一种覆膜生物陶瓷人工骨及制备方法
技术领域
本发明属于医疗技术领域，涉及一种覆膜生物陶瓷人工骨及制备方法。
背景技术
目前，骨缺损的治疗手段主要包括自体骨移植、异体或异种骨移植和带血管蒂腓骨移植。但上述方法均有一定的局限性：自体骨移植主要适用于5cm以下缺损且其来源有限；异体或异种骨移植因排斥及感染因素同样难以得到广泛认可；带血管蒂腓骨移植适合于治疗大段骨缺损，但对其来源、术者操作及术后管理要求较高。
骨折愈合集合了炎症细胞、干细胞、成骨和破骨细胞及生长因子等多方面的协同效应，在其愈合的过程中，骨膜发挥着至关重要的作用，其双层结构中外纤维层维持膜的强度，而高度血管化的内形成层提供了丰富的间充质祖细胞及转化生长因子，骨膜的完整覆盖有效的促进了骨折断端骨再生，而严重损伤致骨缺损时，骨膜的完整性往往已经被破坏，从而会引发骨折修复障碍从而发生骨不连。
通常骨缺损后修复重建主要是通过骨传导及骨诱导使骨再生，是一个新生骨组织逐渐爬行替代被吸收的坏死及机化组织并予以重建愈合的过程。但上述自体骨移植、异体骨移植和带血管蒂腓骨移植修复中均需要存在有利于新骨形成的生物学环境。
引导骨再生膜通过其屏障作用，维持骨缺损处良好的生物学环境，进而阻止纤维组织的长入。另外，引导骨再生膜通过其支架作用，促进成骨前体细胞的黏附和增殖，从而加速骨折愈合，其可用于大段骨缺损，不但有利于不规则骨缺损修复，还不受材料供求限制，为骨缺损的治疗提供了新方法。
引导骨再生膜可以包裹骨缺损处，为骨形成提供相对稳定的环境，有效阻止缺损处纤维软组织的嵌入，从而引导稳定环境中骨缺损处的骨再生，且引导骨再生膜具有良好的生物相容性及纳米纤维结构，不但能够诱导间充质干细胞及骨祖细胞的黏附、增殖和向成骨细胞的分化，还能够保障细胞营养的渗入及血管的长入。
目前，运用比较广泛的引导骨再生膜所用的材料主要为聚四氟乙烯、钛合金、聚缩醛等。这类材料具有生物惰性、稳定性强、不与机体发生反应的特点，但由于其在人体内不可吸收，需要二次手术取出，增加了患者的痛苦和治疗时间。因此具有良好生物相容性、组织和细胞亲和性、可降解性、可直接参与组织修复等特点的引导骨再生膜亟待开发。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种覆膜生物陶瓷人工骨及制备方法，覆膜不但能维持骨缺损处良好的生物学环境，且可降解、能被人体吸收，不需要二次手术取出。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种覆膜生物陶瓷人工骨，包括生物陶瓷人工骨和包覆在生物陶瓷人工骨外表面上的覆膜；制备覆膜的原料包括丝素蛋白。
优选的，制备覆膜的原料还包括生物大分子物质，生物大分子物质为壳聚糖、聚乳酸、明胶、透明质酸、聚己内酯、聚乳酸乙醇酸或胶原蛋白。
进一步的，丝素蛋白与生物大分子物质的质量比为9：(3～4)。
优选的，制备覆膜的原料还包括抗凝血药物。
优选的，覆膜的厚度为1.0mm～1.6mm。
优选的，制备生物陶瓷人工骨采用的生物陶瓷粉末为羟基磷灰石、β-磷酸三钙、碳酸钙、硅酸钙和硫酸钙中的一种或多种的混合物。
所述的覆膜生物陶瓷人工骨的制备方法，包括如下步骤：
步骤1，制备生物陶瓷人工骨；
步骤2，将制备覆膜的原料通过静电纺丝法包覆在生物陶瓷人工骨外表面。
优选的，步骤1中，采用无丝3D打印法打印制备得到生物陶瓷人工骨。
进一步的，步骤1包括：
