消除蛋白质结构域的活性(例如，影响活性位点的点突变，或编码蛋白质产物相关部分的基因的部分的缺失)，或者可以是改变或消除靶基因的调控序列。也可以插入一个或多个调控序列，包括异源性调控序列和在与引入了遗传变异的细菌相对应的细菌物种或属的基因组内发现的调控序列。此外，可以基于细菌培养物中或植物组织内的基因表达水平来选择调控序列。遗传变异可以是特异性地引入靶位点的预定遗传变异。遗传变异可以是靶位点内的随机突变。遗传变异可以是一个或多个核苷酸的插入或缺失。在一些情况中，在将细菌暴露于植物用于评估性状改善之前，将多种不同的遗传变异(例如，2、3、4、5、10或更多种)引入一种或多种分离细菌中。多种遗传变异可以是上述类型中的任何一种，相同或不同类型以及任何组合。在一些情况中，依次引入多种不同的遗传变异，在第一分离步骤后引入第一遗传变异，在第二分离步骤后引入第二遗传变异等，以便在细菌中积累多种遗传变异，逐渐改善相关植物的性状。

　　

　　

　　

　　遗传变异–引入基因组改变的方法

　　通常，术语“遗传变异”指相对于参照多核苷酸(如参照基因组或其部分)或参照基因或其部分引入多核苷酸序列中的任何改变。遗传变异可以称之为“突变”，且包含遗传变异的序列或生物体可以称之为“遗传变体”或“突变体”。遗传变异可以具有多种作用，如增加或减少某些生物活性，包括基因表达、代谢和细胞信号传导。遗传变异可以特异性地引入靶位点，也随机引入。存在能够用于引入遗传变异的各种分子工具和方法。例如，可以通过以下引入遗传变异：聚合酶链反应诱变，寡核苷酸定向诱变，饱和诱变，片段改组诱变，同源重组，重组工程改造，λRed介导的重组，CRISPR/Cas9系统，化学诱变及其组合。引入遗传变异的化学方法包括，将DNA暴露于化学诱变剂，例如，甲磺酸乙酯(EMS)，甲磺酸甲酯(MMS)，N-亚硝基脲(ENU)，N-甲基-N-硝基-N'-亚硝基胍，4-硝基喹啉N-氧化物，硫酸二乙酯，苯并芘，环磷酰胺，博来霉素，三乙基三聚氰胺，丙烯酰胺单体，氮芥，长春新碱，二环氧烷烃(例如二环氧丁烷)，ICR-170，甲醛，盐酸甲基苄肼，环氧乙烷，二甲基亚硝胺，7,12二甲基苯并(a)蒽，苯丁酸氮芥，六甲基磷酰胺，亚砜等。辐射突变诱导剂包括，紫外线辐射，γ辐照，X射线和快速中子轰击。还可使用例如三甲基补骨脂素在紫外线光下将遗传变异引入核酸。随机或靶向插入移动DNA元件(例如，可转座元件)是用于产生遗传变异的另一合适方法。遗传变异可以在扩增期间引入无细胞体外系统中的核酸中，例如，使用聚合酶链反应(PCR)技术，诸如易错PCR。可以使用DNA改组技术(例如，外显子改组，结构域交换等)将遗传变异体外引入核酸中。由于细胞中DNA修复酶缺乏的结果，也可以将遗传变异引入核酸中，例如，在细胞中存在编码突变DNA修复酶的突变基因预期将会在细胞基因组中产生高频率的突变(即，大约1个突变/100个基因-1个突变/10,000个基因)。编码DNA修复酶的基因的实例包括但不限于，Mut H，Mut S，Mut L，和Mut U，和其他物种中的同源物(例如，MSH 1 6，PMS 1 2，MLH 1，GTBP，ERCC-1等)。用于引入遗传变异的各种方法的实例描述在例如，Stemple(2004)Nature 5:1-7；Chiang等(1993)PCR Methods Appl 2(3):210-217；Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10747-10751；和美国专利号6,033,861和6,773,900中提供。

　　引入微生物的遗传变异可分为转基因，顺基因(cisgenic)，基因组内，基因内，基因间，合成的，进化的，重排的或SNP。

　　可以将遗传变异引入微生物内的许多代谢途径中以引发上述性状的改善。代表性途径包括硫摄取途径，糖原生物合成，谷氨酰胺调节途径，钼摄取途径，氮固定途径，氨吸收，氨分泌或分泌，氮摄取，谷氨酰胺生物合成，厌氧氨氧化(annamox)，磷酸盐溶解，有机酸转运，有机酸生产，凝集素生产，活性氧自由基清除基因，吲哚乙酸生物合成，海藻糖生物合成，植物细胞壁降解酶或途径，根附着基因，胞外多糖分泌，谷氨酸盐/酯合酶途径，铁摄取途径，铁载体途径，几丁质酶途径，ACC脱氨酶，谷胱甘肽生物合成，磷信号转导基因，群体(quorum)猝灭途径，细胞色素途径，血红蛋白途径，细菌性血红蛋白样途径，小RNA rsmZ，根瘤菌毒素生物合成，lapA粘附蛋白，AHL群体感测途径，吩嗪生物合成，环脂肽生物合成和抗生素生产。

　　CRISPR/Cas9(规律成簇的间隔短回文重复)/CRISPR相关的(Cas)系统可用于引入所需突变。通过使用CRISPR RNA(crRNA)指导入侵的核酸沉默，CRISPR/Cas9为细菌和古细菌提供了针对病毒和质粒的适应性免疫力。Cas9蛋白(或其功能性等同物和/或变体，即Cas9样蛋白)天然包含DNA内切核酸酶活性，其取决于蛋白质与两个天然存在的或合成的RNA分子(称为crRNA和tracrRNA(也成为向导RNA)))之间的关联。在一些情况中，这两个分子共价连接形成单个分子(也称为单向导RNA(“sgRNA”)。因此，Cas9或Cas9样蛋白与靶向DNA的RNA结合(该术语涵盖了双分子向导RNA构型和单分子向导RNA构型)相关联，其激活Cas9或Cas9样蛋白并将蛋白质引导至靶核酸序列。如果Cas9或Cas9样蛋白保留其天然酶功能，那么它将切割靶DNA以产生双链断裂，从而导致基因组改变(即编辑：缺失，插入(当存在供体多核苷酸时)，置换等)，从而改变基因表达。Cas9的某些变体(其中变体包含在术语Cas9-样中)已经改变，以使它们的DNA切割活性降低(在一些情况中，它们切割目标DNA的单链而不是两条链，而在其他情况下，它们严重地导致没有DNA切割活性)。用于引入遗传变异的CRISPR系统的其他示例性描述可以在例如US8795965中找到。

　　作为一种循环扩增技术，聚合酶链反应(PCR)诱变使用诱变引物来引入所需的突变。通过变性、退火和延伸的循环进行PCR。通过PCR扩增后，可以通过以下步骤完成选择突变DNA和去除亲本质粒DNA：1)在PCR过程中用羟甲基化的-dCTP替换dCTP，然后用限制性酶消化，以仅除去非羟甲基化的亲本DNA；2)对抗生素抗性基因和研究的基因进行同时诱变，所述研究的基因将质粒改变为不同的抗生素抗性，新的抗生素抗性有助于其后选择所需的突变；3)引入所需的突变后，通过限制性酶Dpn1消化亲本甲基化模板DNA，所述限制性酶Dpn1仅切割甲基化DNA，由此回收诱变的未甲基化链；或4)在额外的连接反应中使突变的PCR产物环化，以增加突变DNA的转化效率。示例性方法的其他说明述于例如，US7132265，US6713285，US6673610，US6391548，US5789166，US5780270，US5354670，US5071743和US20100267147。

　　寡核苷酸定向诱变，也称为定点诱变，通常利用合成DNA引物。该合成引物包含所需的突变并且与突变位点周围的模板DNA互补，因此其可以与感兴趣的基因中的DNA杂交。突变可以是单碱基变化(点突变)，多碱基变化，缺失或插入，或这些的组合。然后，使用DNA聚合酶延伸单链引物，其复制基因的其余部分。如此复制的基因包含突变位点，然后可以将其作为载体引入宿主细胞并克隆。最后，可以通过DNA测序以检查它们是否包含所需的突变来选择突变体。

　　可以使用易错PCR引入遗传变异。在该技术中，在缺乏序列复制的保真度的条件下，使用DNA聚合酶扩增感兴趣的基因。结果是扩增产物在序列中包含至少一个错误。当与模板分子相比，在扩增基因并且反应的所得产物在序列上包含一个或多个改变时，诱变了所得产物，与模板相比。引入随机突变的另一种方法是将细胞暴露于化学诱变剂，例如亚硝基胍或甲磺酸乙酯(Nestmann,Mutat Res 1975年6月；28(3):323-30)，然后由宿主分离出含有该基因的载体。

　　饱和诱变是随机诱变的另一种形式，其中人们试图在基因的特定位点或狭窄区域产生所有或几乎所有可能的突变。在一般意义上，饱和诱变包括诱变处理确定的待诱变的多核苷酸序列(其中待诱变的序列长度为例如15-100,000个碱基)中的整套诱变盒(其中各盒的长度为例如1-500个碱基)。因此，将一组突变(例如，1至100个突变)引入待诱变的各盒中。在应用一轮饱和诱变期间，待引入一个盒的突变的分组可以与待引入第二盒的突变的第二分组不同或相同。这类分组的实例为特定密码子的缺失、添加、分组和特定核苷酸盒的分组。

　　片段改组诱变，也称为DNA改组，是一种快速传播有益突变的方法。在改组过程的一个实例中，DNA酶用于将一组亲本基因片段化成长度为例如约50-100bp的片段。然后进行没有引物的聚合酶链反应(PCR)——具有足够重叠的同源序列的DNA片段将彼此退火，然后通过DNA聚合酶进行延伸。在某些DNA分子达到亲本基因的大小后，允许进行几轮这种PCR延伸。然后可以使用另一PCR扩增这些基因，这次添加了设计为与链末端互补的引物。引物可在其5'末端具有其他序列，如连接到克隆载体中所需的限制性酶识别位点的序列。US20050266541中提供了改组技术的其他实例。

　　同源重组诱变涉及外源性DNA片段和靶向多核苷酸序列之间的重组。双链断裂发生后，断裂的5'末端附近的DNA区段在称为切除的过程中被切除。在随后的链入侵步骤中，断裂的DNA分子的突出3'端随后“侵入”未断裂的相似或相同的DNA分子。该方法可用于缺失基因，去除外显子，添加基因和引入点突变。同源重组诱变可以是永久的或有条件的。通常，还提供重组模板。重组模板可以是另一载体的组分，包含在单独的载体中，或以单独的多核苷酸提供。在一些实施方式中，重组模板被设计成用作同源重组中的模板，如在被位点特异性核酸酶切割或缺刻的靶序列之内或附近。模板多核苷酸可以为任何合适的长度，如长度为约或大于约10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000或更多个核苷酸。在一些实施方式中，模板多核苷酸与包含靶序列的多核苷酸的部分互补。当最佳比对时，模板多核苷酸可能与靶序列的一个或多个核苷酸重叠(例如，约或大于约1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70，80、90、100或更多个核苷酸)。在一些实施方式中，当模板序列和包含靶序列的多核苷酸最佳比对时，模板多核苷酸的最近核苷酸距离靶序列约1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300内，400、500、1000、5000、10000或更多个核苷酸内。能够用于同源重组方法的定点核酸酶的非限制性实例包括锌指核酸酶，CRISPR核酸酶，TALE核酸酶和大范围核酸酶。对于这类核酸酶用途的进一步描述，参见例如，US8795965和US20140301990。

　　主要产生点突变和短缺失，插入，转化和/或转变的诱变剂(包括化学诱变剂或辐射)可用于产生遗传变异。诱变剂包括但不限于，甲磺酸乙酯，甲磺酸甲酯，N-乙基-N-硝基脲，三乙基三聚氰胺，N-甲基-N-亚硝基脲，甲基苄肼，苯丁酸氮芥，环磷酰胺，硫酸二乙酯，丙烯酰胺单体，美法仑，氮芥，长春新碱，二甲基亚硝胺，N-甲基-N'-硝基-亚硝基胍，亚硝基胍，2-氨基嘌呤，7,12二甲基-苯并(a)蒽，环氧乙烷，六甲基磷酰胺，亚砜，二环氧烷烃(二环氧辛烷，二环氧丁烷等)，2-甲氧基-6-氯-9[3-(乙基-2-氯-乙基)氨基丙基氨基]吖啶二氢氯化物和甲醛。

　　引入遗传变异可能是一个不完整的过程，因此，经过处理的细菌群体中的某些细菌会携带所需的突变，而其他细菌则不会。在一些情况中，期望施加选择压力以富集携带期望遗传变异的细菌。通常，选择成功的遗传变异涉及选择遗传变异赋予或废除的某些功能或针对其选择，诸如在插入抗生素抗性基因或废除能够将非致死化合物转化为致死代谢物的代谢活性的情况下。也可能基于多核苷酸序列本身施加选择压力，使得仅需要引入所需遗传变异(例如，也不需要选择标记物)。在这种情况下，选择压力可以包括切割缺乏引入靶位点的遗传变异的基因组，使得选择有效地针对寻求引入遗传变异的参照序列。通常，切割发生在靶位点的100个核苷酸内(例如，距靶位点75、50、25、10或更少个核苷酸内，包括在靶位点处或靶位内的切割)。切割可以由选自下组的位点特异性核酸酶指导：锌指核酸酶，CRISPR核酸酶，TALE核酸酶(TALEN)或大范围核酸酶。除了没有提供用于同源重组的模板之外，这类过程类似于用于增强靶位点处同源重组的过程。因此，缺乏所需遗传变异的细菌更容易发生切割，如果不进行修复，那么会导致细胞死亡。然后可以分离存活于选择的细菌，用于暴露于植物以评估改良性状的赋予。

　　CRISPR核酸酶可以用作位点特异性核酸酶以将切割引导至靶位点。可以通过使用Cas9杀死未突变的细胞获得对突变的微生物改善的选择。然后用突变的微生物接种植物以重新确认共生并产生进化压力以选择有效的共生体。然后可以从植物组织中重新分离出微生物。用于针对非变体的选择的CRISPR核酸酶系统可以采用与上述关于引入遗传变异的那些相似的元件，不同之处在于不提供用于同源重组的模板。因此，针对靶位点的切割增加了受影响细胞的死亡。

　　存在用于在靶位点特异性诱导切割的其他选择，如锌指核酸酶，TALE核酸酶(TALEN)系统和大范围核酸酶。锌指核酸酶(ZFN)是通过将锌指DNA结合域与DNA切割域融合而产生的人工DNA内切核酸酶。ZFN可以经工程改造以靶向所需的DNA序列，并且这可以使锌指核酸酶切割独特的靶序列。当引入细胞中时，ZFN可用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)是通过将TAL(转录激活子样)效应物DNA结合结构域与DNA切割结构域融合来产生的人工DNA内切核酸酶。可以快速工程改造TALENS以结合基本上任何所需DNA序列，并且当引入细胞中时，TALENS可用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。大范围核酸酶(归巢内切核酸酶)是通过大识别位点(12至40个碱基对的双链DNA序列)表征的内切脱氧核糖核酸酶。大范围核酸酶可用于以高度靶向的方式替换、消除或修饰序列。通过经由蛋白质工程改造修饰其识别序列，可以改变靶向的序列。大范围核酸酶可以用于修饰所有基因组类型，无论是细菌、植物或动物，并且通常分为四个家族：LAGLIDADG家族(SEQ ID NO:1)，GIY-YIG家族，His-Cyst盒家族和HNH家族。示例性寻靶核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。

　　遗传变异–鉴定的方法

　　本公开的微生物可以通过已经引入所述微生物中的一种或多种遗传修饰或改变来鉴定。可以鉴定所述遗传修饰或改变的一种方法是通过参考SEQ ID NO，其包含足以鉴定遗传修饰或改变的微生物基因组序列的部分。

　　此外，在微生物没有引入其基因组中的遗传修饰或改变(例如，野生型，WT)的情况下，本公开可以利用16S核酸序列来鉴定所述微生物。16S核酸序列是“分子标志物”或“遗传标志物”的实例，其指用于可视化核酸序列特征中差异的方法中使用的指示物。其他这类指示物的实例是：限制性片段长度多态性(RFLP)标志物，扩增片段长度多态性(AFLP)标志物，单核苷酸多态性(SNP)，插入突变，微卫星标志物(SSR)，序列表征的扩增区(SCAR)，切割的扩增多态性序列(CAPS)标志物或同工酶标志物或本文所述定义了特点遗传和染色体位置的标志物的组合。标志物还包括编码16S或18S rRNA的多核苷酸序列和内部转录的间隔子(ITS)序列，它们是在小亚基和大亚基rRNA基因之间发现的序列，已经证明了他们在彼此相比时在阐明关系或区分中特别有用。此外，本公开利用感兴趣的基因中存在的独特序列(例如，nif H、D、K、L、A，glnE，amtB等)以鉴定本文所公开的微生物。

　　主要rRNA亚基16S的一级结构包含保守区、可变区和高变区的特定组合，它们以不同的速率进化并能够解析非常古老的世系(例如域)和更现代的世系(例如属)。16S亚基的二级结构包括大约50个螺旋，其导致大约67％的残基的碱基配对。这些高度保守的二级结构特征在功能上具有重要意义，并且可用于确保多个序列比对和系统发育分析中的位置同源性。在之前的几十年中，16S rRNA基因已经成为最多测序的分类标志物并且是细菌和古细菌当前系统分类的基础(Yarza等2014.Nature Rev.Micro.12:635-45)。

　　遗传变异–检测方法：引物、探针和试验

　　本公开教导了可用于检测本文所教导的微生物的引物、探针和试验。在一些方面中，本公开提供了用于检测WT亲本菌株的方法。在其他方面中，本公开提供了用于检测衍生自WT菌株的非属间工程改造的微生物的方法。在方面中，本公开提供了鉴定微生物中非属间遗传改变的方法。

　　在方面中，本公开的基因组工程改造方法导致在衍生的非属间微生物中产生非天然核苷酸“连接”序列。这些非天然存在的核苷酸连接可以用作诊断类型，其指示本文所教导的微生物中存在特定遗传改变。

　　本技术能够经由利用专门的定量PCR方法，包括独特设计的引物和探针，来检测这些非天然存在的核苷酸连接。在一些方面中本公开的探针与非天然存在的核苷酸连接序列结合。在一些方面中，利用传统PCR。在其他方面中，利用实时PCR。在一些方面中，利用定量PCR(qPCR)。

　　因此，本公开内容可以涵盖利用两种常规方法实时检测PCR产物：(1)插入任何双链DNA的非特异性荧光染料，和(2)由使用荧光报告物标记的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，其仅在探针与其互补序列杂交后才允许检测。在一些方面中，仅有非天然存在的核苷酸连接将通过教导的引物扩增，并且因此可以经由非特异性染料或经由利用特异性杂交探针进行检测。在其他方面中，选择本发明的引物，以使所述引物在连接序列的任一侧，使得如果发生扩增反应，那么存在所述连接序列。

　　本公开的方面涉及非天然存在的核苷酸连接序列分子本身，以及能够在中等至严格杂交条件下结合至所述非天然存在的核苷酸连接序列的其他核苷酸分子。在一些方面中，在中等至严格杂交条件下能够结合所述非天然存在的核苷酸连接序列的核苷酸分子被称为“核苷酸探针”。

