一种醇溶蛋白缓释抗氧化膜的制备方法与应用
技术领域
本发明涉及食品保存技术领域，具体涉及一种醇溶蛋白缓释抗氧化膜的制备方法与应用。
背景技术
目前市场上干果类食品货架期不长，而延长食品货架期的方式普遍为在食品包装里放置装有抗氧化剂/吸水剂的制片，随着袋装物使用结束后即被丢弃，在安全性上容易被小孩子误食，塑料包装也常常成为环境污染一大来源。
包装里放置的抗氧化剂/吸水剂的制片由于使用时大量接触氧气，抗氧化的时效短，导致货架期较短。为了寻找更为安全且简便高效的材料进行食品包装，制作一款能够缓释抗氧化剂，拉长食品货架期的抗氧化包装袋是十分有必要的。
发明内容
为解决干果类食品货架期不长的问题，本发明提出了一种醇溶蛋白缓释抗氧化膜的制备方法与应用，氧化膜制作干果类食品抗氧化包装达到延长食品货架期的目的。
本发明是通过一下技术方案实现的：一种醇溶蛋白缓释抗氧化膜的制备方法，实现了包装+抗氧化二合一的功能，而且该纤维膜是可降解包装材料。制备方法为以下步骤：(1)将醇溶蛋白溶于冰乙酸中，然后将茶多酚加入醇溶蛋白乙酸溶液中，搅拌后再加入聚乳酸纳米粒子，搅拌后静置，得到茶多酚/醇溶蛋白乙酸溶液；
作为优选，所述的醇溶蛋白为糯米醇溶蛋白。醇溶蛋白膜本身具有一定隔氧、保鲜、抑菌作用，起到了缓释抗氧化剂的作用，使延长食品货架期成为可能。黄酒主要原材料为糯米，黄酒糟中富含这类蛋白质，了解到我国黄酒产量160万，黄酒平均出糟率20％-30％，数量可观，且市场对于黄酒糟的深加工利用并不重视，本发明利用黄酒糟获得糯米醇溶蛋白，为将来黄酒糟的处理以及废弃资源的再生利用提供了新的方法；
作为优选，所述的醇溶蛋白乙酸溶液的质量体积浓度为10-20％。
作为优选，茶多酚的使用量为醇溶蛋白质量的5％-15％。茶多酚是一类含有多酚羟基的化学物质，结构中的羟基可提供活泼的氢从而使自由基灭活，具有较强的抗氧化活性(其中EGCG含量高，约占儿茶素80％，具有吸湿性，耐热性)。由于茶多酚的加入使溶液密度增大，增加了溶液的导电能力，增加了喷射表面电荷的密度，从而使喷射流负荷有更多的电荷，喷射细流被高度拉伸从而产生更细的纤维，电荷过多的纤维空间，会由于分布不匀出现黏连和分支。
作为优选，聚乳酸纳米粒子为Pluronic F127。聚乳酸纳米粒子的使用量为茶多酚/醇溶蛋白乙酸溶液质量的15％-25％。
Pluronic F127为聚氯乙烯聚氧丙烯醚嵌段共聚物，商品名为普兰尼克(Pluronic)，高分子非离子表面活性剂。化学结构上是乙氧基-丙氧基形成的两性三嵌段聚合物，F127的分子式EO106PO70EO106；其中EO表示乙氧基，PO表示丙氧基，两性三嵌段聚合物在水中加入一定量以后可以形胶束，由于EO嵌段的亲水性强于PO嵌段，所以在水中形成胶束以PO为内核，EO为壳层，加入到更大量以后，胶束还会进一步聚集，在本产品中可以增强纤维膜的机械强度。
作为优选，茶多酚/醇溶蛋白乙酸溶液通过磁力搅拌完全溶解至均一液体。
(2)将步骤(1)得到的茶多酚/醇溶蛋白乙酸溶液通过静电纺丝机进行电纺，得到醇溶蛋白缓释抗氧化膜。