步骤1.1，将生物陶瓷粉末和粘结剂混合均匀得到浆料，再进行脱泡得到均匀的打印浆料；根据患者骨缺损部位的CT、MRI或X线，得到人工骨三维模型；
步骤1.2，采用打印浆料，并根据人工骨三维模型，利用3D生物陶瓷打印机打印得到生物陶瓷人工骨，对打印完成的生物陶瓷人工骨进行冻干处理。
优选的，步骤2包括：
步骤2.1，将制备覆膜的原料溶解于溶剂中，搅拌，配制成静电纺丝混合溶液；
步骤2.2，将生物陶瓷人工骨置于静电纺丝机接收装置上，然后采用静电纺丝混合溶液进行静电纺丝覆膜；
步骤2.3，将覆膜后的生物陶瓷人工骨烘干。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明所述的覆膜生物陶瓷人工骨用于修复骨缺损时，一方面，覆膜具有引导骨再生膜的作用，能维持骨缺损处相对稳定的生物学环境，能有效阻止骨缺损处纤维软组织的嵌入，能够保证膜下成骨所需的时间和空间的充足，确保在骨生成之前，骨的生长不受到上皮结缔组织的干扰，引导稳定环境中骨缺损处的骨再生，加强骨愈合，有效避免由于骨膜缺损造成的修复障碍；生物陶瓷人工骨具有骨诱导性和骨传导性，在人工骨上覆膜能够有效提高人工骨的细胞种植效率和黏附能力，同时避免由于骨膜缺损造成的骨不连现象，有效提高成骨修复率。另一方面，本发明的覆膜采用丝素蛋白制备得到，丝素蛋白对人体无毒害作用，细胞黏附性能好，具有优良的生物相容性，更重要的是其可被蛋白酶水解降解，其降解产物对组织无毒副作用，使用后无需二次手术取出，减少病人痛苦，具有显著有益效果。材料降解吸收时间和降解产物对成骨的影响是可降解材料治疗骨缺损的关键问题，而最佳的材料降解时间应在6周至几个月的范围内，且其降解产物应无毒性且不阻碍新骨形成，丝素蛋白满足这些条件。
进一步的，覆膜的原料中增加生物大分子物质，更加利于成膜。当使用壳聚糖时，使得产品还具有止血、消炎、灭菌、促进伤口愈合及调节机体免疫作用的生物学功能。
进一步的，本发明的覆膜中还可以负载药物，载药的覆膜生物陶瓷人工骨具有优异的消炎、镇痛及抗凝血性能，能有效避免骨修复，尤其是下肢骨修复过程中出现的感染及血栓等并发症。
本发明采用静电纺丝技术在生物陶瓷人工骨包覆覆膜，覆膜中的纳米纤维具有高比表面积、溶解速率好、小尺寸及孔隙率高的特性，有利于细胞的粘附、迁移和增殖，当负载药物时可以让药物快速渗入，同时溶剂的快速挥发也限制了药物的重结晶。
进一步的，采用3D打印技术可调控人工骨的孔径、孔隙率及几何外形，真正实现了对骨创伤患者的个性化精准治疗。
附图说明
图1是实施例1静电纺丝覆膜生物陶瓷人工骨制备流程图；
图2是实施例2静电纺丝覆膜生物陶瓷人工骨制备流程图；
图3为丝素蛋白示意图；
图4为实施例1制备的丝素蛋白/壳聚糖静电纺丝纤维的SEM图(5000×)。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明所述的覆膜生物陶瓷人工骨，包括生物陶瓷人工骨和包覆在生物陶瓷人工骨外表面上的覆膜。
生物陶瓷人工骨的制备原料包括生物陶瓷粉末和粘结剂，生物陶瓷粉末为羟基磷灰石(HA)、β-磷酸三钙(β-TCP)、碳酸钙、硅酸钙和硫酸钙中的一种或多种的混合物。羟基磷灰石和β-磷酸三钙作为生物活性陶瓷，它们在结构和组成上都与天然骨基质中的矿物类似，是很好的仿生材料，具有良好的生物相容性、生物活性、骨诱导性和骨传导性，被广泛应用于骨修复材料。
