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一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法

2021-04-06 18:55:18

一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法

　　技术领域

　　本发明属于电化学和分析化学领域，具体涉及一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。

　　背景技术

　　在影像学检查显示出明显的癌症发病迹象前，癌症患者外周血中已经出现循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)。ctDNA是癌症病人血液中肿瘤源性的游离DNA(cell- free DNA，cfDNA)。ctDNA主要来源于坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞和肿瘤细胞分泌的外排体，在肿瘤病人血浆中的含量最高。液体活检是一种非侵入式检测技术，它是以体液为样品，实现对疾病标志物含量测定的一种分析方法。利用液体活检技术对体液中ctDNA高灵敏度测定具有重要意义。但是，ctDNA仅占cfDNA的0.1％～5％，且不同癌种、不同病程的癌症患者ctDNA在体液中含量差异较大。如何提高液体活检对极微量肿瘤来源核酸等标志物检测的灵敏度和选择性，仍是一个极具挑战的研究课题。建立灵敏度高、特异性强的ctDNA液体活检方法具有重要理论意义和实用价值。因此，该发明提供了一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法，具有方法简单、灵敏度高的特点。

　　发明内容

　　本发明旨在发明一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。

　　鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。

　　实现本发明目的技术方案是：

　　首先，将AuNPs@ZnSeNSs修饰到GE上，然后通过Au-S键将FP固定在 AuNPs@ZnSeNSs/GE上。加入含有KLK2的样品后，电极表面的FP和溶液中的RP在重组酶聚合酶存在下进行RPA扩增。在电极上扩增了靶标，并在电极表面捕获了RP。洗涤后，St-ALP通过生物素和链霉亲和素之间的亲和作用连接在电极上。ALP催化水解p-NPP为p-NP。由于ALP的高催化活性，产生了许多p-NP。在MB和p-NP的作用下产生强的光电信号，根据PEC信号强度实现KLK2含量的测定。由于MB和p-NP共调控作用、MB的循环，以及重组酶聚合酶扩增实现了目标物的高灵敏度检测。在MB和p-NP存在的情况下， AuNPs@ZnSeNSs/GE在0V时产生强的光电流，具有自供能特性，结合原位重组酶聚合酶扩增策略，建立了一种前列腺癌循环肿瘤DNAKLK2液体活检新方法。该方法测定KLK2具有高的灵敏度，检测限为30aM。这种自供能光电化学结合原位重组酶聚合酶扩增传感为PEC分析方法发展开辟了新的道路。提供一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法。

　　本发明是通过以下措施来实现的：一种重组酶聚合酶扩增光电化学循环肿瘤DNA液体活检的方法，其特征是包括以下步骤：

　　(1)ZnSe纳米片的制备；

　　(3)KLK2检测；

　　(4)电化学和光电化学测量。

　　优选的，所述的ZnSe纳米片的制备包括以下步骤：

　　通过超声剥离方法剥离得到ZnSe纳米片(ZnSeNSs)。首先，将0.1 mg～450mg的ZnSe加到1mL～150mL DMF溶液中，然后将混合物通过超声分散0.1h～100h，以获得黄色分散液。接下来，在14,000rpm条件下离心20min，从分散液中分离出剥离的ZnSe，并用乙醇洗涤3次。最后，将ZnSeNSs悬浮液用于下一实验。

　　优选的，所述的AuNPs@ZnSeNSs的合成包括以下步骤：

　　通过原位生长法制备AuNPs@ZnSeNSs。将0.1mL～30mL ZnSeNSs和0.1 mL～10mLHAuCl4·4H2O加入到烧瓶中，在搅拌下通过油浴加热至115℃。溶液继续回流并搅拌3分钟。然后，将0.1mL～10mL 1.66mg/mL的柠檬酸钠溶液滴入烧瓶中。将该混合物在115℃下回流3分钟，得到黑色的AuNPs@ZnSeNSs。在14,000rpm条件下离心10min，收集最终的黑色沉淀物。在AuNPs@ZnSeNSs 的合成方法中，不同质量的氯金酸会影响PEC信号。ZnSeNSs与氯金酸的质量比分别为1:0.2、1:0.33、1:0.66、1:1、1:1.5。

