一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及静电纺丝技术领域，具体而言，涉及一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂及其制备方法和应用。
背景技术
目前，细菌治疗作为新兴的癌症治疗手段拥有许多独特的优势，细菌治疗能够靶向肿瘤，活化穿透组织，容易探测和控制引起的细胞毒性。
Zheng等(2018)利用细菌的肿瘤靶向将碳点C3N4与自带有NO合成酶的大肠杆菌MG1655静电结合用于肿瘤治疗，在大于630nm光照下，碳点产生的光电子能够触发大肠杆菌体内的硝酸盐还原反应生成NO，抑瘤率达到80％。Fan等(2018)利用修饰了热敏启动子和治疗性蛋白基因TNF-α的大肠杆菌结合金纳米颗粒(AuNP)厌氧靶向归巢肿瘤发挥治疗作用。
目前研究的大多数细菌都要经过减毒和基因修饰，否则易造成败血症。肠道益生菌群具有无毒、免疫增强、抗肿瘤作用等优点成为国内外的研究的热点，双歧杆菌作为人体肠道益生菌群之一，也被用于抗肿瘤研究。Sivan等(2015)研究发现双歧杆菌能够抑制黑色素瘤的生长。
静电纺丝作为一种通用的方式可以用于包封多种生物活性物质，并能够维持生物活性物质的活性。电纺主要使用高分子聚合物溶液或熔融体，通过高电压作用产生连续的直径范围从微米级到纳米级的纤维。其基本原理是当聚合物溶液被施加高压电(范围为1-30kV)，液体在注射器的推动下到达喷嘴表面会带有大量电荷，并受到静电斥力和库仑力的共同作用。在这些静电作用下，液滴会发生扭曲变成圆锥状即形成泰勒锥。当电场强度超过临界值，静电力会克服液体表面张力从而喷射出来，静电射流经过连续和弯曲不稳定过程形成长而细的微纳米线(Li，2004)。
电纺微纳米纤维膜具有比表面积大、高孔隙率及连通的结构、渗透率好等性能被作为局部治疗的载体材料被广泛应用于抗肿瘤研究。
虽然将细菌载进电纺纤维膜已有报道，然而将两歧双歧杆菌载入两相都为水相的核壳电纺纤维膜未曾有报道，原因在于两歧双歧杆菌在电纺中的活性难以保存。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂及其制备方法和应用以解决上述技术问题。
本发明是这样实现的：
一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂的制备方法，其包括如下步骤：将内相纺丝液通入同轴针头的内管，其中，内相纺丝液含有两歧双歧杆菌；
将外相纺丝液通入同轴针头的外管，进行静电纺丝，得到内相包覆有两歧双歧杆菌的电纺纤维膜；
内相纺丝液还含有能阻止菌体团聚和维持菌体基本营养的保护剂，保护剂为蔗糖、可溶性淀粉和脱脂牛奶中的任意一种或多种保护剂的组合。
上述制备方法通过同轴静电纺丝技术可以将两歧双歧杆菌很好的包覆于电纺纤维膜的内相(核)中，从而对两歧双歧杆菌的活性进行保护。保护剂可以起到阻止菌体团聚的作用，提高了厌氧双歧杆菌的存活时间。保护剂还具有提供营养成分的作用。所选用的两歧双歧杆菌为益生菌，安全无毒。
通过静电纺丝，将两歧双歧杆菌包覆于内相中，从而实现外界氧气的隔绝，从而维持了两歧双歧杆菌的活性。
进一步地，上述内管中的溶液和外管中的溶液在同轴针头管内并无接触，内管中的溶液和外管中的溶液在针头管口形成双层液滴。
在本发明应用较佳的实施例中，上述外相纺丝液由生物相容性良好的材料溶于溶剂制得，溶剂为水或乙酸水溶液(乙酸和水体积比为9:1)。
在可选的实施方式中，生物相容性良好的材料在溶剂中的质量浓度为0.02-0.35g/mL；
在可选的实施方式中，生物相容性良好的材料为可化学交联的水溶性材料，包括明胶(交联剂为京尼平，质量比为10:1，纺丝前混合)、海藻酸钠(交联剂为2wt％CaCl2水溶液，纺丝后交联)、壳聚糖(交联剂为1～3％京尼平水溶液，纺丝后交联)和胶原中的至少一种。