粘结剂优选聚乙烯醇或胶原蛋白。聚乙烯醇属于水溶性聚合物，它能与丝素蛋白共溶于水中形成混合体系。
覆膜的制备原料包括丝素蛋白，还可以包括生物大分子物质，生物大分子物质为壳聚糖、聚乳酸、明胶、透明质酸、聚己内酯、聚乳酸乙醇酸或胶原蛋白，还可以加入其他药物，例如阿司匹林、华法林、潘生丁等抗凝血药物。
丝素蛋白是一种源于蚕丝的纯度很高且容易提纯、分离的天然高分子蛋白质，其对人体无毒害作用，细胞黏附性能好，具有优良的生物相容性、且可被蛋白酶水解降解，其降解产物对组织无毒副作用。
壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。壳聚糖无毒、无刺激性，生物相容性好，与人体细胞外基质结构相似，能被生物体内的溶菌酶降解生成天然的代谢物，从而被完全吸收。同时壳聚糖还具有止血、消炎、灭菌、促进伤口愈合及调节机体免疫作用的生物学功能。
骨缺损患者在术后恢复期，由于肢体制动，尤其是下肢制动，肢体血液循环变慢，会引起静脉血液流速会变慢，很容易形成血栓，危及生命。通常情况下，在术后患者需要口服阿司匹林肠溶片、华法林、潘生丁等抗凝血药物。
阿司匹林具有较强的解热镇痛作用，应用于风湿病、牙痛、关节痛、感冒发热等，是应用最广泛的解热镇痛药和抗炎药。关于阿司匹林抗凝血的作用机理是其通过防止血小板环氧化酶将花生四烯酸转化成前列腺素的中间体、从而防止血栓烷A2(TXA2)的生成(TXA2可促使血小板聚集)，进而阻止血小板聚集，使其不容易放出凝血因子，具有抗凝血作用。
本发明的覆膜生物陶瓷人工骨具有药物载体和修复骨缺损的双重作用，在修复骨损伤的同时，能够有效避免感染、血栓并发症的产生。
本发明覆膜生物陶瓷人工骨的制备方法是将无丝3D打印法和静电纺丝法相结合。
其中，制备方法如下所述：
(1)制备打印浆料：将生物陶瓷粉末和粘结剂混合均匀得到浆料，再进行脱泡得到均匀的打印浆料，然后将打印浆料装入料筒中，生物陶瓷粉末包括羟基磷灰石和β-磷酸三钙；
(2)人工骨三维模型：获取患者骨缺损部位的CT或MRI或X线，利用三维重建软件对数据进行处理，获取宿主骨原型模型，利用三维建模软件设计出适用于骨缺损解剖结构的人工骨三维模型STL文件。
(3)无丝3D打印：利用3D生物陶瓷打印机(西安点云生物科技有限公司)进行人工骨的打印。首先将上述步骤(1)装有打印浆料的料筒固定在3D生物陶瓷打印机上，然后将上述步骤(2)设计好的人工骨三维模型STL文件载入点云打印软件(PCLab)，设置打印参数，进行无丝3D打印，制得生物陶瓷人工骨。
(4)冻干：采用冷冻干燥技术对打印完成的生物陶瓷人工骨进行冻干处理。
(5)制备丝素蛋白：将蚕丝首先经0.1mol/L Na2CO3溶液中煮沸处理，然后置于75℃的CaCl2/H2O/C2H5OH三元溶剂(摩尔比为1:8:2)中溶解制得丝素-氯化钙溶液，进而将丝素-氯化钙溶液过滤后置于截留分子量12000的透析袋中进行透析，最后将经透析的溶液冻干得到丝素蛋白。
(6)配置静电纺丝液：将丝素蛋白或丝素蛋白与生物大分子物质和/或其他药物的混合物溶解于溶剂中，常温下磁力搅拌，配制成均匀的静电纺丝混合溶液。
(7)覆膜：将冻干后的生物陶瓷人工骨置于静电纺丝机接收装置上，然后进行静电纺丝覆膜。
(8)烘干、包装灭菌：将覆膜后的生物陶瓷人工骨经烘干、包装灭菌处理，得到成品。