　　优选的，所述的KLK2检测包括以下步骤：

　　首先，将1μL～60μL AuNPs@ZnSeNSs滴到金电极表面，并在空气中自然干燥。然后将1μL～60μL的10mM TCEP加到1μL～60μL的10μM FP溶液中，将混合物溶液在37℃下孵育。60分钟后，将1μL～60μL混合物添加到 AuNPs@ZnSeNSs/GE的表面，并在37℃条件下孵育2小时，得到 FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE。然后，将FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE浸入1mM MCH 溶液中1h以消除非特异性吸附。接下来，制备RPA溶液用于KLK2基因的表面扩增。RPA反应溶液由2.4μL10μM RP，13.2μL不含DNase的水，31.9μL 重组酶聚合酶缓冲溶液和2.5μL 280mM醋酸镁溶液制成。然后将1μL～50μL 该RPA溶液和1μL～50μL含KLK2的样品添加到FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE的表面上。在37℃扩增30分钟后，电极用0.1M PBS洗涤。最后，将电极浸入 2μL～60μL 1μM St-ALP溶液中，在37℃下孵育30分钟，用0.1M PBS洗涤电极，将电极插入p-NPP和MB的溶液中，ALP催化水解p-NPP为p-NP。在 MB和p-NP的作用下产生强的光电信号，根据PEC信号强度实现KLK2含量的测定。

　　优选的，所述的电化学和光电化学测量包括以下步骤：

　　在含0.1M KCl的5.0mM[Fe(CN)6]3-4中测量电化学阻抗谱(EIS)响应。 PEC信号是在pH 7.4的0.1M磷酸缓冲溶液中测量的，该缓冲溶液含有p-NPP和 MB，光源为10W LED灯。电压0V，开-关灯时间间隔为10s。

　　发明的优点与效果

　　当KLK2的浓度范围从5.0×10-17M到2.0×10-15M变化时，PEC信号显著增加(图2(B))。绘制了线性回归曲线，显示PEC信号与KLK2浓度的对数成比例关系。回归方程表示为I＝-2027.logc+2185(R2＝0.9992)，c是KLK2浓度(aM)。方法的检出限(LOD)为30aM。

　　为了评估方法的特异性，分别考察了包含PCA3，SChLAP1，PSA基因， TMPRSS2-ERG(浓度分别为500aM)对KLK2的干扰情况，如图3(A)所示，只有KLK2和含KLK2的混合物具有较高的PEC响应。所有其他物质都不会对 KLK2的测定造成明显干扰，这证明了该PEC测定法对KLK2检测具有高选择性。

　　12个周期开关灯测试考察稳定性方法的稳定性，如图3(B)所示。在连续开/关循环照射下，PEC响应几乎保持不变，表明MB和p-NP共调控的自供能PEC分析的响应足够稳定。将构建的电极，储藏在4摄氏度下，每5天测量一次。图3(C)中的PEC反应无明显变化。结果表明，MB和p-NP共调控的自供能PEC测定具有良好的稳定性和可重复性。

　　附图说明

　　图1(A)PAGE分析。+，阳性样本；No T，没有目标。(B)在0.1M KCl、5.0mM[Fe(CN)6]3-/4-中的EIS响应：裸GCE(a)，AuNPs@ZnSeNSs/GE (b)，FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE(c)，MCH/FP/AuNPs@ZnSeNSs/GE(d)，重组酶聚合酶扩增后(e,f)。

　　图2不同浓度的KLK2对应的PEC信号大小(A)，从a到j对应的KLK2 浓度为0aM、30aM、50aM、70aM、100aM、200aM、500aM、700aM、 1000aM、2000aM。检测KLK2的线性回归(B)，插图为KLK2浓度在50aM 到2000aM之间时，浓度的对数与PEC信号线性回归曲线。