静电纺丝是高分子流体静电雾化的特殊形式，此时雾化分裂出的物质不是微小液滴，而是聚合物微小射流，可以运行相当长的距离，最终固化成纤维。静电纺丝是一种特殊的纤维制造工艺，聚合物溶液或熔体在强电场中进行喷射纺丝。在电场作用下，针头处的液滴会由球形变为圆锥形(即“泰勒锥”)，并从圆锥尖端延展得到纤维细丝。这种方式可以生产出纳米级直径的聚合物细丝。
静电纺丝具有很好的生物相容性及可降解性，同时静电纺纳米纤维还具有大的比表面积、孔隙率等优良特性，静电纺纤维能够有效调控纤维的精细结构，结合低表面能的物质，可获得具有超疏水性能的材料。
醇溶蛋白易于成膜，具有良好成形性，生物降解能力，高韧性，疏水性，生物相溶性，电纺纳米纤维材料保持了这些优点。
静止一段时间后取出茶多酚/醇溶蛋白乙酸溶液加入进样器中利用静电纺丝机进行电纺，以静电纺丝装置喷涂选定的糯米醇溶蛋白混合溶液到纤维接收滚筒，经过一定时间的积累即可得到具有一定孔隙、以纳米纤维结构为骨架的薄膜，室温下连续收集纤维膜2-3层后取下，纤维接收滚筒连接滑台，滑台移动速度设置为100cm/min，滚筒转速40r/rain，置于真空干燥箱中40-50℃低温干燥以备用，干燥后进行切割成每份质量为0.2g，得到醇溶蛋白缓释抗氧化膜将注射器水平固定在微量注射泵上，直流高压电源正极连接到注射器上的针头，负极与接地铝箔片接收集相连接。
电纺参数：纺丝速率1.0mL·h-1；接收距离11cm；纺丝电压15kV。室温下连续收集纤维膜至0.04-0.05mm后取下，置于真空干燥箱中40-50℃低温干燥。
所述的醇溶蛋白缓释抗氧化膜的制备方法得到的抗氧化膜在干果类食品包装上的应用。配制茶多酚/糯米醇溶蛋白溶液，用静电纺丝机制备负载茶多酚的糯米醇溶蛋白纳米纤维膜。两者安全无害，稳定性好。将糯米醇溶蛋白制成静电纤维材料具有高的比表面积，有利于茶多酚的吸附且能够获得较目前市场包装与抗氧化剂更好的抗氧化效果，延长食品货架期。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)利用静电纺丝机，通过电纺技术包封抗氧化剂-茶多酚，制备茶多酚/蛋白载药纳米纤维膜，将茶多酚附着在醇溶蛋白纳米纤维膜中，使纳米纤维作为膜存在的同时阻碍茶多酚的释放，获得缓释效果；
(2)不仅延长了干果类货架期，使损失降低并且极好利用了黄酒糟，为缓解环境压力作出了贡献。
附图说明
图1为不同含量茶多酚的糯米醇溶蛋白静电纺纳米纤维扫描电镜的SEM照片；
图2为醇溶蛋白、不同含量茶多酚的醇溶蛋白、茶多酚静电纺纳米纤维傅里叶红外光谱图；
其中，a：醇溶蛋白纳米纤维，b：5wt％含量茶多酚的醇溶蛋白，c：10wt％含量茶多酚的醇溶蛋白，d：15wt％含量茶多酚的醇溶蛋白，e：茶多酚；
图3为糯米醇溶蛋白电纺纤维、不同含量茶多酚的醇溶蛋白、茶多酚电纺纳米纤维X射线衍射图；
其中，a：糯米醇溶蛋白纤维，b：5wt％含量茶多酚的醇溶蛋白，c：10wt％含量茶多酚的醇溶蛋白，d：15wt％含量茶多酚的醇溶蛋白，e：茶多酚；
图4为茶多酚高温处理前后的色谱图；
图5为茶多酚及不同含量茶多酚的茶多酚/醇溶蛋白纳米纤维微分(DTG)热重曲线；
图6为37℃下前1小时醇溶蛋白缓释抗氧化膜的释放曲线；