通过上述两种方法的结合可以制备出一种静电纺丝覆膜生物陶瓷人工骨。该覆膜生物陶瓷人工骨不仅具有良好的骨传导、骨诱导及生物相容性，而且具有消炎、镇痛、抗凝血及促进伤口愈合的功效。
实施例1：参见图1
(1)配制胶粘剂：将8g的聚乙烯醇与92g注射用水配置成质量分数8％的聚乙烯醇水溶液，置于带盖的溶剂瓶内于60℃的水浴加热溶胀4h，然后在95℃磁力搅拌器中以160r/min转速搅拌2h，使其完全溶解形成均匀溶液；
(2)制备打印浆料：将羟基磷灰石和β-磷酸三钙以质量比3:2混合形成生物陶瓷粉体，然后将生物陶瓷粉体与胶粘剂以1:1.05的质量比进行混合，置于均质机中以1800r/min的转速混合8min，使其形成均匀的打印浆料，然后将打印浆料装入料筒中备用。
(3)人工骨三维模型：获取患者骨缺损部位的CT或MRI或X线，利用三维重建软件对数据进行处理，获取宿主骨原型模型，采用三维建模软件设计出适用于骨缺损解剖结构的人工骨三维模型STL文件。
(4)打印：利用3D生物陶瓷打印机(西安点云生物科技有限公司)进行人工骨的打印。首先将上述步骤(2)装有打印浆料的料筒固定在3D生物陶瓷打印机上，然后将上述步骤(3)设计好的人工骨三维模型STL文件载入点云打印软件(PCLab)，打印过程参数设定为：打印速度10mm/s，打印层厚为150μm，平均孔径为450μm，打印浆料通过螺旋推进器匀速均匀挤出，工作台沿着x-y轴做合成运动，打印头则沿着z轴运动，逐层依次打印，最终完成生物陶瓷人工骨的打印。
(5)冷冻干燥：将上述步骤(4)成型的生物陶瓷人工骨置于冷冻干燥箱中冷冻干燥处理24h；
(6)制备丝素蛋白：
a)将蚕丝置于0.1mol/L Na2CO3溶液中煮沸处理2h，然后用去离子水清洗三遍，置于室温通风处晾干，制得精炼蚕丝。
b)将所得精炼蚕丝以浴比1:18的比例，置于75℃的CaCl2/H2O/C2H5OH三元溶剂(摩尔比为1:8:2)中1.5h，溶解得到丝素-氯化钙溶液。然后将丝素-氯化钙溶液过滤后置于截留分子量12000的透析袋中透析3d，期间每隔两个小时换一次去离子水。
c)将经透析的溶液置于冷冻干燥机中冷冻干燥处理2d，即得海绵状丝素蛋白，如图3。
(7)配置静电纺丝液：将9g的丝素蛋白、4g的壳聚糖溶解于50g甲酸溶液中，常温下磁力搅拌3h，配置成均匀的静电纺丝混合溶液。
(8)静电纺丝覆膜：将配置的静电纺丝混合液注入20mL注射器中，并把注射器固定在微量注射泵上，调节针头(针头口径0.7mm)与接收铝箔之间的距离为18cm，阳极与针头相连，阴极连接接收铝箔，同时把冻干处理后的生物陶瓷人工骨固定在接收铝箔。设定微量注射泵流量为0.5mL/h，高压直流电源电压调至22kv，静电纺丝液在高电场的作用下形成纳米纤维，纺丝6h。在纺丝3h时对生物陶瓷人工骨进行上下位置掉转，使其表面能够均匀覆上1.0mm～1.6mm静电纺丝薄膜。
(9)烘干、灭菌：将静电纺丝覆膜的生物陶瓷人工骨置于30℃的真空烘箱中烘干24h后，包装并进行辐照灭菌处理，制成成品。
实施例2：参见图2
(1)配制胶粘剂：将10g的聚乙烯醇与90g注射用水配置成质量分数10％的聚乙烯醇水溶液，置于带盖的溶剂瓶内于60℃的水浴加热溶胀4h，然后在95℃磁力搅拌器中以160r/min转速搅拌2h，使其完全溶解形成均匀溶液；
(2)制备打印浆料：将β-磷酸三钙与胶粘剂以1:0.8的质量比进行混合，置于均质机中以1800r/min的转速混合8min，使其形成均匀的打印浆料，然后将打印浆料装入料筒中。