在可选的实施方式中，生物相容性良好的材料为明胶或壳聚糖时，溶剂为乙酸水溶液，乙酸和水的体积比为9:1。
在可选的实施方式中，生物相容性良好的材料为分子量较大的不可化学交联的水溶性材料，不可化学交联的水溶性材料包括聚氧化乙烯、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。外相纺丝液由上述生物相容性良好的材料溶于溶剂制得，溶剂包括水或乙酸水溶液。
在可选的实施方式中，不可化学交联的水溶性材料在溶剂中的质量浓度为0.02-0.35g/mL。
外相纺丝液由生物相容性良好的材料制得，通过壳层纤维(外相纺丝形成)和核层纤维(内相纺丝形成)能够提供很好的阻氧能力，二者联合能够提高厌氧双歧杆菌的存活时间。设置生物相容性良好的材料作为外相纺丝有利于制得的两歧双歧杆菌更好的靶向肿瘤。
在本发明应用较佳的实施例中，上述内相纺丝液由两歧双歧杆菌、保护剂和内相纺丝原液混合制得，内相纺丝原液由生物相容性良好的水溶性材料溶于溶剂制得，溶剂为水。
在可选的实施方式中，水溶性材料在溶剂中的质量体积浓度为0.02-0.15g/mL。
在可选的实施方式中，水溶性材料为生物相容性良好的材料。
在可选的实施方式中，水溶性材料为聚乙烯醇或聚氧化乙烯(PEO)。
在可选的实施方式中，聚乙烯醇的聚合度为1000-3000，醇解度为70-90％。
在可选的实施方式中，聚乙烯醇的聚合度为1700，醇解度为88％。
设置内相纺丝液由水溶性材料制得有利于制得的纤维膜易溶于水，从而使得纤维膜包覆的两歧双歧杆菌暴露出来，进而有利于靶向肿瘤细胞或者细胞毒性的检测。
水溶性材料为生物相容性良好的材料，这样设置使得制备得到的纤维膜很好的安全性。聚乙烯醇(PVA)作为核层材料，其作用包括：
(1)内相加入PVA，可以使得内相能够处于电纺状态而不是电喷状态，即可电纺；
(2)PVA为生物相容性良好的材料，是公认的安全材料，由PVA制得的纤维干燥后具有较高的阻氧能力，且为水溶性材料，遇水可迅速溶解释放细菌以便后面的存活率测试(参照Biomacromolecules 2009,10,2823–2829)。
在本发明应用较佳的实施例中，当以脱脂牛奶作为保护剂时，控制脱脂牛奶的质量体积百分浓度为10-15％。
在其他实施例中，保护剂的种类和添加量可以根据需要进行调节。
选用脱脂牛奶作为两歧双歧杆菌的保护剂，脱脂牛奶中的主要成分为蛋白质和糖类，脱脂牛奶为胶体溶液。由于蛋白质分子的尺寸远远小于两歧双歧杆菌尺寸，因此细菌颗粒可悬浮于蛋白质分子之间。脱脂牛奶既可以阻止菌体团聚，又有利于菌体的吸收和转化，提高了厌氧双歧杆菌的存活时间。
在本发明应用较佳的实施例中，上述保护剂中两歧双歧杆菌的浓度为107-1011CFU/mL。
在可选的实施方式中，所述两歧双歧杆菌为生长至对数生长期的两歧双歧杆菌。
进一步地，两歧双歧杆菌厌氧培养至对数生长期(OD值为0.6-0.8)，培养基为MRS肉汤培养基，4000g离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲溶液反复洗涤3遍，菌体沉淀加入1mL10％w/v的脱脂牛奶重悬。
在可选的实施方式中，控制内管中纺丝液的流速与外管中外相纺丝液的流速的比值为1:1-2。
在可选的实施方式中，控制内管中纺丝液的流速与外管中外相纺丝液的流速的比值为1:1。
在可选的实施方式中，控制内管中纺丝液的流速为0.3-2.5mL/h。
在可选的实施方式中，控制外管中外相纺丝液的流速为0.5-2.5mL/h。
在上述流速比范围内，基本不会发生滴液和电喷，保证了电纺的稳定性。
在本发明应用较佳的实施例中，上述在进行静电纺丝时控制静电高压的电压为13kV-19kV。
