无线电刺激响应的三维环形细胞支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于纳米新材料技术领域，具体涉及一种无线电刺激响应的三维环形细胞支架及 其制备方法与应用。
背景技术
间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员，是多能干细胞的一种，具有自我复制、 多向分化潜能、促进干细胞植入、支持造血、免疫调控等特点；MSC在体内或体外特定的诱 导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组 织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
石墨烯是一种单层或少层的碳原子组成的碳纳米材料,具有优异的物理化学性质，如极高 的电子迁移率，可调光学性能，高机械强度和良好的导热导电性，在材料、物理和化学领域 受到了广泛关注。利用模板法制备的石墨烯中缺陷堆叠较少，在生物学应用过程中发现，石 墨烯具有多孔结构、较大的比表面积以及独特的表面拓扑结构能够更好地模拟细胞生长微环 境。石墨烯支架用于细胞培养时，具有良好的生物相容性，能够明显的促进MSC的定向分化。 此外，石墨烯作为一种导电材料，还能够通过电刺激的方式调控细胞行为。
水凝胶是一种水溶胀的，通过一种或多种单体的简单反应生成的交联聚合物网络，凡是 水溶性或亲水性的高分子，通过一定的化学交联或物理交联，都可以形成水凝胶，将导电聚 合物的氧化还原转换能力与水凝胶的快速离子迁移率和生物相容性结合在一起，可以生产各 种尺寸，结合生物活性分子的纳米导电水凝胶模板，模拟细胞外基质，用于细胞培养。此外， 导电水凝胶作为一种导电材料，亦能通过电刺激的方式调控细胞行为。
导电纤维是指在聚合物中混入导电介质所纺制成的化学纤维或金属纤维、碳纤维、导电 高分子纤维等，通过混溶、蒸镀、电镀和复合纺丝等方法，生产各种尺寸，结合生物活性分 子的纳米导电纤维模板，模拟细胞外基质，用于细胞培养。此外，导电纤维作为一种导电材 料，亦能通过电刺激的方式调控细胞行为。
气凝胶，当凝胶脱去大部分溶剂，使凝胶中液体含量比固体含量少得多，或凝胶的空间 网状结构中充满的介质是气体，外表呈固体状。将导电聚合物的氧化还原转换能力与气凝胶 的快速离子迁移率和生物相容性结合在一起，可以生产各种尺寸，结合生物活性分子的纳米 导电气凝胶模板，模拟细胞外基质，用于细胞培养。此外，导电气凝胶作为一种导电材料， 亦能通过电刺激的方式调控细胞行为。
通过光刻、电镀等微纳加工工艺与CVD工艺的结合可以制备出形状、大小等被精确控制 的石墨烯结构，但给石墨烯结构施加电刺激仍存在障碍：如何与外接导线进行良好的连接。 石墨烯具有较高的刚性，在连接较硬的铂丝时，石墨烯与铂丝接触的地方难以保持结构的完 整性，并且石墨烯与铂丝的连接存在空隙，当用银浆等高导电性液体辅助连接时，银浆等液 体的渗透范围难以控制，尤其是银浆等高导电性辅助材料是否会额外对细胞造成影响也是非 常需要商榷的。此外，导电水凝胶、导电纤维、导电气凝胶等与外接导线连接也存在障碍。 另一方面，在间充质干细胞移植时，导线连接意味着需要将导线和电源都固定在动物体内或 体表，这给支架的移植和防感染操作造成了困难。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种无线电刺激响应的三维环形细胞支架及其制备方法与应 用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种无线电刺激响应的三维环形细胞支架的制备方法，其包括：
采用化学气相沉积法在铜/镍模板上生长石墨烯，制得三维环形细胞支架；
或者，将导电物质与纤维进行混纺处理形成导电纤维，之后采用模板法进行处理，制得 三维环形细胞支架；
或者，采用3D打印的方法将导电水凝胶和/或导电气凝胶进行打印，制得三维环形细胞 支架。
本发明实施例还提供了前述方法制备的三维环形细胞支架。
本发明实施例还提供了前述的三维环形细胞支架于培养细胞中的用途。
本发明实施例还提供了一种间充质干细胞的培养方法，其包括：
提供前述的三维环形细胞支架；