(3)人工骨三维模型：获取患者骨缺损部位的CT或MRI或X线，利用三维重建软件对数据进行处理，获取宿主骨原型模型，采用三维建模软件设计出适用于骨缺损解剖结构的人工骨三维模型STL文件。
(4)打印：利用3D生物陶瓷打印机(西安点云生物科技有限公司)进行人工骨的打印。首先将上述步骤(2)装有打印浆料的料筒固定在3D生物陶瓷打印机上，然后将上述步骤(3)设计好的人工骨三维模型STL文件载入点云打印软件(PCLab)，打印过程参数设定为：打印速度10mm/s，打印层厚为150μm，平均孔径为450μm，浆料通过螺旋推进器匀速均匀挤出，工作台沿着x-y轴做合成运动，打印头则沿着z轴运动，逐层依次打印，最终完成生物陶瓷人工骨的打印。
(5)冷冻干燥：将上述步骤(4)成型的生物陶瓷人工骨置于冷冻干燥箱中冷冻干燥处理24h；
(6)制备丝素蛋白：
a)将蚕丝置于0.1mol/L Na2CO3溶液中煮沸处理2h，然后用去离子水清洗三遍，置于室温通风处晾干，制得精炼蚕丝。
b)将所得精炼蚕丝以浴比1:18的比例，置于75℃的CaCl2/H2O/C2H5OH三元溶剂(摩尔比为1:8:2)中1.5h，溶解得到丝素-氯化钙溶液。然后将丝素-氯化钙溶液过滤后置于截留分子量12000的透析袋中透析3d，期间每隔两个小时换一次去离子水。
c)将经透析的溶液置于冷冻干燥机中冷冻干燥处理2d，即得海绵状丝素蛋白，如图3。
(7)配置静电纺丝液：将9g丝素蛋白、3g聚乳酸及1g阿司匹林溶于三氟乙酸和二氯甲烷(体积比7:3)的30g混合溶液中，常温下磁力搅拌3h，配置成均匀的静电纺丝混合溶液。
(8)静电纺丝覆膜：将配置的静电纺丝混合液注入20mL注射器中，并把注射器固定在微量注射泵上，调节针头(针头口径0.7mm)与接收铝箔之间的距离为18cm，阳极与针头相连，阴极连接接收铝箔，同时把冻干处理后的生物陶瓷人工骨固定在接收铝箔。设定微量注射泵流量为0.5mL/h，高压直流电源电压调至22kv，纺丝液在高电场的作用下形成纳米纤维，纺丝6h。在纺丝3h时对生物陶瓷人工骨进行上下位置掉转，使其表面能够均匀覆上1.0mm～1.6mm静电纺丝薄膜。
(9)烘干、灭菌：将静电纺丝覆膜的生物陶瓷人工骨置于30℃的真空烘箱中烘干24h后，包装并进行辐照灭菌处理，制成成品。
实施例3
(1)配制胶粘剂：将3g的胶原蛋白溶于47g 0.05mol/L醋酸溶液中，置于磁力搅拌机上，以160r/min的转速搅拌90min，得到粘结剂；
(2)制备打印浆料：将β-磷酸三钙、硅酸钙和碳酸钙以质量比2:1:1混合形成生物陶瓷粉体，然后将生物陶瓷粉体与胶粘剂以1:1.2的质量比进行混合，置于均质机中以1800r/min的转速混合8min，使其形成均匀的打印浆料，然后将打印浆料装入料筒中。
(3)人工骨三维模型：获取患者骨缺损部位的CT或MRI或X线，利用三维重建软件对数据进行处理，获取宿主骨原型模型，采用三维建模软件软件设计出适用于骨缺损解剖结构的人工骨三维模型STL文件。
(4)打印：利用3D生物陶瓷打印机(西安点云生物科技有限公司)进行人工骨的打印。首先将上述步骤(2)装有打印浆料的料筒固定在3D生物陶瓷打印机上，然后将上述步骤(3)设计好的人工骨三维模型STL文件载入点云打印软件(PCLab)，打印过程参数设定为：打印速度10mm/s，打印层厚为150μm，平均孔径为450μm，浆料通过螺旋推进器匀速均匀挤出，工作台沿着x-y轴做合成运动，打印头则沿着z轴运动，逐层依次打印，最终完成生物陶瓷人工骨的打印。