在对聚合物液体施加高压静电(13kV-19kV)的条件下，当液体表面的静电斥力超过其表面张力后，喷头末端的泰勒锥表面高速喷射出聚合物射流，射流经过电场力的高速拉伸，溶剂挥发和固化，最后在接收极板上形成聚合物纤维。溶剂挥发后，两歧双歧杆菌被包封在电纺纤维膜的内相，同时制备得到聚合物电纺纤维膜具有很好的生物相容性。
在外加电压、接收距离、两相溶液条件不变的情况下，调节内管中纺丝液和外相纺丝液的流速，可以制备出不同直径的载菌电纺纤维。两相纺丝液流速增大的情况下，可以观察到直径较粗的电纺纤维，同时也能够明显地看到具有明显突起的成功包载的双歧杆菌。两相纺丝液流速减小时，所得纤维直径减小，也能够看到细而小的突起结构。
本发明提供的制备方法可以根据需要制备的纤维直径需要自适应调节流速。
在本发明应用较佳的实施例中，上述接收电纺纤维膜的接收极板与同轴针头的距离为30-40cm。
在可选的实施方式中，接收极板的面积为121-900cm2。
接收电纺纤维膜的接收极板与同轴针头的距离太近和太远均不利于纤维的成型。
一种由上述制备方法制得的载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂。本发明提供的制备方法可以制备出直径更粗的纤维(1-2μm)，扩大了细菌的包载空间，而现有的参考文献如Biomacromolecules 2009,10,2823–2829，仅能制备得到200nm直径的纤维，又如ACSAppl.Mater.Interfaces 2018,10,45,38799-38806，能制备得到375nm直径的纤维。
一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂在制备细菌保存剂或抗肿瘤材料中的应用。
上述抗肿瘤纤维局部埋植剂可以显著延长两歧双歧杆菌的保藏时间，并利用两歧双歧杆菌的抗肿瘤效果可以用于制备抗肿瘤材料或靶向肿瘤材料，在可选的实施方式中，也可以将抗肿瘤纤维局部埋植剂用于局部肿瘤的靶向材料合成。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂及其制备方法和应用。上述制备方法通过同轴静电纺丝技术可以将两歧双歧杆菌很好的包覆于电纺纤维膜的内核中，实现外界氧气的隔绝，从而对两歧双歧杆菌的活性进行保护。保护剂可以起到阻止菌体团聚的作用，提高了厌氧双歧杆菌的存活时间。此外，所选用的两歧双歧杆菌为益生菌，安全无毒。制备得到的电纺纤维膜具备良好的生物相容性和水溶性，细菌的包载空间更大。上述抗肿瘤纤维局部埋植剂可以显著延长两歧双歧杆菌的保藏时间，并利用两歧双歧杆菌的抗肿瘤效果可以用于制备抗肿瘤材料或靶向肿瘤材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为两歧双歧杆菌(CGMCC 1.2212)染色后的荧光显微镜图；
图2中的A图为载菌电纺纤维的荧光显微镜荧光场图，B图为载菌电纺纤维的荧光场明场叠加图；
图3为两歧双歧杆菌在扫描显微镜下的电镜图；
图4中的A图为未载菌电纺纤维的扫描电镜图；B图为载菌电纺纤维的扫描电镜图；C图为对B图载菌纤维直径统计直方图；
图5为载两歧双歧杆菌纤维膜的体外抗肿瘤效果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂的制备方法，具体包括如下步骤，所使用的仪器型号为：电纺机(KH.08，北京康森特科技公司)；微流泵(LSP02.1B，LongerPump)；
(1)两歧双歧杆菌菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，(CICC)编号10395，将两歧双歧杆菌厌氧培养至对数生长期(OD值为0.6-0.8)，培养基为MRS肉汤培养基，4000g离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲溶液反复洗涤3遍，向洗涤后的菌体沉淀中加入1mL的10％(w/v)脱脂牛奶重悬待用。
