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一种具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌及其应用

2023-03-19 04:03:08

一种具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌及其应用

　　技术领域

　　本发明属于生物技术领域或者土壤重金属生物修复技术领域，具体涉及一种具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌及其应用。

　　背景技术

　　镉(Cd)是生物毒性极强的一种重金属元素，在环境中的化学活性强、移动性大、毒性持久，Cd2+广泛存在于土壤和水体中，会随着食物链进入人体，大量的镉积累在体内会有致畸、致癌和致突变作用。研究表明pH值可以影响稻田土壤重金属镉形态。一般情况下，土壤中pH值降低，将造成大量的重金属镉活化，促使农作物对镉的吸收，pH值升高则有利于增强土壤对镉的吸附量，从而发生沉淀作用，引起可交换态下降，但pH过高将促进碳酸盐的溶解，再次使得镉被“活化”。因此，合理的调控土壤的pH值将对降低重金属镉的生物有效性有重大的意义，据大量研究调查中国农田酸化加剧是由于大量氮肥和磷肥的不合理使用，在近30年内，土壤pH值平均下降1.2-1.5个单位。农田的酸化是导致了土壤中镉的生物有效性上升的重要原因。对于镉污染土壤的修复方法有物理修复、化学修复和生物修复：化学方法如，沉淀和胶结。物理方法，如离子交换，溶剂萃取，膜过滤和活性炭吸附。生物镉去除方法，主要有吸附和沉淀两种。生物吸附是细胞分泌的胞外多糖或生物大分子物质如草酸、苹果酸等鳌合Cd2+。生物沉淀是生物可以使游离态的Cd2+形成CdS或Cd(OH)2沉淀而达到去除的目的。与物理和化学方法相比，生物去除法具有价格便宜，环境友好等优点，而受到人们的关注。研究表明生物修复能够有效的降低重金属镉的生物有效性，减少作物的吸收，保障农产品安全。

　　芽孢杆菌广泛地存在于自然界，具有繁殖快速、代谢快、对环境适应性强和耐逆性强等特点。芽孢杆菌能够在重金属污染的环境中存活和生长，一方面，芽孢杆菌可以吸附土壤颗粒中的重金属镉，另一方面，它可以影响土壤的一些理化性质，如pH、有机质等降低土壤中重金属镉的生物有效性，从而降低重金属镉对植物的毒害作用。因此筛选能够产碱的芽孢杆菌应用在酸性土壤，微调酸性土壤的作物根际pH，从而降低植物根际镉的生物有效性。

　　本研究将从镉污染土壤中筛选出具有较强耐镉能力、且能在不同发酵条件下产碱的微生物，以期微调酸性土壤的作物根际pH，降低重金属镉的生物有效性，达到提高蔬菜及作物产量和品质的目的。实现在轻度、中度重金属镉污染土壤上生产安全蔬菜，为发展土壤重金属污染微生物修复技术提供理论支撑。

　　发明内容：

　　针对现有的技术缺陷，本发明的目的在于分离筛选一株能高效阻控环境中镉的产碱菌株，通过对该菌株的应用，修复环境中镉的污染。

　　本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

　　一株具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌菌株，该菌株分类命名为高地芽孢杆菌XT-4Bacillus altitudinis XT-4，于2019年5月20日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019370；保藏地址：中国武汉市武汉大学。申请人分离、筛选得到1株能高效去除镉(Cd)的微生物菌株，根据经典微生物学形态特征分类和生物信息学分类，对该菌株进行分类和命名。

　　上述的高地芽孢杆菌菌株在钝化土壤重金属镉中的应用。

　　上述的高地芽孢杆菌菌株在制备微生物有机肥料中的应用。

　　一种微生物有机肥料，该微生物有机肥料中包含上述的具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌菌株。

　　作为一种优选技术方案，上述的具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌菌株在微生物有机肥料中的含量不低于1.0×102CFU/g。