其中，a：5wt％含量茶多酚的醇溶蛋白，b：10wt％含量茶多酚的醇溶蛋白，c：15wt％含量茶多酚的醇溶蛋白。
具体实施方式
下面通过实施例和附图对本发明作进一步详细说明，实施例中所用原料均可市购或采用常规方法制备。
采用常规方法从黄酒糟中提取糯米醇溶蛋白：采用乙醇浸提法从黄酒糟中提取糯米醇溶蛋白：将新鲜的黄酒糟放在烘箱中60摄氏度烘干，用80％的乙醇浸提，振荡30分钟后进行第一次离心(转速4500r/min，5分钟)，取出上清液，用1％的NaCl进行盐析，静置12h后进行二次离心转速(4500r/min，5分钟)，取出沉淀干燥即得糯米醇溶蛋白。
实施例1
(1)将糯米醇溶蛋白溶于冰乙酸中，配置成浓度为15％(m/V)糯米醇溶蛋白乙酸溶液，然后将茶多酚加入醇溶蛋白乙酸溶液中，茶多酚的使用量为醇溶蛋白质量的5％，磁力搅拌完全溶解至均一液体，再加入Pluronic F127聚乳酸纳米粒子，搅拌后静置，得到聚乳酸纳米粒子质量浓度为15％的茶多酚/醇溶蛋白乙酸溶液；
(2)静止30min后取出5mL溶液加入进样器中利用简易静电纺丝机进行电纺，将注射器水平固定在微量注射泵(申辰注射泵SPlab02-E)上，直流高压电源正极连接到注射器上的针头，负极与接地铝箔片接收集相连接。电纺参数：纺丝速率1.0mL/h；接收距离13cm；纺丝电压15kV。以静电纺丝装置喷涂选定的糯米醇溶蛋白混合溶液到纤维接收滚筒，经过一定时间的积累即可得到具有一定孔隙、以纳米纤维结构为骨架的薄膜，室温下连续收集纤维膜2层后取下，纤维接收滚筒连接滑台，滑台移动速度设置为100cm/min，滚筒转速40r/rain，置于真空干燥箱中45℃低温干燥以备用，干燥后进行切割成每份质量为0.2g，得到醇溶蛋白缓释抗氧化膜。
实施例2
(1)将糯米醇溶蛋白溶于冰乙酸中，配置成浓度为15％(m/V)糯米醇溶蛋白乙酸溶液，然后将茶多酚加入醇溶蛋白乙酸溶液中，茶多酚的使用量为醇溶蛋白质量的10％，磁力搅拌完全溶解至均一液体，再加入Pluronic F127聚乳酸纳米粒子，搅拌后静置，得到聚乳酸纳米粒子质量浓度为20％的茶多酚/醇溶蛋白乙酸溶液；
(2)静止30min后取出5mL溶液加入进样器中利用简易静电纺丝机进行电纺，将注射器水平固定在微量注射泵(申辰注射泵SPlab02-E)上，直流高压电源正极连接到注射器上的针头，负极与接地铝箔片接收集相连接。电纺参数：纺丝速率1.0mL/h；接收距离13cm；纺丝电压15kV。以静电纺丝装置喷涂选定的糯米醇溶蛋白混合溶液到纤维接收滚筒，经过一定时间的积累即可得到具有一定孔隙、以纳米纤维结构为骨架的薄膜，室温下连续收集纤维膜3层后取下，纤维接收滚筒连接滑台，滑台移动速度设置为100cm/min，滚筒转速40r/rain，置于真空干燥箱中40℃低温干燥以备用，干燥后进行切割成每份质量为0.2g，得到醇溶蛋白缓释抗氧化膜。
实施例3
(1)将糯米醇溶蛋白溶于冰乙酸中，配置成浓度为15％(m/V)糯米醇溶蛋白乙酸溶液，然后将茶多酚加入醇溶蛋白乙酸溶液中，茶多酚的使用量为醇溶蛋白质量的15％，磁力搅拌完全溶解至均一液体，再加入Pluronic F127聚乳酸纳米粒子，搅拌后静置，得到聚乳酸纳米粒子质量浓度为25％的茶多酚/醇溶蛋白乙酸溶液；
