一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种含有阿西替尼的纳米纤维电纺膜及其制备方法和应用。
背景技术
软骨是一种细胞紧紧镶嵌在高度致密的天然细胞外基质(ECM)中的无血管、无神经、无淋巴的组织。由于软骨的再生能力很差，其修复重建一直是临床治疗的一大难题。组织工程技术为软骨缺损的修复提供了新途径，其中关节软骨修复已经初步实现了临床转化，但是针对皮下环境中的软骨缺损(如耳、鼻、气管等的软骨缺损)则一直没有取得突破性进展。皮下软骨再生的主要困境是，在将具有临床应用前景的干细胞构建的软骨组织植入关节微环境时，很容易形成稳定的软骨组织并修复缺损；但植入皮下微环境时，却容易发生骨化或纤维化从而丧失软骨表型和功能。
这可能与干细胞在修复缺损时所处的不同生存微环境有关：关节环境没有血管，而皮下环境血管丰富。发育生物学研究已证实，软骨内骨化主要是由于软骨细胞肥大化，分泌的关键性因子，如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)诱导内皮细胞入侵并形成血管，最终使成骨细胞、破骨细胞向软骨基质转移并骨化。软骨内骨化的关键启动因素是血管化，这也是长干骨发育的经典模式。
目前研究者们采用各种方法来抑制干细胞再生软骨的骨化：(1)He等人[He etal.Electrospun gelatin/polycaprolactone nanofibrous membranes combined with acoculture of bone marrow stromal cells and chondrocytes for cartilageengineering,Int J Nanomedicine.2015,10:2089-99.]将干细胞和软骨细胞混合共培养来构建软骨组织以抑制骨化，但是软骨细胞来源有限，需要经历二次手术取材，创伤大，无法广泛应用于临床。(2)Liu等人[Liu et al.The dependence of in vivo stableectopic chondrogenesis by human mesenchymal stem cells on chondrogenicdifferentiation in vitro.Biomaterials.2008,29:2183-92.]通过长期(12周)体外诱导培养，可使干细胞分化而来的软骨细胞成熟化。但长期的体外诱导培养，需花费大量人力物力，并且细胞容易导致感染，对临床推广应用极为不利。
阿西替尼(Axitinib)是辉瑞公司研发的新一代抗肿瘤药物，临床上主要用于既往接受过一种酪氨酸激酶抑制剂或细胞因子治疗失败的进展期肾细胞癌(RCC)的成人患者。阿西替尼具有显著的抗血管活性，它可选择性地抑制血管内皮生长因子受体的活性，从而减少血管的生成，抑制肿瘤的生长。2012年国际多中心AXIS研究显示，阿昔替尼优于索拉非尼(NCT00678392)，2015年中国临床研究显示，阿昔替尼优于索拉非尼。阿西替尼同时具有超强的化学结构稳定性，它是一种小分子化合物，分子式：C22H18N4OS，分子量：386.47，不像单克隆抗体等大分子蛋白质，在载入材料的过程中空间结构容易遭到破坏从而失去活性。
静电纺丝技术是一种利用高压静电场力将聚合物制备成纳-微米超细纤维的制备技术。胶原是一种天然的高分子材料，具有极佳的细胞亲和性。聚己内酯(PCL)是经美国FDA认证的一种医用可生物降解的合成材料，具有良好的生物相容性和优良的力学性能。
发明内容
为解决软骨在皮下环境中再生容易骨化的问题，本发明提供一种生物相容性好，可降解吸收，并能够显著抑制血管生成的纳米纤维材料。
本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供一种抑制干细胞再生软骨骨化的纳米纤维电纺膜，其为载入阿西替尼的胶原/聚己内酯纳米纤维电纺膜。
可选的，所述阿西替尼的载入量不少于1％。
可选的，所述阿西替尼的载入量为2％～20％。
可选的，阿西替尼、胶原和聚己内酯的质量比为2％-20％：5％-90％：5％-90％。
可选的，阿西替尼、胶原和聚己内酯的质量比为6：40：60。
第二方面，本发明提供上述纳米纤维电纺膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将阿西替尼溶解在含微量乙酸的三氟乙醇或六氟异丙醇中，然后将胶原和聚已内酯按比例混合后加入到该溶液中，搅拌至混合均匀，得胶原/聚己内酯纺丝液；
(2)抽取上述纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行电纺；
(3)电纺完毕，将电纺膜真空干燥后，得到纳米纤维电纺膜。
可选的，胶原与聚已内酯总含量与三氟乙醇或六氟异丙醇的质量体积比为5％-30％g/ml。
第三方面，本发明提供上述纳米纤维电纺膜在制备抑制干细胞再生软骨骨化的医疗器械中的应用。
可选的，所述纳米纤维电纺膜抑制骨髓间充质干细胞再生软骨在皮下发生骨化。
第四方面，本发明提供一种生物医学材料，其为包裹了上述纳米纤维电纺膜的组织工程软骨块。
本发明与现有的技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明方法操作简单，成本低，耗时短，只需向静电纺丝液中加入少量Axitinib就能制备出具有超强抗血管活性的纳米纤维材料。