(2)将1g聚乙烯醇(PVA)溶于10mL去离子水中，在80℃水浴搅拌至聚乙烯醇全部溶解得到10％的聚乙烯醇溶液。
(3)取步骤(1)中含有两歧双歧杆菌的10％脱脂牛奶悬浮液与步骤(2)中的聚乙烯醇溶液混合，磁力搅拌，保证菌液浓度为1010CFU/mL内相纺丝液。
(4)称取3.5g明胶溶于10mL乙酸和水溶液中(体积比9:1)，磁力搅拌混合均匀，加入0.35g京尼平继续搅拌至整体溶液呈现蓝色，且溶液具备流动性，制得外相纺丝液。本实施例中，使用京尼平作为交联剂，控制明胶与京尼平的交联比例为10:1，在其他实施例中，也可以根据需要设置明胶与京尼平的交联比例为15:1、30:1、40:1、50：1或60:1。
(5)将以上步骤(2)内相纺丝液和步骤(4)外相纺丝液分别搅拌12h以上至溶质充分溶解。再将内相纺丝液通入同轴针头的内管，将外相纺丝液通入同轴针头的外管。同轴针头均为不锈钢材质，整体长度为78mm。内管长度为77mm，管径为1mm；外管长度为49mm，管径为2mm。
(6)接收装置置于距离接收极板30cm处，在针头的末端施加13.85kV的电压，内相流速：1.0mL/h，外相流速1.5mL/h，环境温度19℃，湿度74％，纤维接收时接收装置面积：20cm*19.5cm。同轴针头出口处的液滴形成双层溶液，在高压静电产生的库仑力和表面电荷斥力的作用下，溶液被电纺成连续的纤维。
实施例2
羧基荧光素二乙酸酯为疏水染料，能够透过具有完整性细胞膜的两歧双歧杆菌进入细胞内，通过胞内非特异性酯酶水解生成羧基荧光素，可使两歧双歧杆菌呈现整个细胞被染上绿色。
本实施例提供了一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)取两歧双歧杆菌用5mM羧基荧光素二乙酸酯(5-CFDA)染30min，细菌4000g离心10min，收集菌体沉淀，磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)反复洗涤三次，弃去残余染料。加入去离子水重悬挥干置于荧光显微镜(Axio Observer，ZEISS)下观察，参照图1所示，可以观察到染成绿色的两歧双歧杆菌。
(2)将步骤(1)染色后的两歧双歧杆菌与10％聚乙烯醇纺丝液混合置于同轴针头的内管，将35％的明胶/京尼平溶液(明胶与京尼平质量比为10:1)置于同轴针头的外管，本实施例中的电纺设备和工艺参数与实例1相同。在电纺过程中，将载玻片置于针头与接收极板中间位置，停留5s，收集纤维，置于荧光显微镜下观察拍照。
结果参照图2所示，图2中的A图显示，两歧双歧杆菌整体均匀分散于纤维中。图2中的B图显示，荧光场明场叠加图可以看到两歧双歧杆菌均匀分布于核壳纤维内。
实施例3
将两歧双歧杆菌与10％聚乙烯醇纺丝液混合置于同轴针头的内管，将35％明胶/京尼平(明胶与京尼平质量比为10:1)溶液置于同轴针头的外管，外加高压静电进行电纺，具体操作工艺和参数与实施例1相同，不同之处在于将内相外相流速均提高到2.5mL/h，将收集到的纤维膜置于真空干燥箱充分干燥，用扫描电镜观察。
图3为两歧双歧杆菌在扫描显微镜下的电镜图。两歧双歧杆菌的细胞壁不规则，凹凸不平，膨大或成团块状，有一个或多个分支，在长短差异很大的视野里，可以见到圆形球体，杆状和分叉状可逆性变异，这是培养条件所造成的表型变化。
载两歧双歧杆菌的电纺纤维扫描电镜结果参照图4中的B图，载菌纤维表面有明显的突起，纤维直径较细部分可以看到明显的结节；而图4中的A图未载菌纤维光滑均匀。图4中B图载菌纤维扫描直径统计直方图如图4中的C图所示，由图4中的C图可知，统计得到载菌纤维膜平均直径为1.63±0.63μm。