(2)静止30min后取出5mL溶液加入进样器中利用简易静电纺丝机进行电纺，将注射器水平固定在微量注射泵(申辰注射泵SPlab02-E)上，直流高压电源正极连接到注射器上的针头，负极与接地铝箔片接收集相连接。电纺参数：纺丝速率1.0mL/h；接收距离13cm；纺丝电压15kV。以静电纺丝装置喷涂选定的糯米醇溶蛋白混合溶液到纤维接收滚筒，经过一定时间的积累即可得到具有一定孔隙、以纳米纤维结构为骨架的薄膜，室温下连续收集纤维膜2层后取下，纤维接收滚筒连接滑台，滑台移动速度设置为100cm/min，滚筒转速40r/rain，置于真空干燥箱中50℃低温干燥以备用，干燥后进行切割成每份质量为0.2g，得到醇溶蛋白缓释抗氧化膜。
测试例1
实施例1-实施例3不同含量茶多酚的糯米醇溶蛋白静电纺纳米纤维扫描电镜的SEM照片如图l所示。在扫描电镜照片中几乎观察不到茶多酚颗粒，这表明茶多酚绝大部分已经被包埋在纤维内部，也有部分与纤维均匀共混。负载茶多酚质量分数为5％、10％、15％复合纳米纤维直径越来越小，实验过程中，随着茶多酚含量的增加，观察到纤维膜颜色加深；在扫描电镜照片中，制得的是光滑均匀的纤维，确定了在电纺过程中没有发生相分离，茶多酚良好地分散于纤维中，部分被包埋在纤维的内部，部分与纤维共混。
实施例1-实施例3不同含量茶多酚的糯米醇溶蛋白静电纺纳米纤维傅里叶红外光谱图如图2所示，其中，a为醇溶蛋白纳米纤维，b为5％，c为10％，d为15％，e为茶多酚。对茶多酚、醇溶蛋白纳米纤维和不同含量的茶多酚-醇溶蛋白复合纳米纤维进行傅立叶红外测试，结果如图2所示，载药膜中，主要是由于药量大部分被包埋在纤维内部(SEM图中纤维表面未观察到明显药物颗粒)，同时表明茶多酚和醇溶蛋白之间有氢键作用。其中图中a是茶多酚红外光谱图，由图可知茶多酚在780～2526cm-1有最主要的光谱峰。根据茶多酚结构得出：在3501.65cm-1峰，对应基团是-OH吸收峰，与3463.87～3445.56cm-1及3334.82～3383.51cm-1这俩相互差值最大的N-H峰相关；1540.17，1248.45cm-1处都存在N-H峰1407.10、1380.52、1338.54、1311.45、1248.4等多处都存在C--N峰。而负载茶多酚的醇溶蛋白红外光谱如图2中b-d所示，观察到茶多酚的特征峰几乎都发生了转移、强度降低。在载药纤维中属于茶多酚的在3501.65、1338.54、1311.45cm-1特征吸收峰强度也有不同，明显随着茶多酚在载药纤维中的比例增加，这些吸收峰逐渐增强。图中e是糯米醇溶蛋白红外光谱图，3221cm-1附近对应NH伸缩振动带，1200、1530、1600cm-1分别对应于蛋白质的特征吸收谱带酰胺III、酰胺II(C--N伸缩振动、N--H变形振动)、酰胺I(C＝O)。3501.65cm-1处-OH吸收带被完全掩盖，C＝＝O伸缩振动吸收带光谱降低，从1600cm-1移动至1588cm-1，氢键可能存在于醇溶蛋白的羧基和茶多酚的羰基之间。醇溶蛋白纳米纤维在322lcm-1处的N-H伸缩振动特征峰分别移至3222、3230、3257cm-1，说明复合纤维内的O-H、N-H基团形成了较多的氢键，使化学键键长增加，键能减少，伸缩振动频率降低。这也是导致茶多酚的加入使茶多酚/糯米醇溶蛋白纳米纤维膜分解温度升高的影响因素之一。