　　在方面中，基因组DNA可从样品中提取，并用于通过使用qPCR来定量本发明的微生物的存在。qPCR反应中利用的引物可以是通过Primer Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计的引物，以扩增野生型基因组的独特区域或工程改造的非属间突变菌株的独特区域。进行qPCR反应可以使用SYBR GreenERqPCR SuperMix通用(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)P/N 11762100)试剂盒，仅使用正向和反向扩增引物；或者，κ探针力试剂盒(卡帕生物系统公司(Kapa Biosystems)P/NKK4301)可以联用扩增引物和TaqMan探针，其在包含5'端的FAM染料标记，内部的ZEN淬灭剂，和3'端的小沟结合剂和荧光淬灭剂(整合DNA技术公司(Integrated DNATechnologies))。

　　可以使用由靶基因组中已知数量的gDNA生成的标准曲线来测量qPCR反应效率。可以使用组织重量和提取体积将数据标准化为基因组拷贝/g鲜重。

　　定量聚合酶链反应(qPCR)是一种实时定量一种或多种核酸序列扩增的方法。通过对扩增感兴趣的核酸和合适的对照核酸序列进行比较PCR试验的实时定量允许确定通过PCR扩增步骤产生的核酸的数量，这可以用作校准标准品。

　　TaqMan探针通常用于需要更高特异性来定量靶核酸序列的qPCR试验中。TaqMan探针包含寡核苷酸探针，并具有附着于5'端的荧光团和附着于该探针3'端的淬灭剂。当TaqMan探针保持原样且探针的5'和3'末端彼此紧密接触时，淬灭剂防止来自荧光团的荧光信号转导转送。设计TaqMan探针以在通过特定引物组扩增的核酸区域内退火。因为Taq聚合酶延伸引物并合成新生链，所以Taq聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性降解退火至模板的探针。该探针降解释放出荧光团，从而破坏了与淬灭剂的紧密邻近并允许荧光团的荧光。qPCR试验中检测到的荧光与释放的荧光团和反应中存在的DNA模板的量成正比。

　　qPCR的特点允许业者无需进行繁琐的凝胶电泳制备后扩增步骤，而这通常是观察传统PCR试验扩增产物所必需的。与传统PCR相比，qPCR的优点是可观的，包括提高速度，易于使用，可重复性和定量能力。

　　性状的改善

　　可以采用本公开的方法以引入或改善多种所需要的性状中的一种或多种。待改善的性状可以是细菌的性状，或者可以对细菌进行修饰以改善相关植物的性状。可引入或改善的性状的实例包括：根生物量，根长度，高度，枝条长度，叶数，水分利用效率，总生物量，产量，果实大小，籽粒大小，光合作用率，耐旱性，耐热性，耐盐性，对线虫胁迫的抗性，对真菌病原体的抗性，对细菌病原体的抗性，对病毒病原体的抗性，代谢物的水平和蛋白质组表达。所需要的性状，包括高度，总生物量，根和/或枝条生物量，种子发芽，幼苗存活，光合效率，蒸腾速率，种子/果实数量或质量，植物籽粒或果实产量，叶绿素含量，光合速率，根长度或其任意组合，可用于测量生长，并与相同条件下生长的参照农业植物(例如，不具有改良的性状的植物)的生长速率进行比较。

　　可以改善的性状的其他实例包括细菌附着并定殖于植物的能力。例如，可以对细菌进行修饰以更好地附着于植物的根部，或者产生或分泌有益于定殖的化合物。

　　如本文所述，待引入或改善的优选性状是氮固定。在一些情况中，本文所述方法产生的植物表现出的性状差异比相同条件下土壤中生长的参照农业植物大至少约5％，例如，至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％或至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大。在其他实例中，本文所述方法产生的植物表现出的性状差异比相似条件下土壤中生长的参照农业植物大至少约5％，例如，至少约5％、至少约8％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约75％、至少约80％、至少约80％、至少约90％或至少100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％或更大。

　　可在包括施用一种或多种生物或非生物应激源(stressor)的条件下评估待改良的性状。应激源的实例包括非生物胁迫(如热胁迫，盐胁迫，干旱胁迫，冷胁迫和低营养胁迫)和生物胁迫(如线虫胁迫，昆虫食草胁迫，真菌病原体胁迫，细菌病原体胁迫和病毒病原体胁迫)。

　　通过本公开的方法和组合物改善的性状可以是氮固定，包括在先前不能进行氮固定的植物中。在一些情况中，根据本文所述方法分离的细菌产生1％或更多(例如，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％或更多)的植物氮，这可能表示相较于分离自引入任何遗传变异之前的第一植物的细菌，氮固定能力增加了至少2倍(例如，3倍，4倍，5倍，6倍，7倍，8倍，9倍，10倍，20倍，50倍，100倍，1000倍或更多倍)。在一些情况中，细菌产生5％或更多的植物氮。在重复引入遗传变异、暴露于多种植物和由具有改善的性状的植物中分离细菌的步骤一次或多次(例如：1、2、3、4、5、10、15、25或更多次)后，可以实现所需水平的氮固定。在一些情况中，在补充有谷氨酰胺、氨或其他化学氮源的肥料存在的情况下，实现了氮固定水平提高。用于评估氮固定程度的方法是已知的，其实例在本文中描述。

　　微生物育种是系统性识别和改善作物微生物组中种类的作用的方法。该方法包括三步：1)通过绘制植物-微生物相互作用并预测与特定表型关联的调控网络来选择候选物物种；2)通过调控网络和基因簇的种内杂交对微生物表型进行实用且可预测的改善，和3)筛选和选择产生所需农作物表型的新微生物基因型。为了系统性评估菌株的改善，创建了一个模型，该模型将微生物群落的定殖动力学与关键物种的遗传活性联系起来。该模型用于预测遗传靶标育种并改善选择微生物组(编码的农艺相关性状)的频率。

　　测量与农业相关的田间环境中递送的氮

　　在田间，可以通过定殖功能乘以活性来确定所递送的氮的量。

　　

　　上述等式需要(1)每单位植物组织的平均定殖，和(2)固定的氮的量或由各微生物细胞分泌的氨的量的活性。为了转化为氮磅/英亩，随着时间的推移跟踪玉米生长生理过程，例如，整个成熟阶段的植物和相关根系的大小。

　　递送到每英亩季节的氮磅可以通过以下公式计算：

　　递送的氮＝∫植物组织(t)x定殖(t)x活性(t)dt

　　植物组织(t)是玉米植物组织在生长时间(t)内的鲜重。在名为《根、生长和养分摄取》(Roots,Growth and Nutrient Uptake)(Mengel.Dept.of Agronomy出版号AGRY-95-08(Rev.五月-95.第1-8页))的出版物中详细描述了合理进行计算的值。

　　定殖(t)是在生长季节中的任何特定时间t存在于植物组织中(每克植物组织鲜重)的感兴趣的微生物的量。在只有单个时间点的情况下，将单个时间点标准化至整个季节的最高定殖率，并相应地调整其余时间点的定殖率。

　　活性(t)是在生长季节的任何特定时间t，各单位时间通过感兴趣的微生物固定N的速率。在本文公开的实施方式中，通过在5mM谷氨酰胺存在下的ARA培养基中的体外乙炔还原试验(ARA)或在5mM铵离子存在下的ARA培养基中的铵分泌试验来估计该活性速率。

　　然后，通过数值积分上述函数来计算递送氮的量。在设置的时间点离散测量上述变量的值的情况下，可以通过进行线性插值来估算这些时间点之间的值。

　　氮固定

　　本文描述了增加植物中氮固定的方法，其包括将植物暴露于细菌，所述细菌包含一种或多种遗传变异，所述遗传变异被引入一个或多个调控氮固定的基因中，其中细菌在植物中产生1％或更多的氮(例如2％，5％，10％或更多)，这可以表示相较于不存在细菌的植物至少2倍的氮固定能力。在补充有谷氨酰胺、尿素、硝酸盐或氨的肥料存在的情况下，细菌可能产生氮。遗传变异可以是本文所述的任何遗传变异，包括以上提供的实例，以任何数目和任何组合。遗传变异可以引入选自下组的基因中：nifA，nifL，ntrB，ntrC，谷氨酰胺合成酶，glnA，glnB，glnK，draT，amtB，谷氨酰胺酶，glnD，glnE，nifJ，nifH，nifD，nifK，nifY，nifE，nifN，nifU，nifS，nifV，nifW，nifZ，nifM，nifF，nifB，和nifQ。遗传变异可以是导致下述内容中一种或多种的突变：nifA或谷氨酰胺酶的表达或活性增加；nifL，ntrB，谷氨酰胺合成酶，glnB，glnK，draT，amtB的表达或活性降低；GlnE去除腺苷酰基的活性降低；或GlnD去除尿苷酰基的活性降低。引入到本文所公开的方法的一种或多种细菌的遗传变异可以是敲除突变，或者其可以消除靶基因的调控序列，或者其可以包括异源调控序列的插入，例如，插入在相同细菌种或属的基因组内发现的调控序列。可以基于细菌培养物中或植物组织内基因的表达水平来选择调控序列。遗传变异可以通过化学诱变产生。步骤(c)中生长的植物可以暴露于生物或非生物应激源。

　　本文所述植物中出现的氮固定的量可以几种方式测量，例如，通过乙炔还原(AR)试验。乙炔还原试验可以在体外或体内进行。特定细菌向植物提供固定的氮的证据可以包括：1)接种后，植物总氮显著增加，优选植物中氮浓度伴随增加；2)接种后，氮缺乏症状在氮限制条件下缓解(这应包括增加干物质)；3)通过使用15N方法(这可以是同位素稀释实验，15N2还原试验或15N自然丰度试验)记录了N2固定；4)固定的氮纳入了植物蛋白或代谢物中；和5)在未接种的植物或接种了接种菌株突变体的植物中都看不到所有这些作用。

　　野生型氮固定调控级联可以表示为数字逻辑回路，其中输入O2和NH4+穿过NOR门，其输出进入AND门以及ATP。在一些实施方式中，本文所公开的方法在调控级联中的多个点破坏了NH4+对该回路的影响，从而使得即使在施肥的田地中，微生物也可以产生氮。然而，本文所公开的方法还设想了改变ATP或O2对回路的影响，或使用细胞中的其他调控级联取代回路，或改变除了氮固定之外的遗传回路。可以在异源调控系统的控制下重新工程改造基因簇以生成功能性产物。通过消除基因簇编码序列之内和之外的天然调控元件并使用其他调控系统取代它们，可以控制和/或移动复杂遗传操纵子和其他基因簇的功能性产物至异源性细胞，包括除了衍生天然基因的物种以外的其他物种。重新工程改造后，合成基因簇可以通过遗传回路或其他可诱导的调控系统进行控制，从而根据需要控制产物的表达。可以设计表达盒作为逻辑门，脉冲发生器，振荡器，开关或存储设备。可以将控制表达盒连接至启动子，使得表达盒作为环境传感器，如氧气，温度，接触，渗透压，膜应力或氧化还原传感器。

　　例如，可以从nif基因簇中除去nifL，nifA，nifT和nifX基因。可以通过使编码各氨基酸序列的DNA密码子随机化来设计合成基因。进行密码子选择，指定密码子使用与天然基因中的密码子使用尽可能不同。扫描建议的序列中是否有任何不希望的特征，如限制性酶识别位点，转座子识别位点，重复序列，sigma 54和sigma 70启动子，隐性核糖体结合位点和rho独立型终止子。选择合成核糖体结合位点以匹配每个对应的天然核糖体结合位点的强度，如通过构建荧光报告物质粒，其中将基因的起始密码子(从-60到+90)周围的150bp与荧光基因融合。该嵌合体可以在Ptac启动子的控制下表达，并经由流式细胞术测量荧光。为了生成合成核糖体结合位点，生成了使用150bp(-60至+90)合成表达盒的报告物质粒文库。简言之，合成表达盒可以由随机DNA间隔子，编码RBS文库的简并序列和针对各合成基因的编码序列组成。筛选多个克隆以鉴定与天然核糖体结合位点最匹配的合成核糖体结合位点。因此，构建由与天然操纵子相同的基因组成的合成操纵子，并测试功能性互补。在US20140329326中提供了合成操纵子的进一步示例性描述。

　　细菌物种

　　能够用于本文所公开的方法和组合物中的微生物可以获自任何来源。在一些情况中，微生物可能是细菌，古细菌，原生动物或真菌。本公开的微生物可以是固氮微生物，例如固氮细菌，固氮古细菌，固氮真菌，固氮酵母或固氮原生动物。能够用于本文所公开的方法和组合物中的微生物可以是形成孢子的微生物，例如形成孢子的细菌。在一些情况中，能够用于本文所公开的方法和组合物中中的细菌可以是革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。在一些情况中，细菌可以是厚壁菌门的内生孢子形成细菌。在一些情况中，细菌可能是固氮生物(diazatroph)。在一些情况中，细菌可能不是固氮生物。

　　变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)

　　变栖克雷伯氏菌是自由存活的氮固定土壤细菌，并且已从香蕉、水稻、甘蔗和玉米根际中分离。137菌株最初分离自土壤样品，所述土壤样品收集自圣查尔斯县密苏里州的田地的玉米根的根际。也在加利福尼亚州和波多黎各的田地中发现了相同的菌株，这已通过137菌株16S rRNA与来自加利福尼亚州和波多黎各土壤中天然存在的变栖克雷伯氏菌(K.variicola)生物体的16S rRNA的比对得到证实。尚不知晓变栖克雷伯氏菌表现出任何植物害虫特征，虽然一个研究小组报告了变栖克雷伯氏菌在中国可以引起香蕉软腐病1。在变栖克雷伯氏菌的137菌株的基因组中没有发现毒力因子。

　　蔗糖小迫氏菌(Kosakonia sacchari)

　　蔗糖小迫氏菌是新的小迫氏菌属(genus Kosakonia)内一个新的物种，其包括在肠杆菌属2(genus Enterobacter 2)。蔗糖小迫氏菌自由存活的细菌，因其与甘蔗(Saccharum officinarum L.)的结合而得名。蔗糖小迫氏菌为革兰氏阴性，好氧，无孢子形成，能动杆(motile rod)，并能够定殖和固定与甘蔗植物相关联的氮，从而促进植物生长。菌株CI006由采集自加利福尼亚州圣华钦县的土壤样品中分离。尚不知晓蔗糖小迫氏菌表现出任何植物害虫特征。

　　上述两种野生型微生物(菌株137和CI006)的相同性通过16S rRNA基因的序列分析(用于原核种系发育研究的已建立的方法)证实。这两种菌株的生物保藏信息包括在本申请中。

　　本公开的方法和组合物可以与古细菌，例如，嗜热自养甲烷杆菌(Methanothermobacter thermoautotrophicus)一起使用。

　　在某些情况中，可用的细菌包括但不限于：放射土壤杆菌(Agrobacteriumradiobacter)，酸热芽孢杆菌(Bacillus acidocaldarius)，酸杆菌芽孢杆菌(Bacillusacidoterrestris)，农田芽孢杆菌(Bacillus agri)，艾寨外芽孢杆菌(Bacillusaizawai)，阿博乳酸芽孢杆菌(Bacillus albolactis)，嗜碱芽孢杆菌(Bacillusalcalophilus)，蜂房芽孢杆菌(Bacillus alvei)，氨糖性芽孢杆菌(Bacillusaminoglucosidicus)，氨沃芽孢杆菌(Bacillus aminovorans)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamylolyticus)(也称之为解淀粉类芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus))，淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，解硫胺素芽胞杆菌(Bacillusaneurinolyticus)，萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus)，固氮芽孢杆菌(Bacillusazotoformans)，栗褐芽孢杆菌(Bacillus badius)，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)(同义词：内生芽孢杆菌(Bacillus endorhythmos)，水母芽孢杆菌(Bacillus medusa))，几丁质芽孢杆菌(Bacillus chitinosporus)，圆形芽孢杆菌(Bacillus circulans)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，生寄生芽孢杆菌(Bacillus endoparasiticus)，苛求芽胞杆菌(Bacillus fastidiosus)，坚定芽孢杆菌(Bacillus firmus)，库尔斯塔克芽孢杆菌(Bacillus kurstaki)，乳酸杆菌芽孢杆菌(Bacillus lacticola)，乳毒病芽孢杆菌(Bacillus lactimorbus)，乳酸杆菌芽孢杆菌(Bacillus lactis)，侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)(也称之侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus))，月桂芽孢杆菌(Bacillus lautus)，慢杆菌芽孢杆菌(Bacillus lentimorbus)，迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，摩洛哥芽孢杆菌(Bacillus maroccanus)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，美添芽孢杆菌(Bacillusmetiens)，蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)，纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，杀线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocida)，黑生芽孢杆菌(Bacillus nigrificans)，龙葵芽孢杆菌(Bacillus nigrum)，泛酸芽孢杆菌(Bacillus pantothenticus)，金龟子芽孢杆菌(Bacillus popillae)，冷解糖芽孢杆菌(Bacillus psychrosaccharolyticus)，短小芽胞杆菌(Bacillus pumilus)，暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)，球形芽孢杆菌(Bacillus sphaericus)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，单鞭毛芽孢杆菌(Bacillusuniflagellatus)，日本短根缓生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)，侧孢短芽孢杆菌((原侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)侧孢芽胞杆菌(Bacillus laterosporus))，沙不丝色素细菌(Chromobacterium subtsugae)，代尔夫特食酸菌(Delftia acidovorans)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，抗生素溶菌杆菌(Lysobacter antibioticus)，酶基因溶杆菌(Lysobacter enzymogenes)，蜂房芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)，多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，流行类芽孢杆菌(Paenibacillus popilliae(原流行芽孢杆菌)，成团泛生菌(Pantoea agglomerans)，穿刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)(原穿刺芽孢杆菌)，尤氏巴斯德氏芽菌(Pasteuria usgae)，胡萝卜杆菌假单胞菌(Pectobacterium carotovorum(之前称之为胡萝卜欧文氏杆菌(Erwinia carotovora))，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，金黄色假单胞菌(Pseudomonasaureofaciens)，洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia(之前称之为洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia))，绿脓假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，矛盾假单胞菌(Pseudomonas proradix)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)，嗜虫沙雷氏菌(Serratiaentomophila)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，哥伦比亚链霉菌(Streptomycescolombiensis)，鲜黄链霉菌(Streptomyces galbus)，戈氏链霉菌(Streptomycesgoshikiensis)，灰链霉菌(Streptomyces griseoviridis)，淡紫色链霉菌(Streptomyceslavendulae)，绿链霉菌(Streptomyces prasinus)，沙瑞特链霉菌(Streptomycessaraceticus)，委内瑞斯链霉菌(Streptomyces venezuelae)，野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)，发光异短杆菌(Xenorhabdus luminescens)，嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)，球状红球菌(Rhodococcus globerulus)AQ719(NRRL登录号B-21663)芽孢杆菌种(Bacillus sp.)AQ175(ATCC登录号55608)，芽孢杆菌种AQ 177(ATCC登录号55609)，芽孢杆菌种AQ178(ATCC登录号53522)和链霉菌种(Streptomyces sp.)菌株NRRL登录号B-30145。在某些情况中，细菌可以是圆褐固氮菌(Azotobacterchroococcum))，巴克甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)，肺炎克雷伯氏菌(Klesiella pneumoniae)，棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)，球形红细菌(Rhodobacter spharoides)，荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)，沼泽红细菌(Rhodobcter palustris)，深红红螺菌(Rhodosporillum rubrum)，豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)或菜豆根瘤菌(Rhizobium etli)。

　　在一些情况中，细菌可以是梭菌(Clostridium)的物种，例如，巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)。