以及，将间充质干细胞接种于所述三维环形细胞支架，之后以通有电信号的初级线圈对 接种有间充质干细胞的三维环形细胞支架进行无线电刺激，从而调控间充质干细胞的增殖以 及分化。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明以铜/镍为模板，利用化学气相沉积的方法制备结构可控的石墨烯三维环形 细胞支架，缺陷少，质量好；利用3D打印机制备结构可控的导电水凝胶、导电气凝胶三维 环形细胞支架；以及利用导电纤维制得三维环形细胞支架，本发明制备的三维环形细胞支架 尺寸大小精确可控、导电性良好；
(2)本发明利用无线电刺激细胞，简单方便，降低导线连接带来的问题，降低间充质干 细胞在组织内流动和存活率低的问题，降低细胞移植损伤；本发明通过对三维环形细胞支架 各种物理化学特性的调节诱导间充质干细胞定向分化；本发明结合无线电刺激和结构可控三 维环形细胞支架的优势，调控细胞行为；本发明的三维环形细胞支架与缓控释相结合，释放 营养因子，调控细胞行为；本发明提供的细胞培养方法可刺激外泌体的表达，调控细胞行为； 本发明提供的细胞培养方法对外界损伤表现出抗炎能力，此外，还可以通过改变制备过程中 材料及参数的配比，以及环形支架的尺寸，对支架的导电率、孔径、孔隙率，比表面积等特 征进行调节。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术 描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记 载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根 据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1制备的三维石墨烯环形细胞支架的X射线能谱；
图2是本发明实施例1制备的三维石墨烯环形细胞支架的拉曼图谱；
图3是是本发明实施例1中利用无线电刺激培养细胞的示意图；
图4a-4b分别是本发明实施例1中三维环形细胞支架产生的感应电动势的电信号。
图5a-5c是检测无线电刺激对细胞分化七天后的影响图；
图6a-6b为本发明实施例2制备的三维水凝胶环形细胞支架扫描电子显微镜图；
图7为本发明实施例2制备的三维水凝胶环形细胞支架孔径大小统计图；
图8a-8c为本发明实施例2制备的三维水凝胶环形细胞支架生物相容性图。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案， 下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分 实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创 造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一个方面提供了一种无线电刺激响应的三维环形细胞支架的制备方法， 其包括：
采用化学气相沉积法在铜/镍模板上生长石墨烯，制得三维环形细胞支架；
或者，将导电物质与纤维进行混纺处理形成导电纤维，之后采用模板法进行处理，制得 三维环形细胞支架；
或者，采用3D打印的方法将导电水凝胶和/或导电气凝胶进行打印，制得三维环形细胞 支架。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：至少采用光刻、等离子刻蚀、电镀 中的任意一种微纳加工手段制得结构可控的铜/镍模板，之后采用化学气相沉积法在所述铜/ 镍模板上生长石墨烯，再经过腐蚀、清洗、干燥处理，制得所述三维环形细胞支架。
在一些较为具体的实施方案中，所述化学气相沉积法包括：
提供三维环形铜/镍模板作为催化剂并置于化学气相生长设备的反应室内；
向所述反应室内通入氢气和氩气于950℃进行退火处理10-15min；
以及，向所述反应室内通入氢气、氩气和甲烷的混合气体，通过化学气相沉积法在所述 三维环形铜/镍模板表面生长形成石墨烯层，之后经刻蚀处理，获得所述三维环形细胞支架。
进一步的，所述制备方法还包括：先对所述三维环形铜/镍模板进行清洗处理，干燥后再 置于所述反应室内。
进一步的，所述制备方法包括：在低流量氢气和高流量氩气气氛下，将所述反应室内三 维环形铜/镍模板加热至950℃，之后于高流量氢气和低流量氩气气氛下退火10-15min。
进一步的，所述三维环形细胞支架的宏观内径为4-9mm，外径为14-20mm。
在一些更为具体的实施方案中，所述化学气相沉积法制备三维环形细胞支架的方法包括：