实施例1-实施例3糯米醇溶蛋白电纺纤维1-3及不同含量茶多酚的糯米醇溶蛋白/茶多酚电纺纳米纤维X射线衍射图如图3所示，其中，a为糯米醇溶蛋白纤维，b为5％，c为10％，d为15％，e为茶多酚。茶多酚XRD衍射谱图中存在一个较大尖峰，这表明在衍射角为2θ时，茶多酚是具有一定晶型的晶体材料。为观察电纺后茶多酚和醇溶蛋白物理状态变化，将茶多酚粉末与糯米醇溶蛋白粉末以10：100比例混合并进行扫描，物理混合物在13.97°、27.43°、、出现特征衍射峰，得出茶多酚在混合物中依然以结晶状态存在，未形成新的物理状态。醇溶蛋白的图案是宽的衍射峰，得出其为无定形态，静电纺丝后茶多酚的衍射峰消失，表明茶多酚从结晶态变为无定形态药物，与载体之间发生了一定复合效应，茶多酚与糯米醇溶蛋白分子之间存在相互作用，相反，若茶多酚与糯米醇溶蛋白之间无相互作用，两者的衍射峰图中会显示出各自的晶区特征峰，不会有峰叠加的效果。衍射图中负载15％的茶多酚的糯米醇溶蛋白纳米纤维存在部分强度较低的茶多酚浸提衍射峰，或者是由于过量茶多酚不能完全溶于溶剂系统中而显示出自已的特征峰。
茶多酚高温处理前后的色谱图如图4所示？大部分EGC(表没食子儿茶素)和EC(表儿茶素)被氧化降解；EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)和ECG(表儿茶素没食子酸酯)谱峰减小，并在峰后都相应出现一个明显的新色谱峰，对应为其各自的差向异构体GCG和CG；GA峰面显著增加，推测其原因可能时部分EGCG、ECG在高温下分解为GA、EGC、EC，而EGC和EC在高温下不能稳定存在，GA高温下相对稳定，所以最后所得溶液中GA含量增加。GA为没食子酸，也具有抗氧化性。所以本实验所得产品可以适应高温状况，不必担心温度对其抗氧化性的影响。
茶多酚及不同含量茶多酚的茶多酚/醇溶蛋白纳米纤维微分(DTG)热重曲线如图5所示，糯米纯醇溶蛋白纳米纤维主要失重发生在250-410℃范围内，跟蛋白质降解有关，茶多酚在250摄氏度以上才会分解。由此表征可知负载茶多酚的糯米醇溶蛋白复合纤维质量损失随着茶多酚质量分数的增加而减少，可能由于茶多酚比例的增加，茶多酚与蛋白质之间的氢键作用力越发明显，增加了茶多酚稳定性。负载茶多酚的醇溶蛋白纳米纤维降解温度比纯醇溶蛋白纳米纤维较低。与茶多酚分解程度相比，茶多酚/醇溶蛋白纳米纤维分解温度由278℃提高到320℃。这可能是由于茶多酚结晶态的改变导致了分解温度的升高，这也表明了二者成功结合。
从上述结构式可以看出，130℃对茶多酚各组分影响显著：大部分EGC(表没食子儿茶素)和EC(表儿茶素)被氧化降解；EGCG(表没食子儿茶素没食子酸酯)和ECG(表儿茶素没食子酸酯)谱峰减小，并在峰后都相应出现一个明显的新色谱峰，对应为其各自的差向异构体GCG和CG，其反应见图4；GA峰面显著增加，推测其原因可能时部分EGCG、ECG在高温下分解为GA、EGC、EC，而EGC和EC在高温下不能稳定存在，GA高温下相对稳定，所以最后所得溶液中GA含量增加。GA为没食子酸，也具有抗氧化性。所以本发明所得产品可以适应高温状况，不必担心温度对其抗氧化性的影响。