　　在一些情况中，与本公开的方法和组合物一起使用的细菌可以是蓝细菌(cyanobacteria)。蓝细菌属的实例包括：鱼腥藻(Anabaena)(例如，鱼腥藻种(Anagaenasp.)PCC7120)，念珠藻(Nostoc)(例如，点形念珠藻(Nostoc punctiforme))或集胞藻(Synechocystis)(例如集胞藻种(Synechocystis sp.)PCC6803)。

　　在一些情况中，与本公开的方法和组合物一起使用的细菌可以属于叶绿藻门(phylum Chlorobi)，例如，绿硫细菌(Chlorobium tepidum)。

　　在一些情况中，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可以包含与已知NifH基因同源的基因。已知NifH基因的序列可以在例如，Zehr实验室NifH数据库(https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/，2014年4月4日)，或Buckley实验室NifH数据库(http://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm，和Gaby,JohnChristian,和Daniel H.Buckley."综合比对的nifH基因数据库：用于固氮细菌研究的多功能工具(A comprehensive aligned nifH gene database:a multipurpose tool forstudies of nitrogen-fixing bacteria.)"Database 2014(2014):bau001.)。在一些情况中，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可包含这样的序列，所述序列编码与来自Zehr实验室NifH数据库(https://wwwzehr.pmc.ucsc.edu/nifH_Database_Public/,2014年4月4日)的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或超过99％序列相同性的多肽。在一些情况中，与本公开的方法和组合物一起使用的微生物可包含这样的序列，所述序列编码与来自Buckley实验室NifH数据库(http://www.css.cornell.edu/faculty/buckley/nifh.htm，和Gaby,John Christian,和DanielH.Buckley."综合比对的nifH基因数据库：用于固氮细菌研究的多功能工具"Database2014(2014):bau001.)的序列具有至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、96％、98％、99％或超过99％序列相同性的多肽。

　　可用于本文公开方法和组合物中的微生物可以这样获得，通过从天然植物的表面或组织中提取微生物；研磨种子以分离微生物；在各种土壤样品中种植种子并从组织中回收微生物；或用外源性微生物接种植物并确定哪些微生物出现在植物组织中。植物组织的非限制性实例包括：种子，幼苗，叶，插条，植物，鳞茎或块茎。在一些情况中，细菌分离自种子。可以改变用于处理样品的参数以分离不同类型的关联微生物，例如根际，附生或内生菌。细菌也可以从库诸如环境菌株收集物获得，而不是最初从第一植物中分离。可以对微生物进行基因分型和表型分型，经由对分离的微生物的基因组进行测序，对植物中群落的组成进行概况；表征群落或分离的微生物的转录组学功能；或使用选择性或表型培养基(例如，固氮或磷酸盐溶解表型)筛选微生物特征。选定的候选菌株或种群可以这样获得，经由序列数据；表型数据；植物数据(例如，基因组，表型和/或产量数据)；土壤数据(例如，pH，N/P/K含量和/或大量土壤生物群落)；或这些的任何组合。

　　本文所述细菌和产生细菌的方法可以应用于能够在叶片表面、根表面或植物组织内部有效地自我繁殖而不会引起有害的植物防御反应的细菌，或对植物防御反应具有抗性的细菌。可以通过在不添加氮的培养基中培养植物组织提取物或叶表面洗涤液来分离本文所述的细菌。然而，细菌可能是不可培养的，也就是说，未知是可培养的或者难以使用本领域已知的标准方法来培养。本文所述的细菌可以是内生菌或附生菌或栖息在植物根际中的细菌(根际细菌)。在重复引入遗传变异，暴露于多种植物并从具有改善的性状的植物中分离细菌的步骤一次或多次(例如1、2、3、4、5、10、15、25，或更多次)后获得的细菌可能是内生的，附生的或根际的。内生菌是这样的生物体，其进入植物内部而不会引起疾病症状或引起共生结构形成，并具有农艺学意义，因为它们可以增强植物生长并改善植物的营养(例如，通过氮固定)。细菌可以是种传内生菌。种传内生菌包括与草或植物的种子相关联或衍生自其的细菌，如在成熟、干燥、未受损(例如，无裂缝，可见的真菌感染或过早发芽)的种子中发现的种传细菌内生菌。种传细菌内生菌可以与种子的表面相关联或衍生自种子的表面；替代地或另外地，其可以与(例如，表面消毒的种子的)内部种子隔室相关联或衍生自内部种子隔室。在一些情况中，种传细菌内生菌能够在植物组织内例如种子的内部复制。同样，在一些情况中，种传细菌内生菌能够在干燥存活。

　　根据本公开的方法分离的或用于本公开的方法或组合物中的细菌可以包含多种不同细菌分类单元的组合。例如，细菌可以包括变形菌门(如假单胞菌(Pseudomonas)，肠杆菌(Enterobacter)，寡养单胞菌(Stenotrophomonas)，伯克霍尔德菌(Burkholderia)，根瘤菌(Rhizobium)，草螺菌(Herbaspirillum)，泛菌属(Pantoea)，沙雷氏菌(Serratia)，拉恩氏菌(Rahnella)，固氮螺菌(Azospirillum)，根瘤菌(Azorhizobium)，固氮菌(Azotobacter)，杜擀氏菌(Duganella)，代尔夫特菌(Delftia)，慢生根瘤菌(Bradyrhizobiun)，中华根瘤菌(Sinorhizobium)和盐单胞菌(Halomonas)，厚壁菌门(Firmicutes)(诸如芽孢杆菌(Bacillus))，类芽孢杆菌(Paenibacillus)，乳酸菌(Lactobacillus)，支原菌(Mycoplasma)，和醋杆菌(Acetabacterium)和放线菌(Actinobacteria)(诸如链霉菌(Streptomyces))，红球菌(Rhodacoccus)，微细菌(Microbacterium)，和短小杆菌(Curtobacterium)。在本公开的方法和组合物中使用的细菌可以包括两种或更多种物种的固氮细菌菌群。在一些情况中，细菌菌群的一种或多种细菌物种能够固定氮。在一些情况中，一种或多种细菌菌群可以促进或增强其他细菌固氮的能力。固定氮的细菌和增强其他细菌固定氮能力的细菌可以相同或不同。在一些实例中，当与不同的细菌菌株结合时或在某些细菌菌群中，细菌菌株可能能够固定氮，但是在单培养中可能不能固定氮。可以在固氮细菌菌群中发现的细菌属的实例，包括但不限于，草螺菌(Herbaspirillum)，固氮螺菌(Azospirillum)，肠杆菌(Enterobacter)和芽孢杆菌(Bacillus)。

　　可以通过本文所公开的方法产生的细菌包括，固氮菌种(Azotobacter sp.)，缓生根瘤菌种(Bradyrhizobium sp.)，克雷伯氏菌种(Klebsiella sp.)和中华根瘤菌种(Sinorhizobium sp.)。在一些情况中，细菌可以选自：棕色固氮菌(Azotobactervinelandi)，日本短根缓生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)，肺炎链球克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和美利特中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。在一些情况中，细菌可以是肠杆菌属(genus Enterobacter)或拉恩氏菌属(genus Rahnella)。在某些情况下，细菌可以是弗兰克氏菌属(genus Frankia)或梭菌属(genus Clostridium)。梭菌属的细菌的实例包括但不限于：艾氏梭菌(Clostridium acetobutilicum)，巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)。在一些情况中，细菌可以是类芽孢杆菌属(genus Paenibacillus)，例如，偶氮固定芽孢杆菌(Paenibacillusazotofixans)，北方孔氏芽孢杆菌(Paenibacillus borealis)，硬质芽孢杆菌(Paenibacillus durus)，硬皮芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)，多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)，肺炎芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)，解淀粉芽孢杆菌(Paenibacillus amylolyticus)，坎皮纳斯类芽孢杆菌(Paenibacillus campinasensis)，弯曲杆菌芽孢杆菌(Paenibacillus chibensis)，谷氏芽孢杆菌(Paenibacillusglucanolyticus)，伊力诺丝芽孢杆菌(Paenibacillus illinoisensis)，幼虫芽孢杆菌幼虫亚种(Paenibacillus larvae subsp.Larvae)，幼虫芽孢杆菌尘埃亚种(Paenibacilluslarvae subsp.Pulvifaciens)，劳氏芽孢杆菌(Paenibacillus lautus)，浸麻类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)，马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus macquariensis)，马阔里类芽孢杆菌(Paenibacillus macquariensis)，饲料类芽孢杆菌(Paenibacillus pabuli)，派瑞艾芽孢杆菌(Paenibacillus peoriae)，或多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)。

　　在一些实例中，根据本文公开的方法分离的细菌可以是下述分类单位中的一个或多个的成员：无色菌(Achromobacter)，硫杆菌(Acidithiobacillus)，食酸菌(Acidovorax)，酸性菌(Acidovoraz)，不动杆菌(Acinetobacter)，游动放线菌(Actinoplanes)，艾德西寨菌(Adlercreutzia)，气球菌(Aerococcus)，气单胞菌(Aeromonas)，阿菲波菌(Afipia)，壤霉菌(Agromyces)，艾西巴特杆菌(Ancylobacter)，节杆菌(Arthrobacter)，艾特丝特菌(Atopostipes)，固氮螺菌(Azospirillum)，芽孢杆菌(Bacillus)，蛭弧菌(Bdellovibrio)，拜叶林克氏菌(Beijerinckia)，波氏菌(Bosea)，慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)，短芽胞杆菌(Brevibacillus)，短波单胞(Brevundimonas)，伯克霍尔德菌(Burkholderia)，暂定种光瑞迪菌(Candidatus Haloredivivus)，柄杆菌(Caulobacter)，纤维菌(Cellulomonas)，纤维弧菌(Cellvibrio)，金黄杆菌(Chryseobacterium)，柠檬酸杆菌(Citrobacter)，梭菌(Clostridium)，科拉玛格丽塔菌(Coraliomargarita)，棒状杆菌(Corynebacterium)，卡普迪菌(Cupriavidus)，短小杆菌(Curtobacterium)，克韦菌(Curvibacter)，异常球菌(Deinococcus)，代尔夫特菌(Delftia)，德库菌(Desemzia)，戴沃斯菌(Devosia)，独岛菌(Dokdonella)，戴氏菌(Dyella)，水栖菌(Enhydrobacter)，肠杆菌(Enterobacter)，肠球菌(Enterococcus)，欧文氏菌(Erwinia)，埃希氏杆菌(Escherichia)，埃希氏杆菌/志贺氏杆菌(Escherichia/Shigella)，微小杆菌属(Exiguobacterium)，铁球菌(Ferroglobus)，菲立莫那斯菌(Filimonas)，奋戈迪亚菌(Finegoldia)，菲韦索菌(Flavisolibacter)，黄杆菌(Flavobacterium)，菲戈瑞菌(Frigoribacterium)，葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter)，哈夫尼菌(Hafnia)，盐棒杆菌(Halobaculum)，盐单胞菌(Halomonas)，盐简菌(Halosimplex)，草螺菌(Herbaspirillum)，薄层菌(Hymenobacter)，克雷伯氏菌(Klebsiella)，考克氏菌(Kocuria)，考萨特尼菌(Kosakonia)，乳酸杆菌(Lactobacillus)，勒克氏菌(Leclercia)，伦茨氏菌(Lentzea)，卢特氏菌(Luteibacter)，藤黄色单胞菌(Luteimonas)，马赛菌(Massilia)，生根瘤菌(Mesorhizobium)，甲基杆菌(Methylobacterium)，细杆菌(Microbacterium)，微球菌(Micrococcus)，微威娜菌(Microvirga)，分支杆菌(Mycobacterium)，奈瑟氏菌(Neisseria)，诺卡氏菌(Nocardia)，大洋杆菌(Oceanibaculum)，苍白杆菌(Ochrobactrum)，直杆菌(Okibacterium)，寡营养菌(Oligotropha)，奥兹胡姆菌(Oryzihumus)，嗜草酸菌(Oxalophagus)，类芽孢杆菌(Paenibacillus)，潘诺阿菌(Panteoa)，潘托亚菌(Pantoea)，佩洛莫纳斯菌(Pelomonas)，透明球菌(Perlucidibaca)，植物杆菌(Plantibacter)，多核杆菌(Polynucleobacter)，丙酸杆菌(Propionibacterium)，丙酸熔岩菌(Propioniciclava)，假棒形杆菌(Pseudoclavibacter)，假单胞菌(Pseudomonas)，假诺卡氏菌(Pseudonocardia)，假黄色单胞菌(Pseudoxanthomonas)，嗜冷杆菌(Psychrobacter)，拉恩氏菌(Rahnella)，罗尔斯通菌(Ralstonia)，莱茵海默拉菌(Rheinheimera)，根瘤菌(Rhizobium)，红球菌(Rhodococcus)，红假单胞菌(Rhodopseudomonas)，玫瑰菌(Roseateles)，瘤胃球菌(Ruminococcus)，塞巴尔德拉菌(Sebaldella)，沉积物芽盹杆菌(Sediminibacillus)，沉积菌(Sediminibacterium)，沙雷氏菌(Serratia)，志贺氏杆菌(Shigella)，氏尼拉菌(Shinella)，中华根瘤菌(Sinorhizobium)，中国孢子囊菌(Sinosporangium)，鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)，鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)，鞘氨醇菌(Sphingopyxis)，鞘氨醇单胞菌(Sphingosinicella)，葡萄球菌(Staphylococcus)，25寡养单胞菌(25Stenotrophomonas)，嗜单胞菌(Strenotrophomonas)，链球菌(Streptococcus)，链霉菌(Streptomyces)，憎叶菌(Stygiolobus)，硫化叶菌(Sulfurisphaera)，塔特姆菌(Tatumella)，特派迪氏菌(Tepidimonas)，热单胞菌(Thermomonas)，产硫酸杆菌(Thiobacillus)，贪噬菌(Variovorax)，WPS-2属未定地位(incertae sedis)，黄单胞菌(Xanthomonas)和齐默尔内拉菌(Zimmermannella)。

　　在一些情况中，利用选自以下属中的至少一种的细菌物种：肠杆菌(Enterobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和拉恩氏菌(Rahnella)。在一些情况中，利用以下属的细菌物种的组合：肠杆菌(Enterobacter)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和拉恩氏菌(Rahnella)。在一些情况中，利用的物种可以是以下一种或多种：蔗糖肠杆菌(Enterobacter sacchari)、变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、蔗糖小迫氏菌(Kosakonia sacchari)和水生拉恩氏菌(Rahnella aquatilis)。

　　在一些情况中，革兰氏阳性微生物可具有钼-铁固氮酶系统，其包括：nifH、nifD、nifK、nifB、nifE、nifN、nifX、hesA、nifV、nifW、nifU、nifS、nifI1和nifI2。在一些情况中，革兰氏阳性微生物可具有钒固氮酶系统，其包括：vnfDG、vnfK、vnfE、vnfN、vupC、vupB、vupA、vnfV、vnfR1、vnfH、vnfR2、vnfA(转录调节剂)。在一些情况中，革兰氏阳性微生物可具有纯铁固氮酶系统，其包括：anfK、anfG、anfD、anfH、anfA(转录调节剂)。在一些情况中，革兰氏阳性微生物可具有包含glnB和glnK(氮信号转导蛋白)的固氮酶系统。革兰氏阳性微生物中涉及氮代谢的酶的一些实例包括glnA(谷氨酰胺合成酶)，gdh(谷氨酸脱氢酶)，bdh(3-羟基丁酸脱氢酶)，谷氨酰胺酶，gltAB/gltB/gltS(谷氨酸合成酶)，asnA/asnB(天冬氨酸-氨连接酶/天冬酰胺合成酶)和ansA/ansZ(天冬酰胺酶)。革兰氏阳性微生物中涉及氮转运的蛋白质的一些实例包括amtB(铵转运体)，glnK(铵转运调节剂)，glnPHQ/glnQHMP(ATP依赖性谷氨酰胺/谷氨酸转运体)，glnT/alsT/yrbD/yflA(谷氨酰胺样质子同向转移转运体)和gltP/gltT/yhcl/nqt(谷氨酸样质子同向转移转运体)。

　　特别感兴趣的革兰氏阳性微生物的实例包括多混合类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymixa)，里约热类芽孢杆菌(Paenibacillus riograndensis)，类芽孢杆菌种(Paenibacillus sp.)，弗兰克氏菌种(Frankia sp.)，螺旋杆菌种(Heliobacterium sp.)，绿螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)，螺旋菌种(Heliobacillus sp.)，嗜阳菌种(Heliophilum sp.)，贺立瑞替菌种(Heliorestis sp.)，丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)，梭菌种(Clostridium sp.)，软毛分枝杆菌(Mycobacterium flaum)，分支杆菌种(Mycobacterium sp.)，节细菌种(Arthrobacter sp.)，壤霉菌种(Agromycessp.)，无机营养棒状杆菌(Corynebacterium autitrophicum)，棒状杆菌种(Corynebacterium sp.)，小单孢菌种(Micromonspora sp.)，丙酸杆菌种(Propionibacteria sp.)，链霉菌种(Streptomyces sp.)和细杆菌种(Microbacteriumsp.)。

　　在革兰氏阳性微生物中可能发生的遗传改变的一些实例包括：缺失glnR以消除在环境氮存在的情况下的BNF的负调控，在nif簇的上游直接插入不同的启动子以消除GlnR响应环境氮的调控，使glnA突变以降低GS-GOGAT途径的氨同化的速率，缺失amtB以减少培养基中铵的摄取，使glnA突变以使其处于反馈抑制(FBI-GS)状态，以通过GS-GOGAT途径减少铵同化。

　　在一些情况中，glnR是类芽孢杆菌(Paenibacillus)物种中N代谢和固定的主要调节剂。在一些情况中，类芽孢杆菌物种的基因组可能不包含产生glnR的基因。在一些情况中，类芽孢杆菌物种的基因组可能不包含产生glnE或glnD的基因。在一些情况中，类芽孢杆菌物种的基因组可能包含产生glnB或glnK的基因。例如类芽孢杆菌种WLY78不包含glnB的基因，也不包含其在古细菌玛普络斯产甲烷球菌(Methanococcus maripaludis)中发现的同系物，nipalI1和nifI2。在一些情况中，类芽孢杆菌物种的基因组可能是可变的。例如，多混合类芽孢杆菌(Paenibacillus polymixa)E681缺少glnK和gdh，具有几种氮化合物转运体，但似乎只有amtB受GlnR控制。在另一个实例中，类芽孢杆菌种JDR2具有glnK，gdh和其他大多数中央氮代谢基因，具有少得多的氮化合物转运体，但确实具有通过GlnR控制的glnPHQ。南里奥类芽孢杆菌(Paenibacillus riograndensis)SBR5包含标准glnRA操纵子，fdx基因，主要nif操纵子，次要nif操纵子和anf操纵子(编码纯铁固氮酶)。在各操纵子的上游发现了假定的glnR/tnrA位点。GlnR可以调节上述所有的操纵子，除anf操纵子外。GlnR可以二聚体结合这些调节序列中的每一个。

　　类芽孢杆菌N固定菌株可能分为两个亚组：亚组I，其仅包含最小nif基因簇，和亚组II，其包含最小基因簇，以及nifX和hesA之间的未表征的基因，并且常常还有复制一些nif基因如nifH、nifHDK、nifBEN的其他簇，或编码钒(vanadaium)固氮酶(vnf)或纯铁固氮酶(anf)的簇。