(2)本发明使用的Axitinib是临床用药，安全性高，并且Axitinib结构稳定，极易分散在电纺丝液中，制备出的纤维光滑均一，可实现连续的纳米纤维工业化生产。
(3)本发明方法制得的载Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜可有效防止干细胞再生软骨在皮下发生骨化，可制备成不同厚度，裁剪成不同形状，适合不同部位的软骨再生需求。除此之外，还可应用于其它无血管组织如角膜、肌腱的再生。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：载0％、1％、3％和6％的Axitinib和胶原及聚己内酯溶解在含微量乙酸的六氟异丙醇中的照片。
图2：载0％、1％、3％和6％的Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜的大体观。
图3：载0％、1％、3％和6％的Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜的扫描电镜照片。
图4：载Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜的体外生物相容性研究结果。A为BMSCs在培养皿底部的形态；B为BMSCs在不同材料上的吸光度值；C为BMSCs在不同材料上的荧光显微镜照；D为软骨细胞在培养皿底部的形态；E为软骨细胞在不同材料上的吸光度值；F为软骨细胞在不同材料上的荧光显微镜照。
图5：载Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜的体外活性研究结果。A为接种第1天内皮细胞在不同材料上的细胞核染色照片；B为接种第1天内皮细胞在材料上的增殖情况；C为接种第5天内皮细胞在不同材料上的细胞核染色照片。
图6：组织工程软骨块构建过程示意图。A为圆柱形PGLA支架；B-C为PGLA支架的扫描电镜图；D为PGLA支架的纤维直径分布图；E为BMSCs接种在PGLA支架上的大体观；F-H为BMSCs接种在PGLA支架上第1、7、14天的扫描电镜图；I为BMSCs-PGLA支架复合物体外成软骨诱导4周后的大体观；J-L为I图中的组织块病理切片染色图(J为HE染色、K为番红-固绿染色、L为Masson染色)。
图7：纳米纤维膜包裹组织工程软骨块并植入裸鼠皮下(A)及皮下植入4周、12周与24周后的大体观(B)。
图8：组织工程软骨块体内植入4周后的病理切片染色照片。
图9：组织工程软骨块体内植入12周后的病理切片染色照片。
图10：组织工程软骨块体内植入24周后的病理切片染色照片。
图11：组织工程软骨块体内植入24周后的micro CT照片。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例1：载Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜的制备
分别称取0毫克、12毫克、36毫克、72毫克的Axitinib溶解在10毫升的六氟异丙醇中，并向该溶液加入20-30微升乙酸，搅拌至混合均匀。然后分别向上述四种不同浓度的Axitinib溶液中加入0.48克胶原和0.72克聚己内酯配成质量体积百分比为12％g/ml的纺丝液(胶原和聚己内酯总质量与六氟异丙醇溶液的体积百分比)。选用10ml的注射器，1.2mm内径的针头，抽取胶原/聚己内酯纺丝液，固定在静电纺丝装置上进行纺丝。电纺参数为：电压8-15kv，接收距离10-15cm，注射速率1-3ml/h，温度15-30℃，相对湿度30-60％。采用滚筒作为接收装置，得到载Axitinib量分别为0％、1％、3％和6％(w/w)的胶原/聚己内酯纳米纤维膜(Axitinib的质量在胶原和聚己内酯总质量中的百分比)，将制备的纳米纤维膜放入真空干燥箱中干燥一个星期除去残留的有机溶剂备用。
如图1所示，Axitinib、胶原、聚己内酯在六氟异丙醇中均能够很好的互溶，形成的溶液透明均一。如图2所示，从大体上看，材料呈白色，质地柔软，大小可任意裁剪，厚度可任意控制。如图3所示，小分子Axitinib的载入并没有降低材料的可纺性，形成的纤维形貌光滑、均一。
实施例2：载Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜的体外生物相容性及体外活性研究
分离兔骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和兔耳廓软骨细胞，进行体外培养并扩增。将载0％、1％、3％和6％的Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜消毒后置入24孔板底部备用。将第二代的BMSCs和第二代的软骨细胞分别接种在四种不同含量的载Axitinib的纳米纤维材料上。接种后第1天，第4天和第7天，在培养液中加入CCK8溶液孵育，检测上清液的吸光度以判断细胞在材料上的增殖效率。接种后第1天，第7天，对细胞进行固定，并对细胞核和细胞骨架进行荧光染色和拍照。
结果如图4所示，与不载Axitinib的纳米纤维材料比较起来，Axitinib的载入并没有明显影响到BMSCs和软骨细胞形貌、生长和增殖。说明载Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜生物相容性好，对BMSCs和软骨细胞没有明显的毒副作用。