　　图3分析方法的特异性、稳定性和可重复性。(A)选择性，干扰物的浓度分别为5.0fM，KLK2浓度为500aM。(B)在连续的开/关下进行稳定性考察。构建的电极在保存20天的重现性。稳定性和重现性测量中，KLK2的浓度均为1.0fM。

　　具体实施方式

　　下面的实例将进一步说明本发明的操作方法，但不构成对发明的进一步限制。

　　实例1：MB和p-NP共调控自供能PEC分析检测方法的表征。

　　在PEC KLK2分析中，RPA用于扩增靶标。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(图1(A))验证了靶标扩增的可行性。凝胶电泳结果表明KLK2 扩增过程是成功的。众所周知，电化学阻抗谱(EIS)也可以用于监测修饰电极的制造。为了进一步表征PEC生物传感器的构建过程，在包含0.1M KCl的5.0 mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行EIS测量。如图1(B)所示，GE显示较小的Ret值(曲线a)。当AuNPs@ZnSeNSs修饰到GE上时(曲线b)，与裸GE相比，Ret值有所提高。将FP修饰到AuNPs@ZnSeNSs/GE上(曲线c)后，Ret值增加。电极与MCH作用后，Ret值进一步增加(曲线d)。最后，在AuNPs@ZnSeNSs/GE上进行重组酶聚合酶扩增后，Ret显著增加(曲线e)。从曲线a到曲线e的EIS结果表明，分析方法的构建是成功的。

　　实例2：样品检测

　　三羟甲基氨基甲烷(Tris)、巯基乙胺(MCH)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)和链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(St-ALP)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)由 Sangon Biotech Co.，Ltd.(中国，上海)提供。TwistAmp Basic RT-RPA试剂盒(Twist-DX)、重组酶聚合酶缓冲溶液从Babraham(UK)购买的。生物素标记的反向引物(RP)、巯基化正向引物(FP)由SangonBiotech Co.，Ltd.(中国，上海)合成，

　　正向引物和反向引物的序列如下：

　　KLK2正向引物(FP)：5'-SH-GGGGGTCCACTTGTCTGTAA-3'

　　KLK2反向引物(RP)5'-GGTGAGTTCCAAGCTTCAGG-biotin-3'

　　KLK2基因：5'-GGGGGTCCA CTTGTCTGTA ATGGTGTGCT TCAAGGTATC ACATCATGGGGCCCTGAGCC ATGTGCCCTG CCTGAAAAGC CTGCTGTGTA CACCAAGGTG GTGCATTACC GGAAGTGGATCAAGGACACC ATCGCAGCCA ACCCCTGAGT GCCCCTGTCC CACCCCTACC TCTAGTAAAT TTAAGTCCACCTCACGTTCT GGCATCACTT GGCCTTTCTG GATGCTGGAC ACCTGAAGCT TGGAACTCAC C-3'

　　聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析是使用ADYCP-31E电泳仪(WoDeLife SciencesInstrument Co.，Ltd.，中国)进行的。所有光致电化学(PEC)测量均在CHI660E电化学工作站上进行(中国，上海辰华仪器有限公司)。

　　取人血清，采用标准加入法检测健康人血清样品中的KLK2，并将本法测定KLK2浓度与qRT-PCR测定的浓度进行比较。从表1可以看出，当0.1fM、 1.0fM、5.0fM、10.0fM浓度的KLK2添加在血清样品中时，其回收率为 96.7％～103.8％，相对标准偏差(RSD)在1.7％～3.8％之间。与标准方法qRT-PCR 相比，PEC的测定结果与qRT-PCR结果吻合较好。结果证明了该方法在实际样品分析中的可行性和准确性。

　　表1 健康人血清中KLK2的测定(n＝9)