　　在一些情况中，类芽孢杆菌物种的基因组可能不包含产生glnB或glnK的基因。在一些情况中，类芽孢杆菌物种的基因组可能包含一个最小nif簇，具有转录自sigma-70启动子的9个基因。在一些情况中，类芽孢杆菌nif簇可能受到氮或氧的负调控。在一些情况中，类芽孢杆菌物种的基因组可能不包含产生sigma-54的基因。例如，类芽孢杆菌种WLY78不包含sigma-54的基因。在一些情况中，nif簇可能受到glnR和/或TnrA的调控。在一些情况中，nif簇的活性可以通过改变glnR和/或TnrA的活性来改变。

　　在芽孢杆菌中，谷氨酰胺合成酶(GS)被高浓度的胞内谷氨酰胺反馈抑制，从而导致确认的改变(称为FBI-GS)。Nif簇在几个芽孢杆菌物种中含有针对调节剂GlnR和TnrA的独特结合位点。在过量的胞内谷氨酰胺和AMP存在的情况下，GlnR结合并抑制基因表达。GlnR的作用可能是在高氮利用条件下防止谷氨酰胺和铵的流入和胞内产生。在有限的胞内谷氨酰胺存在的情况下和/或在FBI-GS存在的情况下，TnrA可以结合和/或激活(或抑制)基因表达。在一些情况中，芽孢杆菌nif簇的活性可以通过改变GlnR的活性来改变。

　　反馈抑制的谷氨酰胺合成酶(FBI-GS)可以结合GlnR，并稳定GlnR与识别序列的结合。几种细菌在nif簇的上游具有GlnR/TnrA结合位点。改变FBI-GS和GlnR的结合可能会改变nif途径的活性。

　　微生物的来源

　　细菌(或根据本公开的任何微生物)可以获自任何一般陆地环境，包括其土壤，植物，真菌，动物(包括无脊椎动物)和其他生物区系，包括沉积物，水和湖泊和河流的生物区系；来自海洋环境，其生物区系和沉积物(例如海水，海洋泥浆，海洋植物，海洋无脊椎动物(例如，海绵)，海洋脊椎动物(例如，鱼))；陆地和海洋地圈(碎石和岩石，例如，破碎的地下岩石，沙子和粘土)；冰冻圈及其融水；大气(例如，过滤后的空中灰尘，云雾和雨滴)；城市，工业和其他人造环境(例如，混凝土，路边排水沟，屋顶表面和道路表面上积累的有机和矿物质)。

　　获得细菌(或根据本公开的任何微生物)的植物可以是具有一个或多个期望性状的植物，例如，在特定环境或感兴趣的某些条件下自然生长的植物。例如，某种植物可以自然生长于高盐度的沙质土壤或沙子中，或在极端温度下，或使用很少的水，或者可以抵抗环境中存在的某些害虫或疾病，并且这对于要在这样的条件下生长的商品作物来说，特别是如果例如这些是在特定理位置上仅有的条件时可能是理想的。例如，细菌可以收集自在这类环境中生长的商业作物，或更具体地，收集自在任何下述特定环境中生长的作物中最能表现出感兴趣的性状的个体作物：例如，在盐分有限的土壤中生长的作物中生长最快的植物，或暴露于严重昆虫破坏或疾病流行的作物中受损最小的植物，或具有所需量的某些代谢物和其他化合物(包括纤维含量，油含量等)的植物，或表现出所需颜色、味道或气味的植物。细菌可以收集自感兴趣的植物或在感兴趣的环境中出现的任何材料，包括真菌和其他动植物生物区系，土壤，水，沉积物和之前所述环境的其他元素。

　　细菌(或根据本公开的任何微生物)可以分离自植物组织。这种分离可以发生自植物中的任何适当的组织，包括例如根，茎和叶以及植物生殖组织。例如，用于由植物分离的常规方法通常包括对感兴趣的植物材料(例如，根或茎长度，叶片)进行无菌切除，用适当溶液(例如，2％次氯酸钠)进行表面灭菌，然后再将植物材料置于营养培养基上以进行微生物生长。或者，可以在无菌液体(通常是水)中压碎经表面灭菌的植物材料，然后将液体悬浮液(包括压碎的植物材料的小片)涂布在合适的一种或多种固体琼脂培养基的表面上，所述培养基可以具有或不具有选择性(例如，仅包含植酸作为磷的来源)。该方法特别适用于形成分离菌落的细菌并可以单独提取以分离营养培养基的板，并通过众所周知的方法进一步纯化为单个物种。或者，可以不对植物根部或枝叶样本进行表面灭菌，而仅对其进行轻微地洗涤，从而在分离过程中包括表面驻留的附生微生物，或者可以通过印迹和剥离留在琼脂培养基表面的植物根部，茎或条的方式分别分离附生微生物，然后如上所述分离单个菌落。例如，该方法对于细菌特别有用。或，可以在不洗掉附着于根部的少量土壤的情况下处理根部，从而包括定殖在植物根际中的微生物。否则，附着于根部的土壤可以被去除，稀释并散布于合适的选择性和非选择性培养基的琼脂上，以分离根际细菌的单个菌落。

　　《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》

　　本公开的微生物保藏根据《国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约》(《布达佩斯条约》)的规定进行。

　　申请人声明，根据37C.F.R.§1.808(a)(2)，“在授予专利后，将不可撤销地撤消保藏人对公众可获得保藏材料的所有限制”。该声明应遵守本节(b)的规定(即37C.F.R.§1.808(b))。

　　蔗糖小迫氏菌(Kosakonia sacchari)的纯生物培养物(WT)于2017年1月6日在位于美国缅因州04544东比斯贝Bigelow Drive 60号的Bigelow国家海洋藻类和微生物群中心(NCMA)保藏，并指定了NCMA专利保藏指定编号201701001。适用的保藏信息示于下表1。

　　变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)的纯生物培养物(WT)于11.08.17在位于美国缅因州04544东比斯贝Bigelow Drive 60号的Bigelow国家海洋藻类和微生物群中心(NCMA)保藏，并指定了NCMA专利保藏指定编号201708001。适用的保藏信息示于下表1。

　　表1：基于《布达佩斯条约》保藏的微生物

　　

　　

　　分离的生物学上纯的微生物

　　在某些实施方式中，本公开提供了分离的生物学上纯的微生物，其尤其应用于农业中。所公开的微生物可以以其分离的生物学上纯的状态利用，以及配制成组合物(参加下文关于示例性组合物的部分)。此外，本公开提供了包含至少两种所公开的分离的生物学上纯的微生物的微生物组合物，以及利用所述微生物组合物的方法。此外，本公开提供了通过利用所公开的分离的生物学上纯的微生物来调节植物中氮固定的方法。

　　在一些方面中，本公开的分离的生物学上纯的微生物是来自表1的微生物。在其他方面中，本公开的分离的生物学上纯的微生物衍生自表1的微生物。例如，本文提供了来自表1的微生物的菌株、子代、突变体或衍生物。本公开内容考虑了表1中所列的微生物的所有可能的组合，所述组合有时形成微生物菌群。表1中的微生物可以单独地或以任何组合与本公开中所提及的任何植物，活性物(合成的，有机的等)，佐剂，运载体，补充剂或生物剂组合。

　　组合物

　　包含根据本文所述方法生产的细菌或细菌群体和/或具有本文所述特征的组合物可以是液体、泡沫或干燥产品的形式。包含根据本文所述方法生产的细菌或细菌群体和/或具有本文所述特征的组合物也可用于改善植物性状。在一些实例中，包含细菌群体的组合物可以是干粉，粉和水的浆液或可流动种子处理的形式。包含细菌群体的组合物可以涂覆在种子的表面，并且可以是液体形式。

　　组合物可以在生物反应器如连续搅拌釜反应器、间歇反应器和农场中制备。在一些实例中，组合物可以存储在容器中，诸如水罐的或以小体积存储。在一些实例中，组合物可以存储在选自下组的对象内：瓶，广口瓶，安瓿，包裹，容器，袋，盒，箱，容器，信封，纸箱，容器，筒仓，运输容器，卡车床和/机箱。

　　组合物也可用于改善植物性状。在一些实例中，可以将一种或多种组合物涂覆到种子上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物涂覆到幼苗上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物涂覆到种子的表面上。在一些实例中，可以将一种或多种组合物作为层涂覆到种子表面上。在一些实例中，涂覆在种子上的组合物可以是液体形式，干燥产品形式，泡沫形式，粉末和水的浆液形式或可流动的种子处理形式。在一些实例中，可以通过喷洒，浸没，涂覆，包封和/或撒粉种子和/或幼苗以及一种或多种组合物将一种或多种组合物施用于种子和/或幼苗。在一些实例中，可以将多种细菌或细菌群体涂覆到植物的种子和/或幼苗上。在一些实例中，细菌组合的至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个或十个以上的细菌可以选自以下属之一：食酸菌(Acidovorax),土壤杆菌(Agrobacterium),芽孢杆菌(Bacillus),伯克霍尔德菌(Burkholderia),金黄杆菌(Chryseobacterium),短小杆菌(Curtobacterium),肠杆菌(Enterobacter),埃希氏杆菌(Escherichia),甲基杆菌(Methylobacterium),类芽孢杆菌(Paenibacillus),泛生菌(Pantoea),假单胞菌(Pseudomonas),罗尔斯通菌(Ralstonia),糖芽胞杆菌(Saccharibacillus),鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)和寡养单胞菌(Stenotrophomonas)。

　　在一些实例中，内生组合的至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个或十个以上的细菌和细菌群体可以选自以下科之一：芽胞杆菌(Bacillaceae),伯克氏菌(Burkholderiaceae),丛毛单胞菌(Comamonadaceae),(肠杆菌Enterobacteriaceae),黄杆菌(Flavobacteriaceae),甲基杆菌(Methylobacteriaceae),微杆菌(Microbacteriaceae),类芽孢杆菌(Paenibacillileae),假桑菌(Pseudomonnaceae),根瘤菌(Rhizobiaceae),鞘脂单胞菌(Sphingomonadaceae),黄单胞菌(Xanthomonadaceae),枝孢霉(Cladosporiaceae),日规壳菌(Gnomoniaceae),未定地位(Incertae sedis),毛球壳(Lasiosphaeriaceae),耐却西菌(Netriaceae)和孢腔菌(Pleosporaceae)。

　　在一些实例中，内生组合的至少两个，至少三个，至少四个，至少五个，至少六个，至少七个，至少八个，至少九个，至少十个或十个以上的细菌和细菌群体可以选自以下科之一：芽胞杆菌(Bacillaceae),伯克氏菌(Burkholderiaceae),丛毛单胞菌(Comamonadaceae),(肠杆菌Enterobacteriaceae),黄杆菌(Flavobacteriaceae),甲基杆菌(Methylobacteriaceae),微杆菌(Microbacteriaceae),类芽孢杆菌(Paenibacillileae),假桑菌(Pseudomonnaceae),根瘤菌(Rhizobiaceae),鞘脂单胞菌(Sphingomonadaceae),黄单胞菌(Xanthomonadaceae),枝孢霉(Cladosporiaceae),日规壳菌(Gnomoniaceae),未定地位(Incertae sedis),毛球壳(Lasiosphaeriaceae),耐却西菌(Netriaceae)，孢腔菌(Pleosporaceae)。

　　组合物的实例可以包括用于商业上重要的农作物，例如高粱，油菜籽，番茄，草莓，大麦，水稻，玉米和小麦的种子包衣。组合物的实例还可包括用于玉米，大豆，油菜籽，高粱，马铃薯，水稻，蔬菜，谷物和油料种子的种子包衣。本文提供的种子可以是转基因生物(GMO)，非GMO，有机的或常规的。在一些实例中，可将组合物喷洒到植物的地上部分，或通过插入种植植物种子的犁沟中，浇水至土壤或将根浸入组合物的悬浮液中而施用于根。在一些实例中，可以合适的方式使组合物脱水，以维持细胞活力以及人工接种和定殖宿主植物的能力。细菌物种可以以108至1010CFU/ml之间的浓度存在于组合物中。在一些实例中，组合物可以补充有痕量金属离子，如钼离子，铁离子，锰离子或这些离子的组合。如本文所述的组合物实例中的离子浓度可在约0.1mM至约50mM之间。组合物的一些实例也可以与运载体一起配制，所述运载体诸如β-葡聚糖，羧基甲基纤维素(CMC)，细菌胞外聚合物(EPS)，糖，动物乳或其他合适的运载体。在一些实例中，泥炭或种植材料可以用作运载体，或者其中包埋了组合物的生物聚合物可以用作运载体。包含本文所述细菌群体的组合物可以改善植物性状，如促进植物生长，维持叶片中的高叶绿素含量，增加果实或种子数量以及增加果实或种子单位重量。

　　可以将包含本文所述的细菌群体的组合物涂覆到种子的表面上。因此，也考虑了这样的组合物，其包含用本文所述的一种或多种细菌涂覆的种子。种子涂覆可以通过将细菌群体与多孔的化学惰性颗粒状运载体混合而形成。或者，可将组合物直接插入种植种子的犁沟中，或喷洒到植物叶子上，或将根部浸入组合物的悬浮液中进行施用。有效量的组合物可用于植入活细菌生长的植物根附近的亚土壤区域，或植入活细菌生长的额植物的叶。通常，有效量是足以产生具有改善的性状(例如，所需水平的氮固定)的植物的量。

　　可以使用农业上可接受的运载体来配制本文所述的细菌组合物。能够用于这些实施方式的制剂可以包括选自下组的至少一种：增粘剂，微生物稳定剂，杀真菌剂，抗菌剂，防腐剂，稳定剂，表面活性剂，抗复合剂，除草剂，杀线虫剂，杀虫剂，植物生长调节剂，肥料，灭鼠剂，干燥剂，杀菌剂，营养物或其任意组合。在一些实例中，组合物可以是贮存稳定的。例如，本文所述的任何组合物可以包括农业上可接受的运载体(例如，以下的一种或多种：肥料，如非天然存在的肥料，粘附剂，如非天然存在的粘合剂，和杀虫剂，如非天然存在的杀虫剂)。非天然存在的粘合剂可以是，例如，聚合物，共聚物或合成蜡。例如，本文所述的任何涂覆的种子，幼苗或植物可以在种子包衣中包含这类农业上可接受的运载体。在本文所述的任何组合物或方法中，农业上可接受的运载体可以是或可以包括非天然存在的化合物(例如，非天然存在的肥料，非天然存在的粘附剂，如聚合物，共聚物或合成蜡或非天然存在的杀虫剂)。以下描述了农业上可接受的运载体的非限制性实例。农业上可接受的运载体的其他实例是本领域已知的。

　　在一些情况中，细菌与农业上可接受的运载体混合。运载体可以是固体运载体或液体运载体，并且可以是各种形式，包括微球，粉末，乳液等。运载体可以是赋予多种性质，如增加稳定性、润湿性或分散性的各种运载体中的任何一种或多种。组合物中可以包括润湿剂，如天然或合成的表面活性剂，其可以是非离子或离子表面活性剂，或其组合。油包水乳液也可用于配制包含分离细菌的组合物(参见，例如，美国专利号7,485,451)。可以制备的合适的制剂包括可湿性粉剂，颗粒剂，凝胶剂，琼脂条或丸剂，增稠剂等，微囊化的颗粒等，液体，如水性流动剂，水性悬浮液，油包水乳液等。该制剂可以包括谷物或豆类产品，例如，磨碎的谷物或豆类，衍生自谷物或豆类的肉汤或粉状物质，淀粉，糖或油。

　　在一些实施方式中，农业运载体可以是土壤或植物生长培养基。可以使用的其他农业运载体包括水，肥料，植物油，保湿剂或其组合。或者，农业运载体可以是固体，如硅藻土，壤土，二氧化硅，海藻酸，粘土，膨润土，蛭石，种子箱，其他动植物产品或组合，包括颗粒，沉淀或悬浮液。还考虑了将任意前述成分的混合物作为运载体，例如但不限于，壤土，沙子或粘土中的酱状物质(粉状物质和高岭土)，琼脂或基于粉状物质的沉淀。制剂可以包括，细菌的食物来源，如大麦，水稻，或其他生物材料，如种子，植物部分，甘蔗渣，谷物加工产生的壳或茎，来自建筑场地垃圾中的地面植物材料或木材，来自回收纸中，织物或木头的锯末或细纤维。

　　例如，肥料可用于帮助促进种子、幼苗或植物的生长或提供营养。肥料的非限制性实例包括氮，磷，钾，钙，硫，镁，硼，氯化物，锰，铁，锌，铜，钼和硒(或其盐)。肥料的其他实例包括一种或多种氨基酸，盐，碳水化合物，维生素，葡萄糖，NaCl，酵母提取物，NH4H2PO4，(NH4)2SO4，甘油，缬氨酸，L-亮氨酸，乳酸，丙酸，琥珀酸，苹果酸，柠檬酸，KH酒石酸，木糖，来苏糖和卵磷脂。在一个实施方式中，制剂可包含增粘剂或粘附剂(称为粘合剂)以帮助将其他活性剂结合至物质(例如，种子的表面)。这类试剂能够用于将细菌与可包含其他化合物(例如，非生物控制剂)的运载体混合以产生涂覆组合物。这类组合物帮助在植物或种子周围形成包衣，以维持微生物和其他试剂与植物或植物部分之间的接触。在一个实施方式中，粘合剂选自：海藻酸，树胶，淀粉，卵磷脂，芒柄花黄素，聚乙烯醇，碱性刺芒柄花素(alkaliformononetinate)，橙皮素，聚乙酸乙烯酯，脑磷脂，阿拉伯胶，黄原胶，矿物油，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，阿拉伯氨基半乳聚糖，甲基纤维素，PEG 400，壳聚糖，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚丙烯腈，甘油，三甘醇，乙酸乙烯酯，吉兰糖胶，聚苯乙烯，聚乙烯基，羧甲基纤维素，胶加蒂和聚氧乙烯-聚氧丁烯嵌段共聚物。

　　在一些实施方式中，粘合剂可以是，例如，蜡，如巴西棕榈蜡，蜂蜡，中国蜡，虫胶蜡，鲸蜡，小烛树蜡，蓖麻蜡，草皮蜡和小冠巴西棕蜡，和米糠蜡，多糖(例如，淀粉，糊精，麦芽糖糊精，海藻酸和壳聚糖)，脂肪，油，蛋白质(例如，明胶和玉米蛋白)，浮胶(gumarables)和虫胶。粘合剂可以是非天然存在的化合物，例如，聚合物，共聚物和蜡。例如，可用作粘合剂的聚合物的非限制性实例包括：聚乙酸乙烯酯，聚乙酸乙烯酯共聚物，乙烯乙酸乙烯酯(EVA)共聚物，聚乙烯醇，聚乙烯醇共聚物，纤维素(例如，乙基纤维素，甲基纤维素，羟甲基纤维素，羟丙基纤维素和羧甲基纤维素)，聚乙烯吡咯烷酮，氯乙烯，偏二氯乙烯共聚物，木质素磺酸钙，丙烯酸共聚物，聚乙烯丙烯酸酯，聚环氧乙烷，酰胺聚合物和共聚物，聚丙烯酸羟乙酯，甲基丙烯酰胺单体和聚氯丁二烯。

　　在一些实例中，一种或多种粘附剂，抗真菌剂，生长调节剂和杀虫剂(例如，杀虫剂)是非天然存在的化合物(例如，以任何组合)。农业上可接受的运载体的其他实例包括分散剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮/乙酸乙烯酯PVPIVA S-630)，表面活性剂，粘合剂和填充剂。