(5)冷冻干燥：将上述(4)成型的生物陶瓷人工骨置于冷冻干燥箱中冷冻干燥处理24h；
(6)制备丝素蛋白：
a)将蚕丝置于0.1mol/L Na2CO3溶液中煮沸处理2h，然后用去离子水清洗三遍，置于室温通风处晾干，制得精炼蚕丝。
b)将所得精炼蚕丝以浴比1:18的比例，置于75℃的CaCl2/H2O/C2H5OH三元溶剂(摩尔比为1:8:2)中1.5h，溶解得到丝素-氯化钙溶液。然后将丝素-氯化钙溶液过滤后置于截留分子量12000的透析袋中透析3d，期间每隔两个小时换一次去离子水。
c)将经透析的溶液置于冷冻干燥机中冷冻干燥处理2d，即得海绵状丝素蛋白，如图3。
(7)配置静电纺丝液：将6g聚乳酸乙醇酸、3g丝素蛋白和3g胶原蛋白溶解于57g六氟异丙醇溶液中，常温下磁力搅拌3h，配置成均匀的静电纺丝混合溶液。
(8)静电纺丝覆膜：将配置的静电纺丝混合液注入20mL注射器中，并把注射器固定在微量注射泵上，调节针头(针头口径0.7mm)与接收铝箔之间的距离为18cm，阳极与针头相连，阴极连接接收铝箔，同时把冻干处理后的生物陶瓷人工骨固定在接收铝箔。设定微量注射泵流量为0.5mL/h，高压直流电源电压调至22kv，纺丝液在高电场的作用下形成纳米纤维，纺丝6h。在纺丝3h时对生物陶瓷人工骨进行上下位置掉转，使其表面能够均匀覆上1.0mm～1.6mm静电纺丝薄膜。
(9)烘干、灭菌：将静电纺丝覆膜的生物陶瓷人工骨置于30℃的真空烘箱中烘干24h后，包装并进行辐照灭菌处理，制成成品。
实施案例4
(1)配制胶粘剂：将8g的聚乙烯醇与92g注射用水配置成质量分数8％的聚乙烯醇水溶液，置于带盖的溶剂瓶内于60℃的水浴加热溶胀4h，然后在95℃磁力搅拌器中以160r/min转速搅拌2h，使其完全溶解形成均匀溶液；
(2)制备打印浆料：将硫酸钙和β-磷酸三钙以质量比1:2混合形成生物陶瓷粉体，然后将生物陶瓷粉体与胶粘剂以1:1.05的质量比进行混合，置于均质机中以1800r/min的转速混合8min，使其形成均匀的打印浆料，然后将打印浆料装入料筒中。
(3)人工骨三维模型：获取患者骨缺损部位的CT或MRI或X线，利用三维重建软件对数据进行处理，获取宿主骨原型模型，采用三维建模软件设计出适用于骨缺损解剖结构的人工骨三维模型STL文件。
(4)打印：利用3D生物陶瓷打印机(西安点云生物科技有限公司)进行人工骨的打印。首先将上述(2)装有打印浆料的料筒固定在3D生物陶瓷打印机上，然后将上述(4)设计好的人工骨三维模型STL文件载入点云打印软件(PCLab)，打印过程参数设定为：打印速度10mm/s，打印层厚为150μm，平均孔径为450μm，浆料通过螺旋推进器匀速均匀挤出，工作台沿着x-y轴做合成运动，打印头则沿着z轴运动，逐层依次打印，最终完成生物陶瓷人工骨的打印。
(5)冷冻干燥：将上述(4)成型的生物陶瓷人工骨置于冷冻干燥箱中冷冻干燥处理24h；
(6)制备丝素蛋白：
a)将蚕丝置于0.1mol/L Na2CO3溶液中煮沸处理2h，然后用去离子水清洗三遍，置于室温通风处晾干，制得精炼蚕丝。