测试例2
称取实施例1-实施例3制备的负载不同质量分数茶多酚的糯米醇溶蛋白纳米纤维膜1-3各10mg。平行称取3组。将上述纳米纤维放入到装有50ml PBS缓冲溶液(PH＝7.4)(PBS具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首选。)的锥形瓶中，锥形瓶放置在恒温水浴(37℃)摇床中，(转速设置100r/min)早设定的时间间隔内取1.0ml的释放液，并补加1.0mlPBS缓冲溶液到锥形瓶，保持体积恒定，在茶多酚的最大吸收波长278nm处测定吸光值，在对应标准曲线方程计算药物浓度及释药量，然后计算累计释药百分率并作累计释药曲线，所制备的醇溶蛋白缓释抗氧化膜的释放性能，如图6所示。
图中显示检测到静电纺丝过程中几乎无药物损失，可以认为所制备的载药纤维中的药物理论含量与实际含量近似相同。图为茶多酚在37℃下的释放曲线，前1小时3种载药纤维的药物释放速率远远大于后段的释放速率，具有初期突释效应。释放总量分别为88.1％、91.7％、98.5％。所有曲线所变现出来的突释现象可能是由于纳米纤维表面吸附的药物分子溶解在缓冲溶液中，导致测试开始时存在一个快速释放期。随着纤维膜中药物含量的增加，药物初期的突释效应也越明显。原因在于一：载药量大的纤维单位体积内药物含量多，纤维内药物浓度大，药物扩散浓度梯度大，有利于纤维上的药物扩散溶解到释放介质中；二：载药量大的纤维直径小，相对而言其比表面积增大，纤维与缓冲溶液的接触面积增大，所以药物释放量增多。
通过数学模拟，载药量不同的复合纳米纤维药物释放规律相同，复合peppas模型。载药量5％、10％、15％的拟合方程分别是Q＝57.7t0.17(R2＝0.96)，Q＝64.4t0.15(R2＝0.92)Q＝75.9t0.12(R2＝0.87)。
一般认为，当n≤0.43时，药物的释放激励为fick扩散；当0.43＜n＜0.85时，药物释放机理为non-Fick扩散，即药物以扩散和骨架溶蚀协同作用机制释放；当n＞0.85时，释放机理为骨架溶蚀作用。而实施例l-实施例3制备的3种载药纳米纤维膜的扩散指数都小于0.43，说明药物释放遵从扩散机制：开始释放速度较快，后期释放速度变缓。开始释放快是由于药物在纤维表面附着，后期释放变缓，是由于分布在纤维内部的药物要克服聚合物分子链的阻碍才能到达缓冲溶液。
测试例3
(1)对比现有包装和抗氧化剂与使用本发明后的保质期与放置一年后的香榧油值和氢值，如表1所示：
表1
使用本产品作为缓释抗氧化系统后，同样放置一年后BHT、BHA、TBHQ、茶多酚等用于衡定食品是否新鲜的国际指标明显高于现有包装，说明使用了本产品达到了需要的缓释抗氧化剂的效果。
(2)对鱼鳞抗菌肽食品包装和本发明制作的膜的抗拉强度和延伸率对比，如表2所示：表2
如上表所示，可见本产品的抗拉程度和延伸率明显高于鱼鳞抗菌肽包装，其机械强度更高，适于用作产品的内包装。