实施例4
按实施例1中的制备方法制备空白同轴电纺纤维膜和载两歧双歧杆菌同轴电纺纤维膜，剪取相同质量的空白纤维膜和载菌纤维膜研究抗肿瘤效果。
实验分组为：空白组(Control，未加载菌电纺纤维膜，即小鼠乳腺癌细胞(4T1)只加高糖培养基(DMEM)纯细胞培养)，未载菌同轴纤维膜(Blank nanofiber)，载菌同轴纤维膜(Nanofiber@B.b)，两歧双歧杆菌悬浮液(B.b)。利用Transwell小室与4T1细胞共培养(所用细胞为小鼠乳腺癌细胞，由四川大学惠赠，培养在RPMI 1640培养基中(HyClone，USA)，培养基中加入10％小牛血清(Gibco，USA))，上层为实验分组纤维膜，下层为4T1，共同孵育24h，取下室上清液考察细菌溶出后对肿瘤的抑瘤效果。
结果参照图5所示，图5显示，本发明实施例1制备得到的载菌纤维膜具有极显著的抗肿瘤效果。由柱状图可以看出，未载菌同轴纤维膜(Blank nanofiber)组细胞存活率在80％及以上，说明空白材料无明显的细胞毒性，载菌电纺纤维细胞存活率为18％左右，载菌纤维组和空白纤维组抑瘤效果存在显著性差异。
实施例5
本实施例提供了一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂的制备方法，具体包括如下步骤，所使用的仪器型号为：电纺机(KH.08，北京康森特科技公司)；微流泵(LSP02.1B，LongerPump)；
(1)两歧双歧杆菌菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，(CICC)编号10395，将两歧双歧杆菌厌氧培养至对数生长期(OD值为0.6-0.8)，培养基为MRS肉汤培养基，4000g离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲溶液反复洗涤3遍，向洗涤后的菌体沉淀中加入1mL的11％(w/v)脱脂牛奶重悬待用。
(2)将1.5g聚乙烯醇(PVA)溶于10mL去离子水中，在80℃水浴搅拌至聚乙烯醇全部溶解得到15％的聚乙烯醇溶液。
(3)取步骤(1)中含有两歧双歧杆菌的11％脱脂牛奶悬浮液与步骤(2)中的聚乙烯醇溶液混合，磁力搅拌，保证菌液浓度为109CFU/mL内相纺丝液。
(4)称取0.2g聚氧化乙烯(PEO)于干净的小瓶中，加入10mL去离子水搅拌过夜得到外相纺丝液。
(5)将以上步骤(2)内相纺丝液和步骤(4)外相纺丝液分别搅拌12h以上至溶质充分溶解。再将内相纺丝液通入同轴针头的内管，将外相纺丝液通入同轴针头的外管。同轴针头均为不锈钢材质，整体长度为78mm。内管长度为77mm，管径为1mm；外管长度为49mm，管径为2mm。
(6)接收装置置于距离接收极板35cm处，在针头的末端施加15kV的电压，内相流速：1.0mL/h，外相流速1.0mL/h，环境温度19℃，湿度74％，纤维接收时接收装置面积：20cm*19.5cm。同轴针头出口处的液滴形成双层溶液，在高压静电产生的库仑力和表面电荷斥力的作用下，溶液被电纺成连续的纤维。
实施例6
本实施例提供了一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂的制备方法，具体包括如下步骤，所使用的仪器型号为：电纺机(KH.08，北京康森特科技公司)；微流泵(LSP02.1B，LongerPump)；
(1)两歧双歧杆菌菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，(CICC)编号10395，将两歧双歧杆菌厌氧培养至对数生长期(OD值为0.6-0.8)，培养基为MRS肉汤培养基，4000g离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲溶液反复洗涤3遍，向洗涤后的菌体沉淀中加入1mL的15％(w/v)脱脂牛奶重悬待用。