b)将所得精炼蚕丝以浴比1:18的比例，置于75℃的CaCl2/H2O/C2H5OH三元溶剂(摩尔比为1:8:2)中1.5h，溶解得到丝素-氯化钙溶液。然后将丝素-氯化钙溶液过滤后置于截留分子量12000的透析袋中透析3d，期间每隔两个小时换一次去离子水。
c)将经透析的溶液置于冷冻干燥机中冷冻干燥处理2d，即得海绵状丝素蛋白，如图3。
(7)配置静电纺丝液：将9g丝素蛋白和3g聚乳酸溶于三氟乙酸和二氯甲烷(体积比7:3)的混合溶液中，常温下磁力搅拌3h，配置成均匀的静电纺丝混合溶液。
(8)静电纺丝覆膜：将配置的静电纺丝混合液注入20mL注射器中，并把注射器固定在微量注射泵上，调节针头(针头口径0.7mm)与接收铝箔之间的距离为18cm，阳极与针头相连，阴极连接接收铝箔，同时把冻干处理后的生物陶瓷人工骨固定在接收铝箔。设定微量注射泵流量为0.5mL/h，高压直流电源电压调至22kv，纺丝液在高电场的作用下形成纳米纤维，纺丝6h。在纺丝3h时对生物陶瓷人工骨进行上下位置掉转，使其表面能够均匀覆上1.0mm～1.6mm静电纺丝薄膜。
(9)烘干、灭菌：将静电纺丝覆膜的生物陶瓷人工骨置于30℃的真空烘箱中烘干24h后，包装并进行辐照灭菌处理，制成成品。
实施案例5
(1)配制胶粘剂：将8g的聚乙烯醇与92g注射用水配置成质量分数8％的聚乙烯醇水溶液，置于带盖的溶剂瓶内于60℃的水浴加热溶胀4h，然后在95℃磁力搅拌器中以160r/min转速搅拌2h，使其完全溶解形成均匀溶液；
(2)制备打印浆料：将硅酸钙和β-磷酸三钙以质量比1:2混合形成生物陶瓷粉体，然后将生物陶瓷粉体与胶粘剂以1:1.05的质量比进行混合，置于均质机中以1800r/min的转速混合8min，使其形成均匀的打印浆料，然后将打印浆料装入料筒中。
(3)人工骨三维模型：获取患者骨缺损部位的CT或MRI或X线，利用三维重建软件对数据进行处理，获取宿主骨原型模型，采用三维建模软件设计出适用于骨缺损解剖结构的人工骨三维模型STL文件。
(4)打印：利用3D生物陶瓷打印机(西安点云生物科技有限公司)进行人工骨的打印。首先将上述(2)装有打印浆料的料筒固定在3D生物陶瓷打印机上，然后将上述(4)设计好的人工骨三维模型STL文件载入点云打印软件(PCLab)，打印过程参数设定为：打印速度10mm/s，打印层厚为150μm，平均孔径为450μm，浆料通过螺旋推进器匀速均匀挤出，工作台沿着x-y轴做合成运动，打印头则沿着z轴运动，逐层依次打印，最终完成生物陶瓷人工骨的打印。
(5)冷冻干燥：将上述(4)成型的生物陶瓷人工骨置于冷冻干燥箱中冷冻干燥处理24h；
(6)配置静电纺丝液：将5g聚己内酯和6g明胶溶于48g的六氟异丙醇中，同时加入2.6g的冰乙酸，然后在常温下磁力搅拌3h，配置成均匀的静电纺丝混合溶液。
(7)静电纺丝覆膜：将配置的静电纺丝混合液注入20mL注射器中，并把注射器固定在微量注射泵上，调节针头(针头口径0.7mm)与接收铝箔之间的距离为18cm，阳极与针头相连，阴极连接接收铝箔，同时把冻干处理后的生物陶瓷人工骨固定在接收铝箔。设定微量注射泵流量为0.5mL/h，高压直流电源电压调至22kv，纺丝液在高电场的作用下形成纳米纤维，纺丝6h。在纺丝3h时对生物陶瓷人工骨进行上下位置掉转，使其表面能够均匀覆上1.0mm～1.6mm静电纺丝薄膜。
(8)烘干、灭菌：将静电纺丝覆膜的生物陶瓷人工骨置于30℃的真空烘箱中烘干24h后，包装并进行辐照灭菌处理，制成成品。
实施案例6