　　该制剂还可以包含表面活性剂。表面活性剂的非限制性实例包括：氮表面活性剂混合物，诸如Prefer 28(Cenex)，Surf-N(US)，Inhance(Brandt)，P-28(Wilfarm)和Patrol(Helena)；酯化的种子油，包括Sun-It II(AmCy)，MSO(UAP)，Scoil(Agsco)，Hasten(Wilfarm)和Mes-100(Drexel)；和有机硅表面活性剂，包括Silwet L77(UAP)，Silikin(Terra)，Dyne-Amic(Helena)，Kinetic(Helena)，Sylgard 309(Wilbur-Ellis)和Century(Precision)。在一个实施方式中，表面活性剂以0.01％v/v-10％v/v的浓度存在。在一个实施方式中，表面活性剂以0.1％v/v-1％v/v的浓度存在。

　　在一些情况中，制剂包括微生物稳定剂。这类试剂可以包括干燥剂，其可以包括这样的任何化合物或化合物的混合物，其被分类为干燥剂，无论所述一种或多种化合物是否以实际上对液体接种剂具有干燥作用的浓度使用。这类干燥剂与所使用的细菌群体理想地相容，并且应当促进微生物群体在施用到种子上后存活并在干燥中存活的能力。合适的干燥剂的实例包括海藻糖，蔗糖，甘油和甲二醇中的一种或多种。其他合适的干燥剂包括但不限于，非还原糖和糖醇(例如，甘露醇或山梨糖醇)。引入制剂中的干燥剂的量可以在约5％至约50％的重量/体积范围内，例如，约10％至约40％之间，在约15％至约35％之间，或在约20％至约30％之间。在一些情况中，制剂中含有试剂，诸如杀真菌剂，抗菌剂，除草剂，杀线虫剂，杀虫剂，植物生长调节剂，灭鼠剂，杀菌剂或营养剂是有利的。在一些实例中，试剂可包括保护剂，其提供保护以抵抗种子表面传播的病原体。在一些实例中，保护剂可以提供对土壤传播的病原体一定程度的控制。在一些实例中，保护剂可以主要在种子表面上有效。

　　在一些实例中，杀真菌剂可包括可抑制真菌生长或杀死真菌的化学或生物化合物或试剂。在一些实例中，杀真菌剂可包括可以是抑真菌的或杀真菌的化合物。在一些实例中，杀真菌剂可以是保护剂，或主要在种子表面上有效的试剂，提供针对种子表面传播的病原体的保护并提供对土壤传播的病原体的一定程度的控制。保护性杀真菌剂的非限制性实例包括克菌丹(captan)，代森锰(maneb)，福美双(thiram)或咯菌腈(fludioxonil)。

　　在一些实例中，杀真菌剂可以是系统性杀真菌剂，其可以被吸收到出苗的幼苗中并抑制或杀伤宿主植物组织内的真菌。用于种子处理的系统性杀真菌剂包括但不限于下述内容：嘧菌酯(azoxystrobin)，萎锈灵(carboxin)，精甲霜灵(mefenoxam)，甲霜灵(metalaxyl)，噻苯咪唑(thiabendazole)，肟菌酯(trifloxystrobin)和各种三唑杀真菌剂，包括苯醚甲环唑(difenoconazole)，种菌唑(ipconazole)，戊唑醇(tebuconazole)，和灭菌唑(triticonazole)。精甲霜灵和甲霜灵主要用于靶向水霉真菌腐霉(Pythium)和疫霉(Phytophthora)。取决于植物物种，某些杀真菌剂比其他杀真菌剂更优选，这是因为致病真菌物种的敏感性中存在细微差异，或者由于植物的杀菌剂分布或敏感性不同。在一些实例中，杀真菌剂可以是生物控制剂，如细菌或真菌。这类生物体可能是病原性真菌的寄生虫，或者分泌毒素或其他可以杀死或阻止真菌生长的物质。任何类型的杀真菌剂，尤其是通常在植物上使用的杀真菌剂，都可用作种子组合物中的控制剂。

　　在一些实例中，种子包衣组合物包含具有抗菌特性的控制剂。在一个实施方式中，具有抗菌性质的控制剂选自本文其他地方所述的化合物。在另一个实施方式中，该化合物是链霉素(Streptomycin)，氧四环素(oxytetracycline)，恶喹酸(oxolinic acid)或庆大霉素(gentamicin)。可以用作种子包衣组合物部分的抗菌化合物的其他实例包括基于二氯酚和苄醇半缩甲醛(来自ICI或RS来自Thor Chemie，和MK 25来自Rohm&Haas)和异噻唑啉酮衍生物如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(MBS来自Thor Chemie)的那些。

　　在一些实施方式中，生长调节剂选自下组：脱落酸，酰氨基氯(amidochlor)，嘧啶醇(ancymidol)，6-苄氨基嘌呤，芸苔甾内酯(brassinolide)，仲丁灵(butralin)，矮壮素(chlormequat)(氯化矮壮素(chlormequat chloride))，氯化胆碱(choline chloride)，环丙酰草胺(cyclanilide)，丁酰肼(daminozide)，调呋酸(dikegulac)，噻节因(dimethipin)，2,6-二甲基吡啶(2,6-dimethylpuridine)，乙烯利(ethephon)，氟节胺(flumetralin)，氟嘧醇(flurprimidol)，嗪草酸(fluthiacet)，氯吡脲(forchlorfenuron)，赤霉酸(gibberellic acid)，抗倒胺(inabenfide)，吲哚-3-乙酸，顺丁烯二酰肼，氟磺酰草胺(mefluidide)，助壮素(mepiquat)(氯化助壮素(mepiquatchloride))，萘乙酸(naphthaleneacetic acid)，N-6-苄基腺嘌，多效唑(paclobutrazol)，调环酸(prohexadione)三硫代磷酸酯(phosphorotrithioate)，(2,3,5-三-碘代苯甲酸，抗倒酯(trinexapac-ethyl)和烯效唑。生长调节剂的其他非限制性实例包括油菜素内酯(brassinosteroids)，细胞分裂素(例如，激动素和玉米素)，植物生长激素(例如，吲哚乙酸和吲哚乙酰天冬氨酸)，类黄酮和异类黄酮(例如，芒柄花黄素(formononetin)和香叶木素(diosmetin))，植物抗毒素(phytoaixins)(例如，大豆抗毒素(glyceolline))，和植物抗毒素诱导的寡糖(例如，果胶，几丁质，壳聚糖，多聚半乳糖醛酸(polygalacuronic acid)和寡半乳糖醛酸，和吉贝勒林素(gibellerin)。这类试剂与在其上施用该制剂的农业种子或幼苗理想地相容(例如，不应对植物的生长或健康有害)。此外，理想地，试剂是不会引起人、动物或工业用途的安全性问题的试剂(例如，没有安全问题，或者化合物非常不稳定以至于源自植物的商品植物产品只含有可忽略量的化合物)。

　　线虫拮抗生物控制剂的一些实例包括ARF18；30节丛孢种(Arthrobotrys spp.)；毛壳种(Chaetomium spp.)；柱孢种(Cylindrocarpon spp.)；外瓶霉种(Exophilia spp.)；镰孢种(Fusarium spp.)；帚霉种(Gliocladium spp.)；被毛孢种(Hirsutella spp.)；轮枝种(Lecanicillium spp.)；单顶孢种(Monacrosporium spp.)；漆斑菌种(Myrotheciumspp.)；新赤壳种(Neocosmospora spp.)；拟青霉种(Paecilomyces spp.)；普可尼亚种(Pochoniaspp.)；壳多胞菌种(Stagonospora spp.)；囊状树霉菌根真菌(vesicular-arbuscularmycorrhizal fungi)、伯克氏菌种(Burkholderia spp.)；巴斯德氏芽菌种(Pasteuria spp.)、短芽孢杆菌种(Brevibacillus spp.)；假单胞菌种；和根际细菌。特别优选的线虫拮抗生物控制剂包括：ARFl8、少孢节丛孢(Arthrobotrys oligospora)、指状节丛孢(Arthrobotrys dactyloides)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)、异丝藻柱孢(Cylindrocarpon heteronema)、Exophilia jeanselmei、Exophilia pisciphila、Fusariumaspergilus、腐皮镰孢(Fusarium solani)、链孢粘帚霉(Gliocladiumcatenulatum)、粉红粘帚霉(Gliocladium roseum)、雌狐粘帚霉(Gliocladium vixens)、洛斯里被毛孢(Hirsutellarhossiliensis)、明尼苏达被毛孢(Hirsutella minnesotensis)、蜡蚧轮枝菌(Lecanicillium lecanii)、德氏单顶孢(Monacrosporium drechsleri)、戈氏单顶孢(Monacrosporiumgephyropagum)、Myrotehcium verrucaria、侵管新赤壳菌(Neocosmospora vasinfecta)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)、厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、异皮壳多孢菌(Stagonospora heteroderae)、菜豆壳多孢菌(Stagonospora phaseoli)、囊状树霉菌根真菌、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderiacepacia)、穿刺巴斯德氏芽菌(Pasteuria penetrans)、索雷巴斯德氏芽菌(Pasteuriathornei)、尼氏巴斯德氏芽菌(Pasteurianishizawae)、分支巴斯德氏菌(Pasteuriaramosa)、尤氏巴斯德氏芽菌(Pastrueia usage)、侧孢短芽孢杆菌G4株、荧光假单胞菌和根际细菌。

　　营养物的一些实例可选自氮肥，包括但不限于尿素、硝酸铵、硫酸铵、无压力氮溶液、氨水、无水氨、硫代硫酸铵、硫涂覆的尿素、尿素-甲醛、IBDU、聚合物涂覆的尿素、硝酸钙、脲甲醛(Ureaform)和亚甲基脲，磷肥，如磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、多聚磷酸铵、浓缩的磷酸钙和三过磷酸钙，和钾肥，如氯化钾、硫酸钾、硫酸镁钾、硝酸钾。这类组合物可以作为种子包衣组合物中的游离盐或离子存在。或者，营养物/肥料可以复合或螯合以随时间提供持续释放。

　　灭鼠剂的一些实例可包括选自下组的物质：2-异戊酰基茚-1,3-二酮、4-(喹喔啉-2-基氨基)苯磺酰胺、α-氯代醇、磷化铝、安妥(antu)、氧化砷、碳酸钡、双鼠脲(bisthiosemi)、溴鼠隆(brodifacoum)、溴敌隆(bromadiolone)、溴鼠胺(bromethalin)、氰化钙、氯醛糖、氯敌鼠(chlorophacinone)、胆钙化醇、氯灭鼠灵(coumachlor)、克灭鼠(coumafuryl)、杀鼠迷(coumatetralyl)、鼠立死(crimidine)、鼠得克(difenacoum)、噻鼠灵(difethialone)、敌鼠(diphacinone)、麦角钙化醇(ergocalciferoi)、氟鼠灵(flocoumafen)、氟乙酰胺(fluoroacetamide)、氟鼠啶(flupropadine)、氟鼠啶盐酸盐、氰化氢、碘甲烷、林丹(lindane)、磷化镁、甲基溴、鼠特灵(norbormide)、毒鼠磷(phosacetim)、磷化氢、磷、杀鼠酮(pindone)、亚砷酸钾、灭鼠优(pyrinuron)、海葱糖苷(scilliroside)、亚砷酸钠、氰化钠、氟乙酸钠、士的宁(strychnine)、硫酸铊、华法林和磷化锌。

　　在液体形式(例如，溶液或悬浮液)中，细菌群体可以在水中或水溶液中混合或悬浮。合适的液体稀释剂或运载体包括水、水溶液、石油馏出物或其它液体运载体。

　　固体组合物可以这样制备，通过将细菌群体分散在适当分开的固体运载体如泥炭、小麦、麸皮、蛭石、粘土、滑石、膨润土、硅藻土、漂白土、巴氏杀菌的土壤等中和其上。当这类制剂用作可湿性粉剂时，可使用生物相容分散剂，诸如非离子型、阴离子型、两性或阳离子型分散剂和乳化剂。

　　制剂时使用的固体运载体包括，例如，高岭土，叶蜡石，膨润土，蒙脱石，硅藻土，酸性白土，蛭石和珠光体等矿物运载体，和无机盐，诸如硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素、氯化铵和碳酸钙等。另外，可以使用有机细粉，诸如小麦粉、麦麸、米糠等。液体运载体包括植物油(如大豆油和棉籽油)，甘油，乙二醇，聚乙二醇，丙二醇，聚丙二醇等。

　　细菌群体在农作物上的施用

　　本文所述的细菌或细菌群体的组合物可以施用于犁沟中、滑石中或作为种子处理。该组合物可以施用于大批量，小批，袋中或滑石中的种子包装。

　　播种机可以根据常规方式，以双排或不需要耕种的方式，种植经处理的种子并使作物生长。可以使用控制料斗或单个料斗分配种子。也可以使用压缩空气或手动分配种子。可以使用可变速率技术进行种子布置。另外，可以使用可变速率技术施用本文所示的细菌或细菌群体。在一些实例中，细菌可以施加至玉米、大豆、油菜、高粱、马铃薯、稻、蔬菜、谷物、假谷物(pseudocereals)和油籽的种子。谷物的实例可包括大麦，非洲小米(fonio)，燕麦，帕尔默草(palmer’s grass)，黑麦，珍珠粟，高粱，斯佩耳特小麦(spelt)，埃塞俄比亚画眉草(teff)，黑小麦和小麦。假谷物的实例可包括面包果，荞麦，香蒲，芡欧鼠尾草(chia)，亚麻，籽粒苋(grain amaranth)，邯杂(hanza)，藜麦和芝麻。在一些实例中，种子可以是经遗传修饰的生物体(GMO)，非GMO，有机的或常规的。

　　可以另外使用添加剂来处理作物，所述添加剂诸如微肥、PGR、除草剂、杀虫剂和杀真菌剂等。添加剂的实例包括作物保护剂，如杀虫剂，杀线虫剂，杀真菌剂，增强剂，如着色剂，聚合物，造粒剂，引发剂和消毒剂，以及其它试剂，如接种剂，PGR，软化剂和微量营养物。PGR可以是影响根生长、开花或茎伸长的天然或合成的植物激素。PGR可包括生长素，赤霉素，细胞分裂素，乙烯和脱落酸(ABA)。

　　该组合物可以与液体肥料组合一起施用于犁沟中。在一些实例中，液体肥料可以容纳在罐中。NPK肥料含有钠，磷和钾的巨量营养素。

　　组合物可以改善植物性状，如促进植物生长，维持叶片中的高叶绿素含量，增加果实或种子数量以及增加果实或种子单位重量。可以采用本公开的方法以引入或改善多种所需要的性状中的一种或多种。可引入或改善的性状的实例包括：根生物量，根长度，高度，枝条长度，叶数，水分利用效率，总生物量，产量，果实大小，籽粒大小，光合作用率，耐旱性，耐热性，耐盐性，对线虫胁迫的抗性，对真菌病原体的抗性，对细菌病原体的抗性，对病毒病原体的抗性，代谢物的水平和蛋白质组表达。根生物量，根长度，高度，枝条长度，叶数，水分利用效率，总生物量，产量，果实大小，籽粒大小，光合作用率，耐旱性，耐热性，耐盐性，对低氮胁迫的耐受性，氮利用效率，对线虫胁迫的抗性，对真菌病原体的抗性，对细菌病原体的抗性，对病毒病原体的抗性，代谢物的水平，代谢物水平的调节，蛋白质组表达。所需要的性状，包括高度，总生物量，根和/或枝条生物量，种子发芽，幼苗存活，光合效率，蒸腾速率，种子/果实数量或质量，植物籽粒或果实产量，叶绿素含量，光合速率，根长度或其任意组合，可用于测量生长，并与相同条件下生长的参照农业植物(例如，不具有引入的和/或改良性状的植物)的生长速率进行比较。在一些实例中，所需要的性状，包括高度，总生物量，根和/或枝条生物量，种子发芽，幼苗存活，光合效率，蒸腾速率，种子/果实数量或质量，植物籽粒或果实产量，叶绿素含量，光合速率，根长度或其任意组合，可用于测量生长，并与相似条件下生长的参照农业植物(例如，不具有引入的和/或改良性状的植物)的生长速率进行比较。

　　宿主植物的农艺性状可包括但不限于下述内容：相较于未使用所述种子处理制剂的种子生长的等同植物，改变的油含量，改变的蛋白质含量，改变的种子碳水化合物组成，改变的种子油组成和改变的种子蛋白质组成，化学耐受性，耐寒性，延迟衰老，抗病性，耐旱性，穗重，生长改善，健康增强，耐热性，除草剂耐受性，食草动物抗性，改善的固氮，提高的氮利用率，改善的根系结构，提高的水分利用效率，增加的生物量，增加的根长度，增加的种子重量，增加的枝条长度，增加的产率，限水条件下增加的产率，籽粒质量，籽粒含水量，金属耐受性，穗数，籽粒数，豆荚数，营养强化，病原菌抗性，抗虫性，光合能力提高，耐盐性，保持绿色，活力提高，成熟种子的干重增加，成熟种子的鲜重增加，各株成熟种子数增加，叶绿素含量增加，各株豆荚数增加，各株豆荚长度增加，各株枯萎叶数减少，各株严重枯萎叶数减少及各株非枯萎叶数增加，可检测的代谢物水平调节，可检测的转录物水平调节及可检测的蛋白质组调节。

　　在一些情况中，使用细菌或细菌群体来接种植物，所述细菌或细菌群体分离自与接种植物的植物元素相同种的植物。例如，通常在玉米(Zea mays)(谷物)的一个品种中发现的细菌或细菌群体与玉米植物的另一个品种的植物元素相关，所述玉米的另一个品种在其天然状态下缺乏所述细菌和细菌群体。在一个实施方式中，细菌和细菌群体源自与接种植物的植物元素相关的植物物种的植物。例如，将通常在大刍草(Zea diploperennisIltis)等(类玉米(diploperennial teosinte))中发现的细菌和细菌群体施用于玉米(Zeamays)，或反之亦然。在一些情况中，使用与接种植物的植物元素异源的细菌和细菌群体接种植物。在一个实施方式中，细菌和细菌群体源自另一个物种的植物。例如，将通常在双子叶植物中发现的细菌和细菌群体施用于单子叶植物(例如，使用大豆来源的细菌和细菌群体接种玉米)，或反之亦然。在其它情况中，待接种到植物上的细菌和细菌群体源自正在接种的植物的相关物种。在一个实施方式中，细菌和细菌群体源自相关的分类群，例如，来自相关物种。另一物种的植物可以是农业植物。在另一个实施方式中，细菌和细菌群体是接种到任何宿主植物元素中的设计组合物的部分。

　　在一些实例中，细菌或细菌群体是外源的，其中细菌和细菌群体分离自与接种植物不同的植物。例如，在一个实施方式中，细菌或细菌群体可以分离自与接种植物相同物种的不同植物。在一些情况中，细菌或细菌群体可以分离自与接种植物相关的物种。