　　本发明的有益效果：

　　本发明提供一株具有产碱能力、生长速度快、对环境适应性强和耐逆性强的菌株；该菌株通过产碱改善作物根际微生态及分解和降解土壤有机物为小分子，供作物利用，从而能够显著提高蔬菜及作物产量和品质；该菌株用于制备具有发酵产碱功能的微生物有机肥料效果显著。本发明分离筛选能高效去除环境中镉的产碱菌株，通过微生物的应用，修复环境中镉的污染。

　　附图说明

　　图1：本发明的高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis XT-4的系统发育进化树图。

　　图2：本发明的高地芽孢杆菌XT-4不同pH条件下产碱特性研究。

　　图3：本发明的高地芽孢杆菌XT-4不同pH条件下对培养基中镉去除，以及pH变化的曲线图。附图标记说明：图3中的A，C图起始Cd浓度为10μM，pH＝5时，XT-4的pH变化及镉去除曲线图；图3中的B，D图是起始Cd浓度为10μM，pH＝5.5时，XT-4的pH变化及镉去除曲线图。

　　图4：本发明的高地芽孢杆菌XT-4在盆栽试验中土壤pH变化图。附图标记说明：土壤中(化肥+不接菌，化肥+102cfu/g dw，化肥+104cfu/g dw，有机肥+不接菌，有机肥+102cfu/g dw，有机肥+104cfu/g dw)试验组中土壤pH变化图。

　　图5：本发明的高地芽孢杆菌XT-4在盆栽试验中使有效镉变化的柱形图。附图标记说明：土壤中(化肥+不接菌，化肥+102cfu/g dw，化肥+104cfu/g dw，有机肥+不接菌，有机肥+102cfu/g dw，有机肥+104cfu/g dw)试验组中土壤有效态镉含量图。

　　图6：本发明的高地芽孢杆菌XT-4在盆栽试验中蔬菜地上部分总镉变化的柱形图。附图标记说明：土壤中(化肥+不接菌，化肥+102cfu/g dw，化肥+104cfu/g dw，有机肥+不接菌，有机肥+102cfu/g dw，有机肥+104cfu/g dw)试验组中蔬菜地上部分总镉变化的柱形图。

　　具体实施方式：

　　实施例1：高地芽孢杆菌XT-4的分离鉴定

　　(1)样品采集：土壤的采集和分离地点为湖南省湘潭市镉污染的农田表层土壤。

　　(2)抗镉菌株的分离筛选：准确称取5g湘潭土壤到含有100mL无菌水的250mL锥形瓶中，30℃、200rpm摇床震荡48h使土壤完全分散，静置5min后，在超净台中取1mL土壤上清液于1.5mL无菌离心管中。将100μL土壤上清液与900μL无菌水充分混合，得到10-1稀释液，用相同方法，得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8一系列稀释液，供涂布平板用。取稀释度为10-5、10-6、10-7、10-8的土壤稀释液100μL，涂布于含0.15mM Cd的LB培养基平板上，平板倒置放于30℃培养箱中，培养5天。观察菌落形态、颜色、湿润程度、光泽度等，挑取不同的菌落于LB液体试管中，试管放于摇床中震荡培养，再将菌液平板划线进行纯化，得到单菌落。配制常用的LB液体培养基，配方如下(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，补充蒸馏水至1L。在121℃高压蒸汽下灭菌20min。

　　(3)产碱菌株的筛选：将步骤(2)中得到的镉抗性菌单克隆转接到M9培养基中，调节pH至5.0，5.5和7.0，将配制后的培养基置于28℃摇床中振荡培养，每隔12小时取一次样，测定溶液的pH变化，筛选能高效产碱的菌株。本发明筛选的高地芽孢杆菌XT-4不同pH条件下产碱特性研究结果如图2所示。M9培养基：1.5g Na2HPO4·12H2O,1.5g KH2PO4,1.0g(NH4)2SO4,0.2g MgSO4·7H2O,0.01g CaCl2·2H2O,0.001g FeSO4·7H2O,and pH 7.2，水1000ml。