(1)配制胶粘剂：将8g的聚乙烯醇与92g注射用水配置成质量分数8％的聚乙烯醇水溶液，置于带盖的溶剂瓶内于60℃的水浴加热溶胀4h，然后在95℃磁力搅拌器中以160r/min转速搅拌2h，使其完全溶解形成均匀溶液；
(2)制备打印浆料：将硅酸钙和β-磷酸三钙以质量比1:2混合形成生物陶瓷粉体，然后将生物陶瓷粉体与胶粘剂以1:1.05的质量比进行混合，置于均质机中以1800r/min的转速混合8min，使其形成均匀的打印浆料，然后将打印浆料装入料筒中。
(3)人工骨三维模型：获取患者骨缺损部位的CT或MRI或X线，利用三维重建软件对数据进行处理，获取宿主骨原型模型，采用三维建模软件设计出适用于骨缺损解剖结构的人工骨三维模型STL文件。
(4)打印：利用3D生物陶瓷打印机(西安点云生物科技有限公司)进行人工骨的打印。首先将上述(2)装有打印浆料的料筒固定在3D生物陶瓷打印机上，然后将上述(4)设计好的人工骨三维模型STL文件载入点云打印软件(PCLab)，打印过程参数设定为：打印速度10mm/s，打印层厚为150μm，平均孔径为450μm，浆料通过螺旋推进器匀速均匀挤出，工作台沿着x-y轴做合成运动，打印头则沿着z轴运动，逐层依次打印，最终完成生物陶瓷人工骨的打印。
(5)冷冻干燥：将上述(4)成型的生物陶瓷人工骨置于冷冻干燥箱中冷冻干燥处理24h；
(6)配置静电纺丝液：将7g透明质酸和4g壳聚糖溶于50g甲酸溶液中。然后在常温下磁力搅拌3h，配置成均匀的静电纺丝混合溶液。
(7)静电纺丝覆膜：将配置的静电纺丝混合液注入20mL注射器中，并把注射器固定在微量注射泵上，调节针头(针头口径0.7mm)与接收铝箔之间的距离为18cm，阳极与针头相连，阴极连接接收铝箔，同时把冻干处理后的生物陶瓷人工骨固定在接收铝箔。设定微量注射泵流量为0.5mL/h，高压直流电源电压调至22kv，纺丝液在高电场的作用下形成纳米纤维，纺丝6h。在纺丝3h时对生物陶瓷人工骨进行上下位置掉转，使其表面能够均匀覆上1.0mm～1.6mm静电纺丝薄膜。
(8)烘干、灭菌：将静电纺丝覆膜的生物陶瓷人工骨置于30℃的真空烘箱中烘干24h后，包装并进行辐照灭菌处理，制成成品。
图4为实施例1制备的丝素蛋白/壳聚糖静电纺丝纤维的SEM图，可以看出，丝素蛋白/壳聚糖可以制备纳米级纤维，制备的纳米纤维粗细均匀、纤维连续、表面光滑。
实施例1制备的丝素蛋白/壳聚糖纳米纤维膜的溶血率为3.6％，具有一定的抗凝血性。
实施例2加入具有抗凝血性药粉阿司匹林的聚乳酸/丝素蛋白纳米纤维膜的溶血率为0.6％，且阿司匹林的质量分数越高，溶血率越低，说明阿司匹林的加入可有效改善聚乳酸/丝素蛋白纳米纤维膜的溶血性能。
经实验证明，传统的生物陶瓷人工骨(即未覆膜的生物陶瓷人工骨)兔骨髓基质干细胞的种植效率是79.2％，实施例1覆膜的生物陶瓷人工骨其兔骨髓基质干细胞的种植效率可提高至98.7％。即与传统的生物陶瓷人工骨相比，覆膜的生物陶瓷人工骨其兔骨髓基质干细胞的种植效率明显提高，同时其细胞的黏附能力也明显增强，因此覆膜的生物陶瓷人工骨产品将在提高人体骨缺损的修复率方面具有重要意义。
实施例2含有阿司匹林药物的覆膜生物陶瓷人工骨，阿司匹林药粉被很好地包埋在纤维的内部，随着纤维的溶胀，降解药粉被逐渐释放出来，植入人体72h内的累积释药百分率在10％以上，满足现代医学的应用要求，而且在镇痛、消炎及抗凝血方面具有较大的临床应用价值。