　　在一些实例中，本文所述的细菌和细菌群体能够从一种组织类型移动到另一组织类型。例如，本发明在种子外部涂覆后检测和分离植物成熟组织内的细菌和细菌群体证明了它们从种子外部移动到成熟植物营养组织中的能力。因此，在一个实施方式中，细菌和细菌群体能够从种子外部移动到植物的营养组织中。在一个实施方式中，涂覆在植物种子上的细菌和细菌群体在种子萌发成营养状态后能够定位于植物的不同组织。例如，细菌和细菌群体可以能够定位于植物中的任何一种组织，包括：根，不定根，种子根，根毛，枝条，叶，花，芽，穗，分生组织，花粉，雌蕊，子房，雄蕊，果实，匍匐茎，根茎，结节，块茎，毛状体，保卫细胞，排水器，花瓣，萼片，颖片，轴，维管形成层，韧皮部和木质部。在一个实施方式中，细菌和细菌群体能够定位于植物的根和/或根毛。在另一个实施方式中，细菌和细菌群体能够定位于光合组织，例如，植物的叶和芽。在其它情况下，细菌和细菌群体定位于植物的维管组织，例如，木质部和韧皮部。在另一个实施方式中，细菌和细菌群体能够定位于植物的生殖组织(花，花粉，雌蕊，子房，雄蕊，果实)。在另一个实施方式中，细菌和细菌群体能够定位于植物的根，芽，叶和生殖组织。在又一个实施方式中，细菌和细菌群体定殖于植物的果实或种子组织。在另一个实施方式中，细菌和细菌群体能够定殖于植物，从而使其存在于植物表面(即，其存在可检测地存在于植物的外部或植物的上半球)。在其它实施方式中，细菌和细菌群体能够定位于植物的所有或基本上所有组织。在某些实施方式中，细菌和细菌群体不定位于植物的根。在其它情况下，细菌和细菌群体不定位于植物的光合组织。

　　还可以通过测量作物或作物加热单元(CHU)的相对成熟度来评估组合物的有效性。例如，可以将细菌群体施用于玉米，并且可以根据玉米粒的相对成熟度或玉米粒处于最大重量时的时间来评估玉米生长。作物加热单元(CHU)也可用来预测玉米作物的成熟。CHU通过测量作物生长的每日最高温度来确定热量积累的量。

　　在实例中，细菌可定位于植物中的任何一种组织，包括：根，不定根，种子根，根毛，枝条，叶，花，芽，穗，分生组织，花粉，雌蕊，子房，雄蕊，果实，匍匐茎，根茎，结节，块茎，毛状体，保卫细胞，排水器，花瓣，萼片，颖片，轴，维管形成层，韧皮部和木质部。在另一个实施方式中，细菌或细菌群体能够定位于光合组织，例如，植物的叶和芽。在其它情况下，细菌和细菌群体定位于植物的维管组织，例如，木质部和韧皮部。在另一个实施方式中，细菌或细菌群体能够定位于植物的生殖组织(花，花粉，雌蕊，子房，雄蕊或果实)。在另一个实施方式中，细菌和细菌群体能够定位于植物的根、芽、叶和生殖组织。在另一个实施方式中，细菌或细菌群体定殖于植物的果实或种子组织。在又一个实施方式中，细菌或细菌群体能够定殖于植物，使其存在于植物的表面。在另一个实施方式中，细菌或细菌群体能够定位于植物的所有或基本上所有组织。在某些实施方式中，细菌或细菌群体不定位于植物的根。在其它情况下，细菌和细菌群体不定位于植物的光合组织。

　　施用于作物的细菌组合物的有效性可以通过测量作物生长的各种特征来评估，包括但不限于种植率，播种活力，根强度，耐旱性，植物高度，干燥和测试重量。

　　植物物种

　　本文所述的方法和细菌适用于多种植物中的任何一种，诸如大麦属(generaHordeum)、稻属(genera Oryza)、玉蜀黍属(genera Zea)和小麦属(genera Triticeae)的植物。合适的植物的其它非限制性实例包括苔藓、地衣和藻类。在一些情况下，植物具有经济，社会和/或环境价值，诸如粮食作物，纤维作物，油料作物，林业或造纸工业中的植物，用于生物燃料生产的原料和/或观赏植物。在一些实例中，植物可用于生产经济上有价值的产品，如谷物，面粉，淀粉，糖浆，餐，油，薄膜，包装，营养品，纸浆，动物饲料，鱼饲料，工业化学品的散装材料，谷物产品，加工的人类食品，糖，酒精和/或蛋白质。作物的非限制性实例包括，玉米，水稻，小麦，大麦，高粱，粟，燕麦，黑小麦，荞麦，甜玉米，甘蔗，洋葱，番茄，草莓和芦笋。

　　在一些实例中，可使用本文公开的方法和组合物获得或改善的植物可以包括对农业，园艺，用于生产生物燃料分子和其它化学品的生物质和/或林业至关重要或有意义的植物。这些植物的一些实例可包括，菠萝，香蕉，椰子，百合，草豌豆(grasspea)和禾草；和双子叶植物，如豌豆，苜蓿，绿番茄，甜瓜，鹰嘴豆，菊苣，三叶草，羽衣甘蓝，小扁豆，大豆，烟草，土豆，甘薯，萝卜，卷心菜，油菜(rape)，苹果树，葡萄，棉花，向日葵，拟南芥，油菜(canola)，柑橘(包括橙，橘，金橘，柠檬，酸橙，葡萄柚，橘子，橘柚，香橼和柚子)，胡椒，豆，莴苣，柳枝稷(Panicum virgatum)(枝条)，双色高粱(Sorghum bicolor)(高粱，苏丹)，芒草(Miscanthus giganteus)，甘蔗种(Saccharum sp.)(energycane)，杨树(Populusbalsamifera)，玉米(Zea mays)，大豆(Glycine max)，油菜(Brassica napus)，小麦(Triticum aestivum)，棉花(Gossypium hirsutum)，稻(Oryzasativa)，向日葵(Helianthus annuus)，紫花苜蓿(Medicago sativa)，甜菜(Betavulgaris)，狼尾草(Pennisetum glaucum)，黍种(Panicum spp.)，高粱种(Sorghum spp.)，芒草种(Miscanthus spp.)，甘蔗种(Saccharum spp.)，蔗茅种(Erianthus spp.)，杨种(Populusspp.)，黑麦(Secale cereale)，柳种(Salix spp.)，桉种(Eucalyptus spp.)(桉树(eucalyptus))，小黑麦种(Triticosecale spp.)(小麦属-25小麦X黑麦)，竹子，红花(Carthamustinctorius)，麻风树(Jatropha curcas)，蓖麻(Ricinus communis)，油棕(Elaeisguineensis)，枣椰树(Phoenix dactylifera)，国王棕榈(Archontophoenixcunninghamiana)，女王棕榈(Syagrus romanzoffiana)，亚麻(Linumusitatissimum)，芥菜(Brassica juncea)，木薯(Manihot esculenta)，番茄(Lycopersicon esculentum)，莴苣(Lactuca saliva)，香蕉(Musa paradisiaca)，马铃薯(Solanum tuberosum)，甘蓝(Brassica oleracea)(西兰花，花椰菜，抱子甘蓝)，茶(Camellia sinensis)，草莓(Fragaria ananassa)，可可树(Theobroma cacao)，咖啡树(Coffea arabica)，葡萄(Vitisvinifera)，菠萝(Ananas comosus)，辣椒(Capsicumannum)，洋葱(Allium cepa)，甜瓜(Cucumis melo)，黄瓜(Cucumis sativus)，笋瓜(Cucurbita maxima)，南瓜(Cucurbitamoschata)，菠菜(Spinacea oleracea)，西瓜(Citrullus lanatus)，秋葵(Abelmoschusesculentus)，茄子(Solanum melongena)，罂粟(Papaver somniferum)，Papaverorientale，欧洲紫杉(Taxus baccata)，短叶红豆杉(Taxus brevifolia)，青蒿(Artemisiaannua)，大麻(Cannabis saliva)，喜树(Camptotheca acuminate)，长春花(Catharanthusroseus)，蔓长春花(Vinca rosea)，金鸡纳树(Cinchona officinalis)，秋水仙(Coichicum autumnale)，藜芦(Veratrumcalifornica)，毛地黄(Digitalis lanata)，洋地黄(Digitalis purpurea)，薯蓣种(Dioscorea 5spp.)，穿心莲(Andrographis paniculata)，颠茄(Atropa belladonna)，曼陀罗(Datura stomonium)，小檗种(Berberis spp.)，三尖杉种(Cephalotaxus spp.)，草麻黄(Ephedra sinica)，麻黄种(Ephedra spp.)，古柯(Erythroxylum coca)，绿色雪花莲(Galanthus wornorii)，赛莨菪种(Scopolia spp.)，石松(Lycopodiumserratum)，石松种(Lycopodium spp.)，蛇根木(Rauwolfia serpentina)，萝芙木种(Rauwolfia spp.)，血根草(Sanguinaria canadensis)，莨菪种(Hyoscyamus spp.)，金盏花(Calendulaofficinalis)，小白菊(Chrysanthemum parthenium)，毛喉鞘蕊花(Coleusforskohlii)，艾菊(Tanacetum parthenium)，银胶菊(Parthenium argentatum)，橡胶树种(Hevea spp.)，绿薄荷(Mentha spicata)(薄荷)，欧薄荷(Mentha piperita)(薄荷)，红木(Bixaorellana)，六出花种(Alstroemeria spp.)，蔷薇属(Rosa spp.)(玫瑰)，康乃馨(Dianthuscaryophyllus)，矮牵牛种(Petunia spp.)(矮牵牛花)，一品红(Poinsettiapulcherrima)，烟草(Nicotiana tabacum)，羽扇豆(Lupinus albus)，燕麦(Uniolapaniculata)，大麦(Hordeum vulgare)和黑麦草种(Lolium spp.)(黑麦)。

　　在一些实例中，可以使用单子叶植物。单子叶植物属于泽泻目(Alismatales)，天南星目(Arales)，槟榔目(Arecales)，凤梨目(Bromeliales)，鸭跖草目(Commelinales)，环花目(Cyclanthales)，莎草科(Cyperales)，谷精草目(Eriocaulales)，水鳖目(Hydrocharitales)，灯芯草目(Juncales)，百合目(Lilliales)，茨藻目(Najadales)，兰目(Orchidales)，露兜树目(Pandanales)，禾本目(Poales)，帚灯草目(Restionales)，霉草目(Triuridales)，香蒲目(Typhales)和姜目(Zingiberales)。属于裸子植物纲(Gymnospermae)的植物有苏铁目(Cycadales)，银杏目(Ginkgoales)，麻黄目(Gnetales)和松目(Pinales)。在一些实例中，单子叶植物可选自玉米，水稻，小麦，大麦和甘蔗。

　　在一些实例中，可以使用双子叶植物，包括属于以下目的植物：马兜铃目(Aristochiales)，菊目(Asterales)，肉穗果目(Batales)，桔梗目(Campanulales)，白花菜目(Capparales)，石竹目(Caryophyllales)，木麻黄目(Casuarinales)，卫矛目(Celastrales)，山茱萸目(Cornales)，岩梅目(Diapensales)，五桠果目(Dilleniales)，川续断目(Dipsacales)，柿树目(Ebenales)，欧石楠目(Ericales)，杜仲(Eucomiales)，大戟目(Euphorbiales)，豆目(Fabales)，壳斗目(Fagales)，龙胆目(Gentianales)，牻牛儿苗目(Geraniales)，小二仙草目(Haloragales)，金缕梅目(Hamamelidales)，米德目(Middles)，胡桃目(Juglandales)，唇形目(Lamiales)，樟目(Laurales)，玉蕊目(Lecythidales)，塞子木目(Leitneriales)，木兰目(Magniolales)，锦葵目(Malvales)，杨梅目(Myricales)，桃金娘目(Myrtales)，睡莲目(Nymphaeales)，罂粟目(Papeverales)，胡椒目(Piperales)，车前草目(Plantaginales)，蓝雪目(Plumb aginales)，川苔草目(Podostemales)，花葱目(Polemoniales)，远志目(Polygalales)，蓼目(Polygonales)，报春花目(Primulales)，山龙眼目(Proteales)，大花草目(Rafflesiales)，毛茛目(Ranunculales)，鼠李目(Rhamnales)，蔷薇目(Rosales)，茜草目(Rubiales)，杨柳目(Salicales)，檀香目(Santales)，无患子目(Sapindales)，瓶子草目(Sarraceniaceae)，玄参目(Scrophulariales)，山茶目(Theales)，昆栏树目(Trochodendrales)，伞形目(Umbellales)，荨麻目(Urticales)和万乐目(Violates)。在一些实例中，双子叶植物可选自下组：棉花、大豆、胡椒和番茄。

　　在一些情况下，待改善的植物不易适合实验条件。例如，作物可能要花费过长时间生长，以至于不足以在多次迭代中实际上连续评估改善的性状。因此，最初分离细菌的第一植物和/或施用了基因操作的细菌的多种植物可以是模式植物，如在所需条件下更易于评价的植物。模式植物的非限制性实例包括狗尾草属、短柄草属和拟南芥属。然后可以根据本公开的方法将使用模式植物分离细菌的能力应用于另一类型的植物(例如，作物)以确认改善的性状的赋予。

　　可以通过本文所公开的方法改善的性状包括植物的任何可观测特性，包括例如，生长速率，高度，重量，颜色，味道，气味，由植物产生的一种或多种化合物的变化(包括例如，代谢物，蛋白质，药物，碳水化物，油和其它任何化合物)。还设想了基于基因型信息选择植物(例如，包括响应细菌的植物基因表达模式，或鉴定遗传标志物的存在，诸如与固氮提高相关的那些)。选择植物还可以基于不存在、抑制或限制与某种特征或性状(诸如期望的特征或性状)的存在相反的某种特征或性状(诸如不需要的特征或性状)。

　　农业组合物的施用率和浓度

　　如上所述，包含教导的微生物的本公开的农业组合物可以以多种方式施用于植物。在两个特定的方面中，本公开考虑了犁沟处理或种子处理。

　　对于种子处理的实施方式，本公开的微生物可以多种浓度存在于种子上。例如，微生物可以如下所示cfu浓度/种子存在于种子处理物中：1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010或更高。在特定方面中，种子处理组合物包含约1×104至约1×108cfu/种子。在其他具体方面，种子处理组合物包含约1×105至约1×107cfu/种子。在其他方面，种子处理组合物包含约1×106cfu/种子。

　　在美国，约10％的玉米种植面积以每英亩约36,000粒种子以上的种子密度进行种植；1/3的玉米种植面积以每英亩约33,000至36,000粒种子的种子密度进行种植；1/3的玉米种植面积以每英亩约30,000至33,000粒种子的种子密度进行种植，其余的种植面积是可变的。参见，“玉米播种量注意事项(Corn Seeding Rate Considerations),”Steve Butzen撰写，可获自：https://www.pioneer.com/home/site/us/agronomy/library/corn-seeding-rate-considerations/。

　　下表2在设想的种子处理实施方式中利用各种cfu浓度/种子(各行)和各种种子种植面积种植密度(第1列：15K-41K)，以计算每英亩的cfu总量，其将用于各种农业场景中(即，种子处理浓度/种子×种植的种子密度/英亩)。因此，如果人们要利用1×106cfu/种子的种子处理物并且每英亩种植30,000粒种子，那么每英亩的总cfu含量应当为3×1010(即30K*1×106)。

　　表2：种子处理实施方式的每英亩的总CFU计算

　　

　　对于犁沟的实施方式，本公开的微生物可以下述CFU浓度施用于每英亩：1×106、3.20×1010、1.60×1011、3.20×1011、8.0×1011、1.6×1012、3.20×1012或更高。因此，在一些方面中，液体犁沟组合物可以约1×106至约3×1012cfu/英亩的浓度施用。

　　在一些方面，犁沟组合物包含在液体制剂中。在液体犁沟的实施方式，微生物可以下述每毫升cfu浓度存在：1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013或更高。在某些方面中，液体犁沟组合物包含约1×106至约1×1011cfu/毫升浓度的微生物。在某些方面中，液体犁沟组合物包含约1×107至约1×1010cfu/毫升浓度的微生物。在某些方面中，液体犁沟组合物包含约1×108至约1×109cfu/毫升浓度的微生物。在其他方面中，液体犁沟组合物包含高达约1×1013cfu/毫升浓度的微生物。

　　实施例

　　本文提供的实施例描述了细菌分离、细菌和植物分析和植物性状改善的方法。这些实施例仅作为说明行目的，无论如何不应被解释为对本发明的限制。

　　实施例1：候选微生物的转录物组概况分析

　　进行菌株CI010的转录物组概况，以鉴定在环境氮存在的情况下有活性的启动子。在补充有10mM谷氨酰胺的确定无氮培养基中培养菌株CI010。由这些培养物提取总RNA(QIAGEN RNeasy试剂盒)并通过Illumina HiSeq(SeqMatic，加利福尼亚非蒙市)进行RNAseq测序。使用Geneious将测序读取映射到CI010基因组数据，并鉴定在近端转录启动子控制下的高表达基因。

　　表3和表4列出了通过RNASeq测序总RNA所测量的基因及其相对表达水平。记录了近端启动子的序列，用于诱变nif途径，氮利用相关途径，定殖相关的途径，或具有所需表达水平的基因。

　　表3

　　

　　

　　表4

　　

　　实施例2：候选微生物的诱变

　　λ-Red介导的敲除

　　使用质粒pKD46或含有卡那霉素抗性标记物的衍生物产生候选微生物的几种突变体(Datsenko等2000；PNAS 97(12):6640-6645)。设计敲除盒，具有侧接靶基因的250bp同源性，并经由重叠延伸PCR产生。用pKD46转化候选微生物，在阿拉伯糖存在的情况下培养，以诱导λ-Red机械表达，准备用于电穿孔，并用敲除盒转化以产生候选诱变菌株。如表5所示，使用四种候选微生物和一种实验室菌株产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)M5A1产生氮固定调节基因nifL、glnB和amtB的十三种候选突变体。

　　

　　表5：通过λ-Red诱变产生的单个敲除突变体的列表

　　使用Cas9选择的寡核苷酸定向诱变

　　寡核苷酸定向诱变用于靶向对大肠杆菌DH10B中rpoB基因的基因组变化，并使用CRISPR-Cas系统选择突变体。设计诱变寡核苷酸(ss1283:“G*T*T*G*ATCAGACCGATGTTCGGACCTTCcaagGTTTCGATCGGACATACGCGACCGTAGTGGGTCGGGTGTACGTCTCGAACTTCAAAGCC”(SEQ IDNO:2)，其中*表示硫代磷酸酯键)以通过rpoB基因的4-bp突变赋予利福平(rifampicin)抗性。含有编码Cas9的质粒的细胞经诱导进行Cas9表达，准备进行电穿孔，然后用诱变寡核苷酸以及编码引导RNA(gRNA)组成型表达的质粒电穿孔，所述gRNA靶向WT rpoB序列的Cas9裂解。将电穿孔的细胞在非选择性培养基中回收过夜，以允许产生的突变染色体充分分离。在选择了编码gRNA的质粒后，筛选出的十个菌落中就有两个含有所需的突变，而其余的则表明是通过gRNA质粒中原间隔子突变或Cas9质粒缺失产生的逃避突变体。

　　使用Cas9选择的λ-Red诱变

　　候选微生物CI006和CI010的突变体经由具有通过CRISPR-Cas的选择的λ-Red诱变来产生。敲除盒包含通过转录概况(如表3-4中所述)鉴定的内源性启动子和侧接缺失靶标的约250bp同源性区域。使用在阿拉伯糖诱导型启动子控制下编码λ-Red重组系统(外、β、gam基因)和在IPTG诱导型启动子控制下编码Cas9的质粒转化CI006和CI010。在所得到的转化体中诱导Red重组和Cas9系统，并制备菌株用于电穿孔。随后将敲除盒和质粒编码的选择gRNA转化到感受态细胞中。在对Cas9质粒和gRNA质粒有选择性的抗生素上接种后，筛选的10个菌落中的7个显示出预期的敲除突变。