以内外径可控的三维环形铜/镍模板为催化剂，在水平管式CVD炉中生长三维环形石墨 烯。首先，将铜/镍依次置于无水乙醇、去离子水中超声15min以除去表面杂质，依次浸入 0.1mol/L的稀盐酸2min、去离子水5min进一步清洁，氮气吹干。在低流量H2和高流量Ar气体下将模板加热至950℃，在高流量H2和低流量Ar气体下退火10min，然后暴露在低流 量H2、高流量Ar和CH4下5min，最后将CVD系统冷却到室温。将生长有石墨烯的模板置 于氯化铁腐蚀液中，直至模板被腐蚀完全。将获得的样品依次置于1mol/L、0.1mol/L、0.01 mol/L的稀盐酸和去离子水中清洗，然后在分级乙醇中逐步脱水并冻干，制成三维环形细胞 支架。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将导电物质与纤维进行混纺处理形 成导电纤维，之后将所述导电纤维通过模板进行加工，制得三维环形细胞支架；
进一步的，所述三维环形细胞支架的宏观内径为4-9mm，外径为14-20mm。
进一步的，所述导电物质包括金属、碳黑、导电高分子、金属化合物中的任意一种或两 种以上的组合，且不限于此。
在一些更为具体的实施方案中，所述混纺处理包括：将导电基体和纤维切片，经过脉冲 输送器、湿切片大料仓、脉冲输送器、预结晶器(预结晶温度根据纤维而定)、干燥塔(风温 和时间)、挤压机、熔体分配管、纺丝箱体、计量泵、复合纺丝组件、侧吹风、集束上油、卷 绕和化纤，制得导电纤维，混纺时间依材料而定。
在一些较为具体的实施方案中，所述导电水凝胶和/或导电气凝胶中包含无机物和/或导电 高分子。
进一步的，所述无机物包括石墨烯、石墨、碳纤维、碳纳米管、金属粒子中的任意一种 或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述导电高分子包括聚吡咯与聚对苯二甲酸乙二酯、聚乳酸、纳米纤维素、 右旋糖酐、碳纳米管、聚丙烯酰胺、粘多糖中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述导电高分子包括聚苯胺与聚丙烯、聚己内酯、聚乙烯基苯酚、聚丙烯酰 胺中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，采用3D打印制得的所述三维环形细胞支架的宏观内径为4-9mm，外径为14-20mm，微观孔径大小2-14μm。
在一些更为具体的实施方案中，采用3D打印的方法制备三维环形细胞支架包括：3D打 印即快速成型技术的一种，它是一种以数字模型文件为基础，运用粉末状金属或塑料等可粘 合材料，通过逐层打印的方式来构造物体的技术。步骤：1.建模：手动建模，利用3D-MAX， Z-Brush等软件设计一种内外径可控的三维环形结构；3D扫描，通过3D扫描仪将三维环形 支架模板扫描下来生成数字文件。2.切片：将已经建好的3D数字模型转化为3D打印机可识 别的行走路径以及耗材挤出量，先将模型加载到软件中，点击模型切片，切片完后，将文件 发送给3D打印机。3.打印：找到文件，点击开始打印。将设备放置在3D打印机上，并在设 备的中央容器中填充所需量的水凝胶。
进一步的，所述水凝胶包括石墨烯和多糖。
在一些更为具体的实施方案中，所述三维环形细胞支架的制备方法包括：
通过光刻、等离子刻蚀、电镀等微纳加工手段制作出结构可控的铜/镍模板，利用化学气 相沉积法在模板上生长石墨烯，经过腐蚀、清洗、晾干，制得三维环形细胞支架；
或者，通过添加无机物和/或导电高分子制备无机物添加导电水凝胶和/或导电高分子基导 电水凝胶，再通过3D打印机加工为一定尺寸的三维环形细胞支架；
或者，将导电物质(金属、碳黑、导电高分子、金属化合物)与普通纤维混纺制成导电 纤维，通过模板加工为一定尺寸的三维环形细胞支架；
或者，通过添加无机物和/或导电高分子制备无机物添加导电气凝胶和/或导电高分子基导 电气凝胶，再通过3D打印机加工为一定尺寸的三维环形细胞支架。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述方法制备的三维环形细胞支架。
本发明实施例的另一个方面还提供了前述的三维环形细胞支架于培养细胞中的用途。
进一步的，所述细胞为间充质干细胞，且不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种间充质干细胞的培养方法，其包括：
提供前述的三维环形细胞支架；