(2)将1.2g聚乙烯醇(PVA)溶于10mL去离子水中，在80℃水浴搅拌至聚乙烯醇全部溶解得到12％的聚乙烯醇溶液。
(3)取步骤(1)中含有两歧双歧杆菌的15％脱脂牛奶悬浮液与步骤(2)中的聚乙烯醇溶液混合，磁力搅拌，保证菌液浓度为1010CFU/mL内相纺丝液。
(4)称取海藻酸钠0.2g于干净的小瓶中，加入10mL去离子水搅拌过夜得到外相纺丝液。
(5)将以上步骤(2)内相纺丝液和步骤(4)外相纺丝液分别搅拌12h以上至溶质充分溶解。再将内相纺丝液通入同轴针头的内管，将外相纺丝液通入同轴针头的外管。同轴针头均为不锈钢材质，整体长度为78mm。内管长度为77mm，管径为1mm；外管长度为49mm，管径为2mm。
(6)接收装置置于距离接收极板30cm处，在针头的末端施加19kV的电压，内相流速：1.0mL/h，外相流速1.0mL/h，环境温度19℃，湿度74％，纤维接收时接收装置面积：20cm*19.5cm。同轴针头出口处的液滴形成双层溶液，在高压静电产生的库仑力和表面电荷斥力的作用下，溶液被电纺成连续的纤维。
(7)再将步骤(6)制得的纤维膜置于2wt％CaCl2溶液中浸泡约l小时进行交联，然后再用去离子水浸泡1小时以除去多余的CaCl2。
实施例7
本实施例提供了一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂的制备方法，具体包括如下步骤，所使用的仪器型号为：电纺机(KH.08，北京康森特科技公司)；微流泵(LSP02.1B，LongerPump)；
(1)两歧双歧杆菌菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，(CICC)编号10395，将两歧双歧杆菌厌氧培养至对数生长期(OD值为0.6-0.8)，培养基为MRS肉汤培养基，4000g离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲溶液反复洗涤3遍，向洗涤后的菌体沉淀中加入1mL的13％(w/v)脱脂牛奶重悬待用。
(2)将0.4g聚氧化乙烯溶于10mL去离子水中，搅拌至全部溶解得到4％的聚氧化乙烯溶液。
(3)取步骤(1)中含有两歧双歧杆菌的13％脱脂牛奶悬浮液与步骤(2)中的聚氧化乙烯溶液混合，磁力搅拌，保证菌液浓度为108CFU/mL内相纺丝液。
(4)称取海藻酸钠0.3g于干净的小瓶中，加入10mL去离子水搅拌过夜得到外相纺丝液。
(5)将以上步骤(2)内相纺丝液和步骤(4)外相纺丝液分别搅拌12h以上至溶质充分溶解。再将内相纺丝液通入同轴针头的内管，将外相纺丝液通入同轴针头的外管。同轴针头均为不锈钢材质，整体长度为78mm。内管长度为77mm，管径为1mm；外管长度为49mm，管径为2mm。
(6)接收装置置于距离接收极板35cm处，在针头的末端施加18kV的电压，内相流速：1.2mL/h，外相流速1.2mL/h，环境温度19℃，湿度74％，纤维接收时接收装置面积：20cm*19.5cm。同轴针头出口处的液滴形成双层溶液，在高压静电产生的库仑力和表面电荷斥力的作用下，溶液被电纺成连续的纤维。
(7)再将步骤(6)制得的纤维膜置于2wt％CaCl2溶液中浸泡约l小时进行交联，然后再用去离子水浸泡1小时以除去多余的CaCl2。
实施例8
本实施例提供了一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂的制备方法，具体包括如下步骤，所使用的仪器型号为：电纺机(KH.08，北京康森特科技公司)；微流泵(LSP02.1B，LongerPump)；