　　(4)产碱菌株的分类鉴定：通过扩增16S rRNA的部分核苷酸序列进行基因型鉴定。采用原核生物16S rRNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')和1492R(5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3')做PCR。扩增芽孢杆菌XT-4的16S rRNA并测序(如SEQ ID No.1所示)，再与NCBIGenBank核苷酸数据库进行比对，本发明分离的芽孢杆菌XT-4与高地芽孢杆菌的核苷酸序列同源性为98.96％。采用MEGA6.0软件构建系统发育进化树，发现本发明分离的芽孢杆菌XT-4能稳定地与芽孢杆菌属的菌株聚在一起(见图1)，将该菌株鉴定为Bacillus altitudinis XT-4。

　　(5)菌株XT-4的形态及生理生化特性：高地芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，能够产生芽孢；LB琼脂平板上生长速度较快，菌落近圆形，黄色，边缘不整齐，无光泽度，菌落不透明，菌株在LB液体培养基上发酵产碱，使发酵液的pH值升高到pH8.5以上；能以苹果酸钠、葡萄糖、丙酮酸钠、酵母膏、柠檬酸钠、丁二酸钠为唯一碳源生长；pH生长范围较广，可耐pH4.0-10.0。

　　(6)Bacillus altitudinis XT-4的保藏：Bacillus altitudinis XT-4可以在LB液体或固体培养基上在37℃培养，培养后可在4℃下作短期保藏。若长期保藏，可使用甘油冷冻管或冷冻干燥管保藏菌株的方法比较合适。该菌株于2019年5月20日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2019370；保藏地址为中国武汉市武汉大学。

　　实施例2：Bacillus altitudinis XT-4的pH变化及镉去除曲线

　　挑取菌株XT-4的单克隆接种到100mL的LB液体培养基，于30℃摇床中振荡培养至OD600nm为0.5左右，将其作为种子液，以1％(体积)的接种量接种于新鲜的100mL M9液体培养基(起始OD600≈0.01)，调节pH至5.0，5.5和7.0，并向培养基中添加10μM的CdCl2。将配制后的培养基置于30℃摇床中振荡培养，每隔12小时取一次样，测定溶液的pH变化，并同时测定溶液中剩余的Cd含量。溶液中镉浓度可用氢火焰原子吸收仪(AAS)进行测定。如图3所示：在培养基初始pH为5.0和5.5处理条件下，结果均显示培养基上清液中Cd离子浓度随着菌株XT-4在培养基中的OD600的增加而降低，培养基pH升高逐渐增强，培养基中OH-离子变多，而当菌株生长进入稳定期时，细菌数处于平衡状态，培养基中Cd离子浓度也趋于稳定。36h时后镉的去除率分别为95.99％和96.50％。

　　实施例3：小白菜盆栽实验

　　盆栽试验土壤取自湘潭镉污染的蔬菜土壤，将其自然风干后过2mm筛网，每盆(规格：口径9cm、高7cm)分装0.5kg土样。试验分为4个处理组(即：处理组1：向土壤中加入有机肥，并加入终浓度为1×102CFU/g的组合菌液；处理组2：向土壤中加入2％(质量)有机肥，并加入终浓度为1×104CFU/g的组合菌液；处理组3：向土壤中加入与有机肥N、P、K含量相当的化肥，并加入终浓度为1×102CFU/g的菌液；处理组4：向土壤中加入化肥，并加入终浓度为1×104CFU/g的菌液；每组设置4个重复。试验用蔬菜品种为小白菜“上海青”(Brassica rapassp.chinensis,cv.Shanghaiqing)，取播种后两周苗高为7-10cm长势良好的小白菜进行移栽，四个处理组均进行移栽，每盆移栽1株。种植4周后，收获植物及根际土壤(根系5mm范围内土壤)，测定根际土壤pH、根际土壤有效态Cd含量、植株干重、鲜重和地上部Cd含量。