　　实施例3：候选微生物的植物中表型

　　通过候选微生物的植物的定殖

　　通过短期植物生长实验，对候选微生物对所需宿主植物的定殖进行定量。玉米植物用表达RFP的菌株接种，所述RFP来自质粒或来自Tn5整合的RFP表达盒。植物在灭菌的沙子和未灭菌的泥炭培养基中生长，并且通过在萌发后三天将1mL细胞培养物直接移液到正在出芽的植物胚芽鞘上进行接种。通过用含有适当抗生素的溶液浇灌植物来维持质粒。三周后，收集植物根部，在无菌水中冲洗三次以去除可见的土壤，并分成两个样品。通过荧光显微镜分析一个根样品，以鉴定候选微生物的定位模式。在10mm长的最细完整植物根上进行显微镜检查。

　　开发用于评估定殖的第二定量方法。对来自接种内生菌的植物的根的全部DNA制备物进行定量PCR试验。玉米的种子(Dekalb DKC-66-40)在2.5英寸×2.5英寸×10英寸的罐中先前高压蒸汽处理的沙中发芽。播种后1天，将1ml内生菌过夜培养物(SOB培养基)在种子所在的位置浸透。1mL的该过夜培养物大约相当于约10^9cfu，取决于使用何种菌株，其彼此在3倍内变化。使用补充有2.5mM或0.25mM硝酸铵的50mL改良型霍格兰溶液(Hoagland’ssolutio)对各幼苗进行施肥，每周3次。播种后4周，收集根部样品进行DNA提取。使用加压水喷雾洗去土壤碎片。然后使用QIAGEN Tissuelyzer将这些组织样品均质化，然后使用QIAmpDNA微型试剂盒(凯杰公司(QIAGEN)根据推荐的方案提取DNA。使用Stratagene Mx3005PRT-PCR对这些DNA提取物进行qPCR试验，使用设计成(使用NCBI的Primer BLAST)对每种内生菌基因组中的基因座具有特异性的引物。对内生菌的基因组拷贝的存在进行定量。为了进一步确认内生菌的种类，对PCR扩增产物进行测序并确认具有正确的序列。表6中显示了来自候选微生物的菌株CI006和CI008的定殖概况。证明菌株CI008中根的定殖率高达10^7xcfu/g fw。

　　表6：通过qPCR测量的玉米的定殖

　　植物中RNA的概况

　　通过测量nif基因的转录来估计植物中nif途径组分的生物合成。由接种CI006的植物(如前所述的接种方法)的根部植物组织中获得总RNA。根据推荐的方案(凯杰公司)使用RNEasy迷你试剂盒进行RNA提取。然后，使用Nanostring元件试剂盒(NanoStringTechnologies有限公司)使用对菌株CI006的基因组中nif基因具有特异性的探针来测试来自这些植物组织的总RNA。植物中nif基因表达的数据总结在表7中。在通过CM013菌株接种的植物中检测到nifH基因的表达，然而在接种CI006的植物中并未检测到nifH表达。菌株CM013是菌株CI006的衍生物，其中已敲除nifL基因。

　　在施肥条件下测量植物中高度表达的CM011基因，通过转录本/百万个千碱基(TPM)进行排序。将控制这些高度表达的基因中的一些的表达的启动子用作同源重组到靶向的氮固定和同化基因座的模板。由温室生长的接种CM011的植物提取RNA样品，使用Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，使用Illumina的Truseq平台进行测序，并将其映射回CM011的基因组。表8列出了来自CM011的高度表达的基因。

　　

　　

　　表7：植物中nifH的表达

　　

　　

　　表8

　　实施例4：跨地理的相容性

　　改善的微生物定殖接种植物的能力对于在田间条件下植物的成功至关重要。虽然所描述的分离方法旨在从与作物植物(如玉米)有密切关系的土壤微生物中进行选择，但许多菌株可能无法在一定范围的植物基因型、环境、土壤类型或接种条件下有效地定殖。由于定殖是一个复杂的过程，其需要微生物菌株与宿主植物之间一系列的相互作用，所以筛选定殖能力已经成为选择优先菌株用于进一步开发的核心方法。评估定殖的早期努力使用了菌株的荧光标记，这是有效的，但是是耗时的且不能在各株菌株基础上扩展。由于定殖活性不适合直接改进，因此必须从天然定殖菌(colonizer)的菌株中选择潜在的候选产物。

　　设计试验以使用qPCR以及设计成在群落样品中具有菌株特异性的引物来测试任何给定宿主植物中野生型菌株的稳定定殖。该测试旨在快速测量来自玉米组织样品的微生物定殖率。使用利用荧光显微镜和基于板的技术评估为可能的定殖菌的菌株的初始测试表明qPCR方法是可定量且可扩展的。

　　典型的试验如下进行：植物，主要为玉米和小麦品种，其在温室中的泥炭盆栽混合物中生长，各菌株6个副本。播种后4或5天，将1mL稀释至OD590为0.6-1.0(大约5E+08CFU/mL)的细菌早期固定相培养物浸液移液到新出芽的胚芽鞘上。只用自来水浇灌植物并允许其生长达四周，然后采样，届时将植物连根拔起并彻底清洗根部以去除大部分泥炭残留物。将干净的根部样品切下并均质化以产生植物细胞碎片和相关细菌细胞的浆液。我们开发了高通量的DNA提取方案，其有效地产生了用作qPCR模板的植物和细菌DNA的混合物。基于细菌细胞掺入实验，该DNA提取过程提供了相对于根部鲜重的定量的细菌DNA样品。使用利用Primer BLAST(Ye 2012)设计的菌株特异性引物来评估各菌株，并与来自未接种植物的背景扩增进行比较。因为一些引物在未接种的植物中表现出脱靶扩增，所以通过扩增的存在或相较于背景水平正确产物的扩增增加来确定定殖。

　　该试验用于测量微生物产物在不同土壤地理学上的相容性。田间土壤质量和田间条件可以对微生物产品的效果具有巨大影响。土壤pH、保水能力和竞争性微生物只是土壤中可以影响接种存活和定殖能力的因素的几个实例而已。使用采样自加利福尼亚农田的三种不同的土壤类型作为植物生长培养基来进行定殖试验(图1A)。使用中间接种密度来接近实际的农业条件。在3周内，菌株5以1E+06至1E+07CFU/g FW定殖于所有植物。植物生长7周后，进化型菌株1在所有土壤类型中表现出高定殖率(1E+06CFU/g FW)。(图1B)。

　　此外，为了评估复杂田间条件的定殖，于2015年6月在圣路易斯奥比斯波启动了1英亩的田间试验，以评估两种玉米田中7种野生型菌株的影响和定殖情况。试验的农艺设计和执行由合同田间研究机构Pacific Ag Research进行。为了接种，采用在接种方法实验中测试的相同的泥炭培养种子包衣技术。在生长季期间，收集植物样品，以评估根部和茎内部中的定殖。播种后4和8周，由各种处理的三个重复样地(plot)中收集样品，并在16周收获前不久，从各种处理的所有六个重复中收集样品。在12周时，由用菌株1和菌株2接种的处理的所有六块重复样地以及未处理的对照组中收集其他样品。与用qPCR和菌株特异性引物的其它定殖试验一起评估每克经洗涤的根鲜重的细胞数目。菌株1和菌株2这两个菌株表现出一致且大面积的根部定殖，其在12周时达到峰值，然后急剧下降(图1C)。虽然菌株2的数量似乎比菌株1的数量低一个数量级，但是发现植物之间的数量较为一致。似乎没有菌株有效地定殖于茎内部。为了支持qPCR定殖数据，使用接种和16S测序从根样品成功地重新分离了两种菌株以鉴定匹配序列的分离。

　　实施例5：微生物育种

　　微生物育种的实例可以总结在图2A的示意图中。图2A描绘了微生物育种，其中可以首先测量微生物组的组成并鉴定感兴趣的物种。微生物组的代谢可以被映射并与遗传相关联。然后，使用包括但不限于偶联和重组，化学诱变，适应性进化和基因编辑的方法可以引入靶向遗传变异。使用衍生微生物来接种作物。在一些实例中，选择具有最佳表型的作物。

　　如图2A中所提供的，可以首先测量微生物组的组成并鉴定感兴趣的物种。图2B描述了测量微生物组步骤的展开图。微生物组的代谢可以被映射并与遗传相关联。氮的代谢可涉及氨(NH4+)从根际经由AmtB转运体进入细菌的胞质溶胶中。氨和L-谷氨酸(L-Glu)由谷氨酰胺合成酶和ATP催化成谷氨酰胺。谷氨酰胺可以导致生物质的形成(植物生长)，并且它还可以抑制nif操纵子的表达。然后，使用包括但不限于偶联和重组，化学诱变，适应性进化和基因编辑的方法可以引入靶向遗传变异。使用衍生微生物来接种作物。选择具有最佳表型的作物。

　　实施例6：使用本公开的微生物的田间试验

　　在自然界，包括在农业土壤中，可以发现多种固氮细菌。然而，微生物向作物提供足够的氮以减少肥料使用的潜力可能受到施肥土壤中固氮酶基因的抑制以及与作物根系密切相关的低丰度的限制。与主要商业作物密切相关的微生物的鉴定、分离和育种可能会破坏和改善连接氮感测和氮固定的调节网络，并释放与作物相关的微生物的显著氮贡献。为此，鉴定了与玉米根系结合并定殖的固氮微生物。

　　收集了来自在农业上相关的土壤中生长的玉米植物的根样品，并从根际和内生物中提取微生物群体。提取来自这些样品的基因组DNA，然后进行16S扩增子测序以分析群落组成。分离蔗糖小迫氏菌微生物(菌株PBC6.1)并通过16S rRNA和全基因组测序对其进行分类。这是一种特别令人感兴趣的氮固定剂，其能够定殖根相关微生物群近21％的丰度(图4)。为了评估对外源性氮的菌株敏感性，使用经典的乙炔还原试验(ARA)和不同水平的谷氨酰胺补充物来测量纯培养物中的氮固定率。该物种在无氮培养基中表现出高水平的固氮活性，而外源性固定的氮抑制了nif基因表达和固氮酶活性(菌株PBC6.1，图3C)。此外，当在固氮条件下生长的PBC6.1的上清液中测量释放的氨时，可以检测到非常少的固定的氮的释放。

　　我们假设，如果重新连接控制氮代谢的调节网络以允许在固定的氮存在的情况下的最佳固氮酶表达和氨释放，那么PBC6.1可能是施肥田间固定氮的重要贡献者。PBC6.1基因组中应当存在足够的遗传多样性以能够进行广泛的表型重塑，不需插入转基因或合成的调节元件。分离的菌株具有至少5.4Mbp的基因组和经典的氮固定基因簇。PBC6.1中的相关氮代谢途径与用于氮固定的模型生物体产酸克雷伯氏菌m5al相似。

　　鉴定了几个遗传调节网络节点，它们可以增加氮固定并随后转移至宿主植物，特别是在高外源性浓度的固定氮下(图3A)。nifLA操纵子通过NifA的转录激活和NifL对NifA的氮和氧依赖性抑制直接调节nif簇的其余部分。nifL的破坏可以消除NifA的抑制并在氧和外源固定氮存在的情况下改善nif表达。此外，在氮不依赖性启动子的控制下表达nifA可以使固氮酶生物合成与NtrB/NtrC氮感测复合物的调节解偶联。通过谷氨酰胺合成酶(GS)将通过微生物固定的氮同化至谷氨酰胺由双结构域腺苷酰基转移酶(ATase)酶GlnE可逆地调节，其通过GS的腺苷酰化和去腺苷酰化作用，以分别减弱和恢复活性。截短GlnE蛋白以使其腺苷酰基去除(adenylyl-removing，AR)结构域缺失可以导致组成型腺苷化的谷氨酰胺合成酶，限制微生物的氨同化并增加胞内和胞外氨。最后，减少负责摄取氨的转运体AmtB的表达可导致更多的胞外氨。为了在不使用转基因的情况下产生合理设计的微生物表型，采用了两种方法：产生编码蛋白质结构域或完整基因的基因组序列的无标志物缺失，和通过基因组内启动子重排来重新连接调节网络。通过迭代诱变过程，产生了PBC6.1的几种非转基因衍生菌株(表9)。

　　表9.本研究中使用的分离和衍生菌株的列表。Prm，衍生自PBC6.1基因组的启动子序列；ΔglnEAR1和ΔglnEAR2，去除了腺苷酰基去除结构域序列的glnE基因的不同截短形式。

　　

　　

　　进行了几种体外试验以表征衍生菌株的特定表型。ARA用于评估菌株对外源性氮的敏感性，其中PBC6.1在高谷氨酰胺浓度下表现出固氮酶活性的抑制。相反，大多数衍生菌株在高谷氨酰胺浓度下表现出表型降低和不同程度的乙炔还原水平。通过qPCR分析的样品中nifA的转录率与乙炔还原率良好相关，从而支持nifL破坏和插入独立于氮的启动子以驱动nifA可以导致nif簇脱抑制的假设。相较于野生型或没有这些突变的衍生菌株，具有改变的GlnE或AmtB活性的菌株显示出显著增加的铵排泄率，说明了这些基因型对氨同化和再摄取的影响。

　　进行了两个实验以研究PBC6.1衍生物与玉米植物的相互作用并定量固定氮向植物组织中的纳入。首先，在使用同位素示踪剂的温室研究中定量微生物固氮率。简言之，使用15N标记的肥料使植物生长，并且植物组织中15N的稀释浓度表明来自微生物的固定氮的贡献。使用选定的微生物菌株接种玉米幼苗，并使植物生长至V6生长期。随后解构植物以测量微生物定殖和基因表达并通过同位素比质谱法(IRMS)测量植物组织中的15N/14N比。气生组织(aerial tissue)的分析显示PBC6.38对植物氮水平的贡献很小，但不显著，而PBC6.94的贡献显著(p＝0.011)。PBC6.94产生了地上玉米叶片中大约20％的氮，其余的来自种子、盆栽混合物或其它土壤携带微生物的“背景”固定。这说明了我们的微生物育种路线可以产生能够在氮肥存在的情况下对植物产生显著氮贡献的菌株。测量植物组织内的微生物转录，并在衍生菌株中观察到nif基因簇的表达，但未在野生型菌株中未观察到，这表明nif脱抑制对于施肥条件下BNF对作物的贡献的重要性。通过qPCR测量的根定殖表明，定殖密度对于各种测试的菌株是不同的。在PBC6.38与PBC6.94之间观察到50倍的定殖差异。这种差异可以表明，由于高水平的固定和排泄，PBC6.94相对于PBC6.38降低了根际适应性。

　　方法

　　培养基

　　基本培养基含有(每升)：25g Na2HPO4，0.1g CaCL2-2H2O，3g KH2PO4，0.25gMgSO4·7H2O，1g NaC1，2.9mg FeCl3，0.25mg Na2MoO4·2H2O和20g蔗糖。定义生长培养基为每升补充了50ml的200mM谷氨酰胺的基本培养基。

　　固氮细菌的分离

　　在从收集自加利福尼亚州圣华金县土壤中，玉米幼苗从种子(DKC 66-40，伊利诺伊州迪卡尔布)在22℃(夜间)至26℃(白天)的温室环境中生长两周，并暴露于16小时的光照周期。收获根部并用无菌去离子水洗涤以除去大量土壤。将根组织用组织切割器(TissueLyser II，Qiagen P/N 85300)中的2mm不锈钢珠匀浆3分钟，设定为30，并将样品以13,000rpm离心1分钟，以由根相关细菌中分离组织。将上清液分成两个等份，一个等份用于通过16S rRNA扩增子测序表征微生物组，而剩余的等份经过稀释并接种到补充有1.5％琼脂的无氮肉汤(NfB)培养基上。将板在30℃下孵育5-7天。使用引物Ueda19f和Ueda406r，通过菌落PCR测试出现的菌落中nifH基因的存在。将来自具有阳性nifH菌落PCR的菌株的基因组DNA分离(QIAamp DNA迷你试剂盒，目录号51306，凯杰公司，德国)，并对其进行测序(Illumina MiSeq v3，SeqMatic，加利福尼亚洲菲蒙市)。在序列组装和注释后，将含有氮固定基因簇的分离物用于下游研究。

　　分离幼苗的微生物组概况

　　使用ZR-96基因组DNA I试剂盒(Zymo Research P/N D3011)由根部相关细菌分离基因组DNA，并使用靶向799f和1114r的nextera条码化的引物产生16S rRNA扩增子。扩增子文库经纯化并用Illumina MiSeq v3平台(SeqMatic，加利福尼亚洲菲蒙市)测序。使用利用minikraken数据库的Kraken对读数进行分类学分类。

　　乙炔还原试验(ARA)

　　使用乙炔还原试验的修饰形式来测量纯培养条件下的固氮酶活性。菌株以单菌落在SOB(RPI，P/N S25040-1000)中以30℃和200RPM振摇下繁殖24小时，然后以1∶25传代培养至生长培养基中，并在需氧条件下生长24小时(30℃，200RPM)。然后将1ml的基本培养基培养物添加到气密的Hungate管中补充有0至10mM谷氨酰胺的4ml基本培养基中，并在厌氧条件下生长4小时(30℃，200RPM)。去除10％顶部空间，然后通过注射用等体积的乙炔代替，并继续孵育1小时。随后，通过气密注射器去除2ml顶部空间，用于使用装配有火焰离子化检测器(FID)的Agilent 6850气相色谱仪对乙烯产生进行定量。

　　铵排泄试验

　　使用分批发酵在厌氧生物反应器中测量氨形式的固定氮的排泄。菌株从单菌落在96孔DeepWell板中的1ml/孔SOB中繁殖。将板在30℃下孵育并以200RPM振摇24小时，然后1∶25稀释到含有1ml/孔生长培养基的新鲜板中。孵育细胞24小时(30℃，200RPM)，然后1∶10稀释到含有基本培养基的新鲜板中。将板转移至厌氧腔室，其具有＞98.5％氮，1.2-1.5％氢和＜30ppM氧的气体混合物，并以1350RPM在室温下孵育66-70小时。通过测量590nm处的光密度，初始培养物生物量与结束时的生物量进行比较。然后，通过离心分离细胞，并在各时间点使用针对生物量标准化的Megazyme氨试验(Megazyme Ammonia Assay)试剂盒(P/N K-AMIAR)测试来自反应器肉汤的上清液的游离氨。

　　根相关微生物组的提取

　　轻轻摇动根部，以除去松散的颗粒，然后分离根系并浸入RNA稳定化溶液(ThermoFisher P/N AM7021)中30分钟。然后用无菌去离子水短暂地冲洗根部。在组织切割器(TissueLyser II，Qiagen P/N 85300)中使用具有1/2英寸不锈钢球的珠在2ml切割缓冲液(Qiagen P/N 79216)中进行珠磨，以将样品均质化。使用ZR-96Quick-gDNA试剂盒(ZymoResearch P/N D3010)进行基因组DNA提取，并使用RNeasy试剂盒(Qiagen P/N74104)进行RNA提取。

　　根定殖试验

　　播种后4天，将1ml细菌过夜培养物(109cfu)施加至播种的种子上方的土壤。使用补充有0.5mM硝酸铵的25ml改良Hoagland溶液对幼苗施肥，每周三次。播种四周后，收集根样品并提取总基因组DNA(gDNA)。使用具有这样的引物的qPCR对根部定殖进行定量，所述引物设计成扩增野生型或衍生菌株基因组的独特区域。使用产生自靶基因组已知量的gDNA的标准曲线测量QPCR反应效率。使用组织重量和提取体积将数据标准化为基因组拷贝/g鲜重。对于各实验，将定殖数与未处理的对照幼苗进行比较。