将人脐静脉内皮细胞接种在载0％、1％、3％和6％的Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜上，接种后第1天，一方面对细胞进行固定，并对细胞核染色以观察细胞粘附的数量，另一方面在培养液中加入EdU孵育，检测内皮细胞处于DNA复制期的细胞核数量；接种后第5天，对细胞进行固定，通过细胞核染色以观察细胞增殖的数量。
结果如图5所示，与不载Axitinib的纳米纤维材料比较起来，刚开始(第1天)，Axitinib的载入没有影响内皮细胞在材料上的粘附(细胞核染色)，但是却显著地抑制了内皮细胞的增殖(EdU染色)，随着培养时间的延长(第5天)，抑制内皮细胞增殖的现象更加明显，并且这种抑制有着明显的剂量依赖效应。说明载Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜对内皮细胞的生长具有明显的抑制作用。
实施例3：体外构建干细胞来源的组织工程软骨块
选用圆柱形PGLA无纺支架，如图6A所示。用扫描电镜观察支架，如图6B-C，可见纤维粗细均匀一致，测量纤维直径分布，如图6D，PGLA纤维直径为12.7±1.8um。将第二代的BMSCs接种在PGLA支架上，如图6E，体外成软骨诱导培养，每隔一段时间，SEM观测支架上细胞贴附生长状况，如图6F-H(图6F为细胞接种第1天，图6G为接种第7天，图6H为接种第14天)。可知随着培养时间的增加，细胞基质分泌增加，逐渐填充了PGLA纤维间的空隙。在成软骨诱导4周后，整个BMSCs诱导来的组织工程软骨块(BMSCs engineered cartilage,BEC)呈现软骨样外观，如图6I。对I图中的组织工程软骨块进行病理切片染色，HE染色如图6J，番红-固绿染色如图6K，Masson染色如图6L，可知经过4周成软骨诱导，组织工程软骨块已呈现出大量的“陷窝样”结构，并且有软骨特异性基质沉积。
实施例4：将组织工程软骨块用载Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜包裹并植入裸鼠皮下
将首先裁剪载0％、1％、3％和6％的Axitinib的胶原/聚己内酯纳米纤维膜成18mm×18mm大小的方块，无菌消毒备用。将体外构建出的组织工程软骨块放置在纳米纤维材料上，包裹后植入6-8周雄性裸小鼠皮下，其操作过程如图7A所示。裸鼠皮下植入4周、12周与24周后取样，首先进行大体观察并拍照，结果如图7B所示。体内依照BEC是否有纳米纤维包裹以及纳米纤维中Axitinib含量的高低分为对照组、0％Axitinib组、1％Axitinib组、3％Axitinib组和6％Axitinib组，其中对照组为无纳米纤维材料包裹的组织工程软骨块。
从图7B中可以看出无任何材料保护的对照组在体内植入4周即有明显血管附着，随着植入时间的延长，血管附着现象更加明显。在材料中载入Axitinib后，能够显著抑制血管在材料表面附着，并且随着Axitinib含量的增加，抑制血管附着的现象更加明显。
实施例5：载Axitinib纳米纤维材料对皮下再生软骨表型稳定作用的功效评价
将图7B中体内植入后的组织工程软骨块进行病理染色(HE染色、番红-固绿染色、Masson染色、二型胶原染色)和影像学(Micro CT)检测以评价成骨或成软骨指标。
如图8所示，从染色结果来看，对照组大部分区域受血管的侵蚀，出现有大量骨样结构，仅样本中间区域有部分软骨细胞残存。0％Axitinib组整体维持组织结构的完整，但是软骨的质量不佳，番红-固绿染色中出现了部分绿染，Masson染色和二型胶原染色不均一。而1％Axitinib组、3％Axitinib组和6％Axitinib组均呈现大量均一的陷窝样软骨细胞结构，番红和Masson染色呈强阳性，二型胶原染色较深并且均一。说明载Axitinib的纳米纤维膜能够抵御血管的入侵，维持干细胞来源的再生软骨在体内表型的稳定。
如图9所示，从染色结果来看，对照组和0％Axitinib组都出现了大面积的骨样结构，1％Axitinib组也出现了部分骨样结构，软骨质量不佳，番红-固绿染色中出现了部分绿染，Masson染色和二型胶原染色不均一。但是3％Axitinib组和6％Axitinib组均呈现大量均一的陷窝样软骨细胞结构，番红和Masson染色呈强阳性，二型胶原染色较深并且均一。说明随着体内植入时间的延长，载1％Axitinib的纳米纤维膜不足以抵抗血管的入侵，也不足以维持再生软骨表型的稳定。
如图10所示，从染色结果来看，对照组和0％Axitinib组已经出现了严重的基质重塑，软骨细胞退化消失，取之以骨样结构。1％Axitinib组也出现了大部分骨样结构，仅少量软骨细胞残留。然而3％Axitinib组和6％Axitinib组仍然呈现出大量均一的陷窝样软骨细胞结构，番红和Masson染色呈强阳性，二型胶原染色深并且均一。说明随着体内植入时间的延长，载3％和6％Axitinib的纳米纤维膜均足以抵抗血管的入侵，维持再生软骨表型的稳定。
如图11所示，对照组和0％Axitinib组骨化严重，二维扫描和三维重建均可见大量白色钙化区，1％Axitinib组钙化区主要分布在组织边缘，中央区域亦有部分钙化，3％和6％Axitinib组仅在组织边缘见少许钙化区域。以上结果进一步说明载3％和6％Axitinib的纳米纤维膜可有效防止干细胞再生软骨在皮下发生骨化。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