以及，将间充质干细胞接种于所述三维环形细胞支架，之后以通有电信号的初级线圈对 接种有间充质干细胞的三维环形细胞支架进行无线电刺激，从而调控间充质干细胞的增殖以 及分化。
进一步的，所述电信号为正弦交流电信号：频率为20kHz，电流为2A，刺激时长为：串长1s，串间隔2s，每天1h，一个周期为7天。
进一步的，所述方法还包括：将间充质干细胞接种于所述三维环形细胞支架，之后以通 有电信号的初级线圈对接种有间充质干细胞的三维环形细胞支架进行无线电刺激，促使外泌 体的表达，进而促进细胞迁移、分化、抗原提呈或机体免疫应答中的任意一种行为。
进一步的，所述三维环形细胞支架还包括缓控释制剂。
进一步的，所述缓控释制剂包括营养因子和/或药物。
本发明中，通过一定频率的无线电刺激抑制脂多糖诱导的细胞炎症因子的释放，限制细 胞形态转变，达到抗炎的目的。或者是与缓控释相结合，施加一定的电刺激，体系吸收咪唑 啉、白藜芦醇、积雪草苷等药物，抑制脂多糖诱导的细胞炎症因子的释放，达到抗炎的目的。
缓控释：三维细胞支架有良好的导电性，在外电场的作用下，体系能发生相应的变化。 施加一定频率的无线电刺激，体系能够舒张，吸收特定的药物或营养因子，停止电刺激或施 加另一频率的电刺激，体系突然开始收缩，释放出吸收的药物或营养因子，从而实现对药物 或营养因子的缓控释。
本发明中，三维环形细胞支架的拓扑参数、形态大小对MSC的粘附、迁移、增殖、分化 产生影响，拓扑结构增强MSC在支架上的粘附；影响MSC的迁移，增加单细胞极化；促进MSC 增殖的同时细胞干性不受影响，依然有多向分化潜能；增强分化潜在机制，在不同的诱导条 件下，促进MSC定向分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等 多种组织细胞；
拓扑参数：晶体材料的拓扑结构，如：六方晶格、立方笼子型等，通过材料制备过程中 PH值、温度等参数的调节获得；形态大小：是指最终获得环形细胞支架的宏观结构，环形内 外径的大小。不同的拓扑及形态会对MSC产生不同的影响。
通过在三维环形细胞支架(石墨烯、导电水凝胶、导电纤维、导电气凝胶)上接种MSC， 结合无线电刺激产生的感应电流和支架的物理化学性质共同调控细胞行为。通过这种方法培 养的细胞能够保持活力和干性，而且可以降低移植损伤，促进MSC定向分化效率，增强钙离 子活动，钙离子活动呈现高度同步性，促进离子通道的变化，增强网络电信号，支持功能细 胞回路生长，促进细胞网络的形成；该技术增强细胞的可塑性，增强细胞的空间记忆过程； 该技术影响三维环形细胞支架/细胞间的相互作用，对脂多糖(LPS)诱导的炎症产生不同的影 响，通过其独特的特征限制细胞的形态转变，表现出对外界损伤的抗炎能力；该技术刺激外 泌体的表达，参与细胞通讯，促进细胞迁移、分化、抗原提呈、机体免疫应答等；该技术与 缓控释相结合，释放营养因子，控制药物的释放速度、浓度、时间等，作用于细胞，降低毒 副作用，调控细胞行为。
共同调控：调节无线电刺激参数，产生不同大小的电流，不同材料以及相同材料不同的 配比产生的导电率等都有所不同，对细胞会产生不同的影响。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以 发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保 护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购 买得到。
实施例1
采用光刻、等离子刻蚀、电镀中的任意一种微纳加工手段制得结构可控的铜/镍模板，之 后以内外径可控的三维环形铜/镍模板为催化剂，在水平管式CVD炉中生长三维环形石墨烯。 首先，将铜/镍依次置于无水乙醇、去离子水中超声15min以除去表面杂质，依次浸入0.1mol/L 的稀盐酸2min、去离子水5min进一步清洁，氮气吹干。在低流量H2和高流量Ar气体下将 模板加热至950℃，在高流量H2和低流量Ar气体下退火10min，然后暴露在低流量H2、高 流量Ar和CH4下5min，最后将CVD系统冷却到室温。将生长有石墨烯的模板置于氯化铁腐蚀液中，直至模板被腐蚀完全。将获得的样品依次置于1mol/L、0.1mol/L、0.01mol/L的稀盐酸和去离子水中清洗，然后在分级乙醇中逐步脱水并冻干，制成三维石墨烯环形细胞支 架；利用能量色散X射线能谱仪对以硅片为衬底的石墨烯制备的三维环形细胞支架进行检测 得到石墨烯只由碳元素构成(图1)。拉曼光谱显示了石墨烯的特征峰(图2)：在1350附近 的D峰，代表了碳晶格的缺陷，1580附近的尖锐G峰是由sp2轨道杂化碳原子在平面震动引 起的，2700附近的2D峰是双声子晶格共振引起的，2D峰与G峰的强度比是石墨烯层数的判断依据，其比值为0.8左右，说明石墨烯层数在3层左右。