　　植物中的转录组学

　　在如根定殖试验中所述生长和处理的幼苗中测量根相关微生物的转录概况。使用Illumina NextSeq平台(SeqMatic，加利福尼亚非蒙市)对纯化的RNA进行测序。将读数映射到接种菌株的基因组，其使用bowtie2，使用“-非常敏感-局部”参数和最小比对评分30。使用samtools计算整个基因组的覆盖率。将差异覆盖度标准化至管家基因表达，并使用Circos对整个基因组进行可视化，和使用DNAplotlib对整个nif基因簇进行可视化。此外，经由靶向的Nanostring分析对植物中转录谱进行定量。在nCounter Sprint(CoreDiagnostics，加利福尼亚州海沃德)上处理纯化的RNA。

　　15N稀释温室研究

　　进行15N肥料稀释实验，以评估植物中优化的菌株活性。使用蛭石和洗过的沙子(在DI H2O中漂洗5次)的混合物制备含有最小背景N的播种培养基。将沙子混合物在122℃下高压蒸汽处理1小时，在40立方英寸(656mL)的罐中测量大约600g，将其用无菌DI H2O饱和并允许在种植前24小时将其沥干。将玉米种子(DKC 66-40)在0.625％次氯酸钠中表面灭菌10分钟，然后在无菌蒸馏水中漂洗5次并种植在1cm深处。将植物在荧光灯下维持4周，16小时日照长度，室温下，平均22℃(夜间)至26℃(白天)。

　　播种后5天，直接浸入新兴胚芽鞘上的1ml细胞悬液接种幼苗。由SOB中的5ml过夜培养物制备接种物，将其离心沉淀并在5ml PBS中重悬两次以除去残留的SOB，然后最终稀释至OD为1.0(大约109CFU/ml)。使用无菌PBS处理对照植物，并将各种处理施用于10个重复植物。

　　植物在播种后5、9、14和19天，用含有2％15N富集的2mM KNO3的25ml肥料溶液施肥，并且在播种后7、12、16和18天，用不含KNO3的相同溶液施肥。肥料溶液包含(每升)：3mmol CaCl2、0.5mmol KH2PO4、2mmol MgSO4、17.9μmol FeSO4、2.86mg H3BO3、1.81mgMnCl2·4H2O、0.22mg ZnSO4·7H2O、51μg CuSO4·5H2O、0.12mg Na2MoO4·2H2O和0.14nmolNiCl2。根据需要，用无菌DI H2O浇灌所有盆，以保持土壤水分恒定而不会产生径流。

　　在四周时，收获植物，并以最低节点分离成用于根gDNA和RNA提取的样品以及用于IRMS的气生组织。根据需要擦拭气生组织以除去沙子，将其整个置于纸袋中并在60℃下干燥至少72小时。一旦完全干燥，通过珠磨将全部气生组织均质化，并由MBL稳定同位素实验室(The Ecosystems Center，马萨诸塞州伍兹霍尔)通过同位素比质谱(IRMS)分析5-7mg样品的δ15N。使用下述公式计算NDFA百分比：％NDFA＝(UTC平均值的δ15N-样品的δ15N)/(UTC平均值的δ15N)x100。

　　实施例7：用于检测非属间工程改造的微生物的方法和试验

　　本公开教导了可用于检测各种前述实施例中所利用的微生物的引物、探针和试验。该试验能够检测衍生的/突变的非属间微生物中的非天然核苷酸“连接”序列。这些非天然存在的核苷酸连接可以用作诊断类型，其指示微生物中存在特定遗传改变。

　　本技术能够经由利用专门的定量PCR方法，包括独特设计的引物和探针，来检测这些非天然存在的核苷酸连接。探针可以与非天然存在的核苷酸连接序列结合。也就是，可以使用由用荧光报道物标记的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针，其仅在该探针与其互补序列杂交后才允许检测。该定量方法可确保仅有非天然存在的核苷酸连接将通过教导的引物扩增，并且因此可以经由非特异性染料或经由利用特异性杂交探针进行检测。该方法的另一个方面是选择引物，以使所述引物在连接序列的任一侧，使得如果发生扩增反应，那么存在所述连接序列。

　　因此，基因组DNA可从样品中提取，并用于通过使用qPCR来定量本发明的微生物的存在。qPCR反应中利用的引物可以是通过Primer Blast(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计的引物，以扩增野生型基因组的独特区域或工程改造的非属间突变菌株的独特区域。进行qPCR反应可以使用SYBR GreenER qPCR SuperMix通用(赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)P/N 11762100)试剂盒，仅使用正向和反向扩增引物；或者，κ探针力试剂盒(卡帕生物系统公司(Kapa Biosystems)P/N KK4301)可以联用扩增引物和TaqMan探针，其在包含5'端的FAM染料标记，内部的ZEN淬灭剂，和3'端的小沟结合剂和荧光淬灭剂(整合DNA技术公司(Integrated DNA Technologies))。

　　表10：工程改造的非属间微生物

　　

　　

　　

　　实施例8：变栖克雷伯氏菌(Kliebsiella variicola)和蔗糖小迫氏菌(Kosakoniasacchari)的鉴定

　　出于多种原因，使用16S rRNA基因序列研究细菌的系统发育和分类学到目前为止是所用最常见的管家基因标志物。这些原因包括：(i)它几乎存在于所有细菌，常常以多基因(muitigene)家族，或操纵子存在；(ii)16S rRNA基因的功能未随时间变化，这表明随机序列变化是更准确的时间(进化)度量；和(iii)16S rRNA基因(1.500bp)大小足够用于信息学目的。

　　通过PCR分析确定变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)和蔗糖小迫氏菌(Kosakonia sacchari)的16S rRNA基因的核苷酸序列。使用的引物是通用16S引物，其具有下述核苷酸序列：

　　正向16S引物27f(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)

　　反向165引物1492r(GGTTACCTTGTTACGACTT)。

　　对所得PCR产物进行测序，并将所得的序列与美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行比较，用于在原始分离过程中进行物种鉴定。在微生物的任何后期生产中，进行相同的PCR分析，以确保经过验证的纯微生物没有污染。

　　通过该方法鉴定了两种亲本菌株。第一种的科学名称是变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。通过对生物体的16S rRNA进行多次测序并使用NCBI数据库中的BLAST进行属和物种验证来确定物种种类。此外，对生物体的整个基因组进行了测序，并对提取的16S rRNA(来自基因组序列)进行BLAST处理。将该序列与先前确定的16S rRNA序列进行比对以确认该生物体被分离为纯培养物。

　　第二种生物体的科学名称是蔗糖小迫氏菌(Kosakonia sacchari)。通过对生物体的16S rRNA进行多次测序并使用NCBI数据库中的BLAST进行属和物种验证来确定物种种类。此外，对生物体的整个基因组进行了测序，并对提取的16S rRNA(来自基因组序列)进行BLAST处理。将该序列与先前确定的16S rRNA序列进行比对以确认该生物体被分离为纯培养物。

　　实施例9：具有定殖或氮固定活性增加的重塑菌株

　　开发了几种突变菌株以研究可以增加定殖能力、氮固定活性或氮排泄的新型修饰。这些菌株总结在表11中。启动子和基因序列列于表12中。相对于野生型或相对于亲本菌株，评估了重塑菌株以确认对于氮还原活性(图6、18、20、22A，22B，24、26A，26B，34和36)，氮排泄(图14、15、16、17、19、21、23A，23B，25，27A，27B，33和35)，体外定殖(图7、8、9、10、11)和温室定殖(图28、29、30、31、32、37和38)的修饰基因的表达改变(图5、12和13)。如下所述进行铵排泄试验。表13和表14中进一步总结了一些数据。

　　

　　

　　

　　

　　表11：重构菌株

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　

　　表12：启动子和基因序列。启动子序列以小写字母列出，基因序列以大写字母列出。在缺失突变的情况下，缺失前的序列以小写字母列出，而缺失后的序列以大写字母列出。

　　方法：铵排泄试验

　　1.挑选菌落并在30℃下于96孔深孔板富集培养基中培养过夜

　　2.使用过夜培养物以将培养物接种到补充有10mM谷氨酰胺(gln)的ARA培养基(无N培养基)中的培养物(也在96孔板中)

　　3.使用ARA+gln中的培养物将培养物接种到没有gln的ARA中的培养物

　　4.转移到厌氧腔室中并在室温下摇动孵育3天

　　5.离心具有细胞的96孔板，并去除上清液的样品

　　6.使用Megazyme铵试验试剂盒来测试培养基中的铵浓度

　　表13

　　

　　表14

　　

　　实施例10：毒理学研究

　　为了确认变栖克雷伯氏菌和蔗糖小迫氏菌的人或哺乳动物毒性，对这些生物进行了毒性研究。承包商是Smithers Avanza毒理学服务公司，该公司在毒理学研究方面拥有丰富的经验。

　　该研究的目的是确定单次皮下注射后细菌分离株对小鼠的毒性。CD-1小鼠用于使每公斤体重的细菌分离株数量最大化。选择皮下途径是因为其是将细菌分离株接种到动物的合适途径，并且它最能模拟最可能暴露于微生物的人。

　　使用变栖克雷伯氏菌和蔗糖小迫氏菌细菌分离株的处理并不影响小鼠的死亡率，所有的动物都存活，直到研究结束时计划终止。在整个研究过程中，变栖克雷伯氏菌和蔗糖小迫氏菌处理组中的任何动物的临床观察均未见异常。此外，在笼侧(cageside)观察期间未发现异常。此外，对于变栖克雷伯氏菌和蔗糖小迫氏菌处理组，皮肤观察没有异常。所有组的小鼠体温均正常，平均温度范围为36.66℃-37.62”C。在变栖克雷伯氏菌和蔗糖小迫氏菌处理组中，小鼠的体重略有减轻，但这在本研究中以及根据此类研究的历史数据的小鼠的正常范围内。这项研究的结果证实，分离株不会对人或其他哺乳动物造成毒性或致病性。

　　该研究的目的是确定单次皮下注射后细菌分离株对小鼠的毒性。CD-1小鼠用于使每公斤体重的细菌分离株数量最大化。选择皮下途径，因为它是将细菌分离株接种到动物的合适途径。

　　于2017年6月8日从查尔斯河育种实验室(Charles River Breeding Labs)接收了约8周龄的45只原初CD-1雌性小鼠。将动物分组饲养(每笼5只动物)在装有硬木草垫的聚碳酸酯笼子中。给动物随意喂食经认证的全球Teklad实验室饮食2018(颗粒)，并通过水瓶提供饮用水。动物房的环境控制设置为维持20-26℃的温度，30-70％的相对湿度，每小时至少10次换气，和12小时的光照/12小时黑暗的周期。

　　将40只小鼠随机分为八组，每组5只小鼠。多余的动物被转移到训练/种群中。如表15所示处理动物。

　　表15：研究设计

　　

　　表15：使用的菌株

　　测试物品由资助者以现成剂量形式提供。在研究日(SD)1，在肩胛骨前区域通过皮下注射对所有动物给药一次。

　　每天进行身体检查，每天两次进行笼侧观察。每天还根据表16进行皮肤观察。表17-27列出了其他观察结果。

　　表16：皮肤观察

　　在给药前(SD 1)和终止前(SD 8)记录体重。在终止前(SD 8)测量体温。在SD 8的最终数据收集后，将动物通过吸入CO2进行安乐死，然后进行后颈脱位并丢弃而无需尸检。

　　用任何细菌分离株的处理均不会影响死亡率。所有动物均存活直至预定的终止。

　　在体格检查期间记录临床观察。在整个研究过程中，没有任何动物出现异常。

　　在笼侧观察期间未发现异常。

　　进行皮肤Draize观察。第6组的一只动物从SD 7开始直至观察期结束(SD8)表现出最小的水肿和红斑。第7组的一只动物从SD 5开始到观察期结束显示出轻度红斑(SD 8)。在第8组中，从1-4天在两只动物中观察到最小或轻度水肿。于SD 7到SD 8在动物22029(8f)中观察到轻度红斑，并于SD 5到SD 6在动物22032(8f)中观察到中度红斑，其在SD 7和8时出现最小的红斑。

　　记录体重和体重变化。第1、2、3、5、6和8组在整个研究中损失的体重最小，平均百分比变化范围为-1.91％至-6.87％。在整个研究中，第4组和第7组的体重增加最小，平均变化百分数分别为0.31％和2.73％。

　　追踪体温。所有组的体温均正常，平均温度为36.66℃至37.62℃。

　　实施例10：田间试验

　　可以进行田间试验，以评估各种氮方案下Pivot菌株对玉米生长和生产力的功效。

　　材料和方法

　　实验设计：分隔样地设计，以N比率作为主样地，将处理作为子样地。

　　位置：在阿根廷的三个地理位置不同的样地。

　　数据：在播种后1周内提供地理参考TAG坐标，田间样地，处理位置和解码器(Decoder)图。

　　处理：5个主样地：-100％、100％-25磅.、100％-50磅、100％-75磅、0％。

　　14个子样地种子处理(AGT提供的处理后种子)

　　氮时机：种植前尿素或其他批准的最佳管理方法。

　　重复：6

　　样地：各位置420个。

　　杂交体：由AgriThority提供，一种用于北部位置，而另一种用于南部位置。

　　没有生物应用于种子。

　　样地尺寸最小值：30’长的4行(总计约3英亩)

　　观察值：所有观察值(除非另有说明)均取自样地的中心2行。所有破坏性采样均应从外侧行进行。

　　维持样品：将处理的种子样品冷藏至使用。在需要使用前1.5到2个小时从冰箱中取出样品。

　　肥料施用：合作者在施用前提供推荐的肥料用量并获得Pivot Bio的同意。

　　当地农业：实践

　　·种子：商业玉米(已提供)，应用了商业种子处理，无生物剂播种率：当地实践。

　　·播种时间：当地实践。

　　·当地标准的生产惯例：杂草、昆虫管理等

　　·除杀真菌剂施用外，应遵循标准管理规范。杀真菌剂施用需要咨询客户。

　　·记录所有农业实践，遵循作物种植。

　　土壤表征

　　土壤质地

　　土壤肥力分析

　　ο为了确定氮肥料水平，采集各位置种植前的土壤样品，以确保0-12”和可能12”-24”硝酸盐氮低于50磅/英亩。完成标准土壤测试以及硝酸盐氮，铵态氮，总氮，有机质和CEC。直接发送到实验室，

　　ο可接受的氮响应度。0和100％氮施肥之间的高Δ产量。

　　οpH、CEC、总K和P，

　　标准土壤采样程序，例如，土芯0cm-30cm和30cm-60cm。

　　ο在播种和施肥之前，收集Pivot Bio土壤样品——与UTC相距0至6-12英寸处的2ml土壤样品。使用中间的一行，各氮区域每次重复收集一个样品。(5种肥料方案×6个重复＝30个土壤样品)。送至Pivot Bio。

　　ο播种后(V4-V6)，收集Pivot土壤样品——与UTC相距0至6-12英寸处的2ml土壤样品。使用中间的一行，各氮区域每次重复收集一个样品。(5种肥料方案×6个重复＝30个土壤样品)。

　　ο收获后，收集Pivot土壤样品——与UTCV相距0至6-12英寸处的2ml土壤样品。使用中间的一行，各氮区域每次重复收集一个样品。(5种肥料方案×6个重复＝30个土壤样品)。

　　ο收获后，土壤样品来自位于0-12”和可能的12”-24”的各位置。完成标准土壤测试以及硝酸盐氮，铵态氮，总氮，有机质和CEC.直接发送到实验室。

　　ο来自各肥料方案0-12”和12”-24”处的V6-V10土壤样本(不包括对于所有肥料方案的100％和100％+25磅[在100％区块中]处理)。完成标准土壤测试以及硝酸盐氮，铵态氮，总氮，有机质和CEC.直接发送到实验室。(5种方案×2个深度＝10个样品/位置)。

　　ο来自各肥料方案0-12”–24”处的收获后土壤样本(不包括对于所有肥料方案的100％和100％+25磅[在100％区块中]处理)。完成标准土壤测试以及硝酸盐氮，铵态氮，总氮，有机质和CEC.直接发送到实验室。{5种方案×2个深度＝10个样品/位置}。

　　评估

　　·温度探针(持续监控)

　　·初始植物群体，以约50％的UTC

　　·收获前的最终植物群体

　　·活力(1至10数值范围，w/10＝优秀)V4和V8-V10

　　·植物高度V8-V10和V14

　　·产量(Bu/英亩)，调整至标准湿度百分比

　　·测试重量

　　·水分含量％

　　·黑色层处的秸秆硝酸盐测试(420个样地X 7个位置)

　　·定殖。将各样地的1个植物放入拉链袋中，以0％和100％肥料，在V4–V6时(1个植物*14种处理*6个重复*2种肥料方案＝168种植物)

　　·转录组学。将各样地的1个植物放入管中，以0％和100％肥料，在V4–V6时(1个植物*14种处理*6个重复*2种肥料方案＝168种植物)

　　·定殖。将各样地的1个植物放入拉链袋中，以0％和100％肥料，在V10V12时(1个植物*14种处理*6个重复*2种肥料方案＝168种植物)

　　·在两个时间点(V4-V6和VT)使用Greenseeker仪器进行NDVI或NDRE测定

　　ο在所有7个位置评估各样地(420个样地X 2个时间点X 7个位置)

　　·测量所有7个位置R2和R5之间的茎特征。

　　ο记录10株植物/样地的6英寸高处的茎秆直径

　　ο记录第一个节间长度超过6英寸的标记

　　ο监控了10个植物，从两个内部行的中心的5个连续植物

　　ο7个位置(420个样地X 7个位置)

　　a.监控时间表

　　AgriThority专业人士将在V3-V4阶段访问所有试验，以评估对处理的早季应答以及在生殖生长期间监测成熟度

　　根据条件和客户的需求与Pivot进行联合访问。

　　b.天气信息

　　从种植到收获的天气数据包括：

　　·每日最高和最低温度，

　　·播种时的土壤温度

　　·每日降雨加灌溉(如果有)

　　·不寻常的天气事件，例如过多的雨，风，冷，热

　　c.数据分析和报告

　　·AgriThority在8月1日之前提供Pivot季中报告，在11月30日之前提供功能性草案，在12月31日之前提供最终报告

　　·可以协商其他报告

　　·在完成试验后，合作者将在2016年11月15日之前以Excel格式将复制数据(原始数据)提供给AgriThority(已提供)，包括播种布局图。

　　·报告应包括所有相关信息，包括以下内容：

　　·土壤质地和检测报告

　　·行距，样地大小，灌溉和施水记录，耕作，先前作物

　　·播种率和植物群体

　　·季节的肥料输入——来源，比率，时间，位置

　　·农业投入(例如，灌溉，使用的除草剂等)

　　·收获面积

　　·收获方式——手，机器，测量工具(天平，产量监控器等)。

　　表17

　　

　　表18

　　

　　表19

　　

　　表20

　　

　　表21

　　

　　表22

　　

　　表23

　　

　　表24

　　

　　表25

　　

　　表26

　　

　　表27

　　

　　虽然本文显示和描述了本发明的优选实施方式，但本领域技术人员显然了解这些实施方式仅以举例方式提供。本领域技术人员在不背离本发明的情况下可以作出多种改变、变化和替代。应理解，本文所述的本发明实施方式的各种替代形式可用于实施本发明。所附权利要求书确定了本发明范围，这些权利要求范围内的方法和结构以及其等同物均为本发明所涵盖。