(1)两歧双歧杆菌菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，(CICC)编号10395，将两歧双歧杆菌厌氧培养至对数生长期(OD值为0.6-0.8)，培养基为MRS肉汤培养基，4000g离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲溶液反复洗涤3遍，向洗涤后的菌体沉淀中加入1mL的14％(w/v)脱脂牛奶重悬待用。
(2)将0.2g聚氧化乙烯溶于10mL去离子水中，搅拌至全部溶解得到2％的聚氧化乙烯溶液。
(3)取步骤(1)中含有两歧双歧杆菌的14％脱脂牛奶悬浮液与步骤(2)中的聚氧化乙烯溶液混合，磁力搅拌，保证菌液浓度为1010CFU/mL内相纺丝液。
(4)称取壳聚糖0.35g于干净的小瓶中，加入10mL乙酸和水溶液(体积比9:1)搅拌过夜得到外相纺丝液。
(5)将以上步骤(2)内相纺丝液和步骤(4)外相纺丝液分别搅拌12h以上至溶质充分溶解。再将内相纺丝液通入同轴针头的内管，将外相纺丝液通入同轴针头的外管。同轴针头均为不锈钢材质，整体长度为78mm。内管长度为77mm，管径为1mm；外管长度为49mm，管径为2mm。
(6)接收装置置于距离接收极板30cm处，在针头的末端施加15kV的电压，内相流速：1.3mL/h，外相流速2.6mL/h，环境温度19℃，湿度74％，纤维接收时接收装置面积：20cm*19.5cm。同轴针头出口处的液滴形成双层溶液，在高压静电产生的库仑力和表面电荷斥力的作用下，溶液被电纺成连续的纤维。
(7)再将步骤(6)制备的纤维膜放入质量百分比为1～3％京尼平水溶液进行交联。
实施例9
本实施例提供了一种载两歧双歧杆菌的抗肿瘤纤维局部埋植剂的制备方法，具体包括如下步骤，所使用的仪器型号为：电纺机(KH.08，北京康森特科技公司)；微流泵(LSP02.1B，LongerPump)；
(1)两歧双歧杆菌菌种购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，(CICC)编号10395，将两歧双歧杆菌厌氧培养至对数生长期(OD值为0.6-0.8)，培养基为MRS肉汤培养基，4000g离心10min，收集菌体，磷酸盐缓冲溶液反复洗涤3遍，向洗涤后的菌体沉淀中加入1mL的10％(w/v)脱脂牛奶重悬待用。
(2)将0.3g聚氧化乙烯溶于10mL去离子水中，搅拌至聚氧化乙烯全部溶解得到3％的聚氧化乙烯溶液。
(3)取步骤(1)中含有两歧双歧杆菌的10％脱脂牛奶悬浮液与步骤(2)中的聚氧化乙烯溶液混合，磁力搅拌，保证菌液浓度为1011CFU/mL内相纺丝液。
(4)称取壳聚糖0.5g于干净的小瓶中，加入10mL乙酸和水溶液(体积比9:1)搅拌过夜得到外相纺丝液。
(5)将以上步骤(2)内相纺丝液和步骤(4)外相纺丝液分别搅拌12h以上至溶质充分溶解。再将内相纺丝液通入同轴针头的内管，将外相纺丝液通入同轴针头的外管。同轴针头均为不锈钢材质，整体长度为78mm。内管长度为77mm，管径为1mm；外管长度为49mm，管径为2mm。
(6)接收装置置于距离接收极板30cm处，在针头的末端施加15kV的电压，内相流速：1.5mL/h，外相流速2.0mL/h，环境温度19℃，湿度74％，纤维接收时接收装置面积：20cm*19.5cm。同轴针头出口处的液滴形成双层溶液，在高压静电产生的库仑力和表面电荷斥力的作用下，溶液被电纺成连续的纤维。
(7)再将步骤(6)制备的纤维膜放入质量百分比为1～3％京尼平水溶液进行交联。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