　　植株在盆栽种植条件下生长5周后，收获时根际土壤中pH值与播种时土壤中pH值的差值ΔpH如图4所示，在不接菌的条件下，添加化肥和添加有机肥的土壤中的pH分别为5.18和5.31。在添加化肥的试验组中，与对照组相比，加入1*102cfu/g dw的试验组中，pH由5.18上升至5.43，增加了2.9％。加入1*104cfu/g dw的试验组中，pH由5.18上升至5.52，增加了4.5％。在接入有机肥的试验组中，与对照组相比，加入1*102cfu/g dw的试验组中，pH由5.31上升至5.56，增加了5.3％。加入1*104cfu/g dw的试验组中，pH由5.31上升至5.64，增加了6.8％。结果表明，菌株XT-4+有机肥的加入，可以使土壤中的pH升高。

　　实施例4：盆栽试验中的有效态镉的变化柱形图

　　采用氯化钙浸提法提取土壤中有效态镉。具体步骤如下：用分析天平秤量大约1.5g泥浆于50ml离心管中，并加入25ml 0.1M CaCl2，将离心管在摇床中以25℃、200rpm条件下浸提24h后，以3000rpm/min转速，离心5min，取上清液过0.22μm的滤膜，用ICP-MS测上清液中Cd浓度。最后，采用空气-乙炔火焰原子吸收光谱法测定提取的镉含量。

　　植株在盆栽种植条件下生长5周后，收获时根际土壤中pH值与播种时土壤中有效镉含量如图5所示，在不接菌的条件下，添加化肥和添加有机肥的土壤中的有效态镉的含量分别为0.57和0.52mg/kg。在添加化肥的试验组中，与对照组相比，加入1*102cfu/g dw的试验组中，有效态镉含量由0.57下降到0.55，减少了3.8％。加入1*104cfu/g dw的试验组中，有效态镉含量由0.57下降到0.51，减少了12％。在接入有机肥的试验组中，与对照组相比，加入1*102cfu/g dw的试验组中，有效态镉含量由0.52下降到0.51，减少了1.0％。加入1*104cfu/g dw的试验组中，有效态镉含量由0.52下降到0.45，减少了10.8％。结果表明，菌株XT-4+有机肥的加入，可以使土壤中的有效镉浓度降低，从而达到钝化镉的效果。

　　实施例5：盆栽试验中的小白菜总镉含量变化的柱形图

　　取盆栽试验第30d成熟的小白菜样品，将小白菜从花盆中移出，用去离子水反复冲洗植株表面，将沾有的土壤冲洗干净。分别测量植株整株鲜重，根部和地上部鲜重。小白菜中镉含量的测定，参照中华人民共和国国家标准(编号G B5009.15-2014)《食品中镉的测定》推荐的测定方法。

　　由图6所示，在添加化肥的土壤中，加入1*102cfu/g dw和1*104cfu/g dw处理的小白菜与不接菌对照相比，地上部可食用部分镉含量由8.07mg/kg分别下降到5.08mg/kg和4.79mg/kg，下降了37％和41％。在添加有机肥的土壤中，加入1*102cfu/g dw和1*104cfu/gdw处理的小白菜与不接菌对照相比，地上部可食用部分镉含量由6.15mg/kg分别下降到4.43mg/kg和3.65mg/kg，下降了28％和41％。

　　>MK371783.1Bacillus altitudinis XT-4 16S ribosomal RNAgene

　　TTCATCGGGCTATAATGCAGTCGAGCGGACAGAAGGGAGCTTGCTCCCGGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGTGCGAGTA

　　序列表

　　<110> 南京农业大学

　　<120> 一种具有产碱、钝化重金属镉功能的高地芽孢杆菌及其应用

　　<160> 1

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1444

　　<212> DNA

　　<213> 高地芽孢杆菌XT-4 (Bacillus altitudinis XT-4)

　　<400> 1

　　ttcatcgggc tataatgcag tcgagcggac agaagggagc ttgctcccgg atgttagcgg 60

　　cggacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc 120