将间充质干细胞种植在石墨烯支架(或导电水凝胶、导电纤维、导电气凝胶支架)上， 对初级线圈通以正弦交流电信号，利用磁通量的变化产生的感应电流对支架上的MSC进行无 线电刺激，分化7天后检测电刺激及支架的物理化学性质对MSC分化的影响，如图3所示； 图4a-4b分别为在初级线圈中存在2A，500Hz(4a)、1000Hz(4b)的正弦交流电信号时，支架上产生了振幅为50mV、100mV，频率为500Hz、1000Hz、类似于正弦交流电信号的感 应电动势，支架上形成的感应电动势符合法拉第电磁感应定律(E＝nΔΦ/Δt)，即感应电动势的 大小与线圈匝数和磁通量的变化率呈正线性相关。
图5a-5c代表的是在细胞分化七天后，检测无线电刺激对细胞分化的影响：图5a为分化 7天后，通过Tuj-1(神经元标记)，F-肌动蛋白(F-actin)、DAPI(核标记)、Merge(三种标 记的融合图)染色试验评估无线电刺激(wireless ES)对神经元树突棘密度的影响；图5b为 图5a的局部放大图；图5c的统计结果显示，无线电刺激在细胞分化过程中将树突棘密度从 3.28±0.31棘/10微米增加到4.30±0.25棘/10微米，表明无线电刺激在神经突的形成中发挥了 作用。
实施例2
采用3D打印的方法制备三维环形细胞支架包括：3D打印即快速成型技术的一种，它是 一种以数字模型文件为基础，运用粉末状金属或塑料等可粘合材料，通过逐层打印的方式来 构造物体的技术。步骤：1.建模：手动建模，利用3D-MAX，Z-Brush等软件设计一种内外径 可控的三维环形结构；3D扫描，通过3D扫描仪将三维环形支架模板扫描下来生成数字文件。 2.切片：将已经建好的3D数字模型转化为3D打印机可识别的行走路径以及耗材挤出量，先 将模型加载到软件中，点击模型切片，切片完后，将文件发送给3D打印机。3.打印：找到文 件，点击开始打印。将设备放置在3D打印机上，并在设备的中央容器中填充所需量的水凝 胶(水凝胶包括石墨烯和多糖)。
性能表征：图6a-6b为本发明实施例2制备的三维水凝胶环形细胞支架扫描电子显微镜 图；图7为本发明实施例2制备的三维水凝胶环形细胞支架孔径大小统计图；图8a-8c为本 发明实施例2制备的三维水凝胶环形细胞支架生物相容性图，其中图8a为活细胞图，图8b 为死细胞图，图8c为细胞与三维水凝胶环形细胞支架的融合图，可以看出本实施例制备的三 维水凝胶环形细胞支架有很好的生物相容性。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条 件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
本发明的各方面、实施例、特征及实例应视为在所有方面为说明性的且不打算限制本发 明，本发明的范围仅由权利要求书界定。在不背离所主张的本发明的精神及范围的情况下， 所属领域的技术人员将明了其它实施例、修改及使用。
在本发明案中标题及章节的使用不意味着限制本发明；每一章节可应用于本发明的任何 方面、实施例或特征。
在本发明案通篇中，在将组合物描述为具有、包含或包括特定组份之处或者在将过程描 述为具有、包含或包括特定过程步骤之处，预期本发明教示的组合物也基本上由所叙述组份 组成或由所叙述组份组成，且本发明教示的过程也基本上由所叙述过程步骤组成或由所叙述 过程步骤组组成。
应理解，各步骤的次序或执行特定动作的次序并非十分重要，只要本发明教示保持可操 作即可。此外，可同时进行两个或两个以上步骤或动作。
尽管已参考说明性实施例描述了本发明，但所属领域的技术人员将理解，在不背离本发 明的精神及范围的情况下可做出各种其它改变、省略及/或添加且可用实质等效物替代所述实 施例的元件。另外，可在不背离本发明的范围的情况下做出许多修改以使特定情形或材料适 应本发明的教示。因此，本文并不打算将本发明限制于用于执行本发明的所揭示特定实施例， 而是打算使本发明将包含归属于所附权利要求书的范围内的所有实施例。此外，除非具体陈 述，否则术语第一、第二等的任何使用不表示任何次序或重要性，而是使用术语第一、第二 等来区分一个元素与另一元素。
