三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料及其在抑制基因接合转移中的应用
技术领域
本发明涉及三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料及其在抑制基因接合转移中的应用。
背景技术
抗生素及其他抗菌药在医疗、畜禽产业、农业等中的误用以及过量使用，导致细菌的耐药性不断提高，甚至产生多耐药性，进而催生了一类细菌―“超级细菌”。耐药基因是耐药性的物质基础，畜禽粪便是一个巨大的耐药基因库，具有各种各样可转移的耐药基因。耐药基因通过各种途径(如养殖场畜禽的粪便、污泥等)进入土壤、水体、沉积物等，然后通过基因水平转移的方式向周围环境中的细菌、植物 (如蔬菜等) 等中扩散，从而导致“耐药基因”污染及扩散。因此，设计、合成和应用低成本、高效的纳米新材料来抑制耐药基因水平转移具有重要的意义。
近年来，纳米材料得到了广泛的应用，包括纳米三氧化二铝、二氧化钛等。其中，纳米三氧化二铝、二氧化钛等会促进耐药基因水平转移；此外，多壁碳纳米管、纤维蛇纹石、α-海泡石等可以促进转化，进而促进耐药基因的水平转移。这些纳米材料的应用不利于耐药基因污染的防控。因此，开发高效的纳米新材料来抑制耐药基因水平转移才是重中之重。而基因水平转移主要有三种方式：转化、接合和转导。其中接合转移是耐药基因水平转移中容易发生的转移方式。半导体光催化抗菌剂具有制备简单、原料丰富、抗菌广谱性和持续性等优点得到广泛应用。三氧化二铁纳米颗粒的尺寸依赖性强、低毒以及与细胞和组织的生物相容性，因此特别适合于传感器和药物递送应用。三氧化二铁是环境条件下最稳定的具有n型半导体性能的氧化铁，因其成本低、耐腐蚀性强、环保等特点，被广泛应用于催化剂、颜料、气体传感器、电极材料等。将三氧化二铁与片状半导体硫化钼复合能够增大材料比表面积，增强材料的稳定性，同时环境友好且能显著抑制耐药基因接合转移。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有技术中存在的问题，提供一种三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料及其在抑制基因接合转移中的应用。
本发明的目的是这样实现的，一种三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料，其特征在于，制备时，包括如下步骤：
（1）称取8-16mmol的七水合硫酸亚铁加入15-30ml的去离子水中，作为第一溶液，称取1.6-3.2mmol的次氯酸钠加入到16-32ml去离子水中，作为第二溶液；
（2）将第二溶液逐滴加入到第一溶液中，并不断搅拌，直到出现淡黄色透明溶液，作为第三溶液，将第三溶液移入100ml的聚四氟乙烯高压反应釜中，160-180℃下加热反应12-14h；待冷却到室温后，离心分离得到沉淀物，分别用去离子水和无水乙醇清洗沉淀物， 40-60℃烘干，研磨，得到三氧化二铁纳米粒子；
（3）称取5-10mmol的硫脲和1-2mmol的钼酸钠于60ml去离子水中，再加入0.05-1g的步骤（2）中的三氧化二铁纳米粒子，得到混合液，将混合液置于100ml高压釜中，加热至180-200度，反应20-22小时后，冷却到室温，得到黑色混合沉淀物；
（4）将步骤（3）中的黑色混合沉淀物离心分离，分别用去离子水和无水乙醇洗涤若干次，50-60度干燥得到三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料。
2．根据权利要求1所述的三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料，其特征在于，步骤（2）中，所述将第二溶液逐滴加入到第一溶液中，反应温度为160-180℃，反应时间为12-14小时，干燥温度为40-60℃。
3. 利用权利要求1所述的三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料在抑制基因接合转移中的应用，其特征在于，三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料用于抑制基因的水平转移，具体过程如下：
a)实验前准备：准备15ml玻璃试管若干、5ml玻璃试管若干、1.5ml离心管若干、胰酪大豆蛋白胨液体培养基培养液、胰酪大豆蛋白胨固体培养基、磷酸缓冲溶液，并全部进行高压蒸汽灭菌121度，40分钟，备用；氯霉素、氨苄青霉素、链霉素溶液过滤灭菌，备用；
b)摇菌：取两只15ml玻璃试管，分别加入10-12ml的胰酪大豆蛋白胨液体培养基培养液，其中在接种大肠杆菌DH5α的15ml玻璃试管中加入氯霉素和氨苄青霉素，接种大肠杆菌HB101的15ml玻璃试管中加入链霉素，将15ml玻璃试管置于恒温振荡器，在37度下，160r/min培养14小时，获得供体菌株—携带具有氯霉素和氨苄青霉素抗性的性质粒的大肠杆菌DH5α，受体菌株—具有链霉素抗性的大肠杆菌HB101，并使得菌落计数达到约5×108 CFU/mL；
c)取37度培养过夜的供体大肠杆菌DH5α与受体大肠杆菌HB101用0.2 mol的磷酸缓冲溶液洗涤2~3次以去除菌体中的培养基以及抗生素，再用磷酸缓冲溶液将细菌稀释到设定的浓度；
d)分别取1.5毫升c)中的细菌悬浮液于5ml玻璃试管中并混匀，在5ml玻璃试管分别加入0-0.6mg三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料，并以未加三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料的组份作为对照；
e)将以上加入不同浓度三氧化二铁-硫化钼复合材料的实验组和未加三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料的对照组接合培养，培养结束以后取菌液涂于含氯霉素抗性及链霉素抗性的胰酪大豆蛋白胨固体培养基上，然后30度培养24-36小时；统计各胰酪大豆蛋白胨固体培养基上的菌落数，计算接合转化子以及接合转移频率，然后分析不同剂量的三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料对耐药基因在种内接合转移的影响。
大肠杆菌DH5α与大肠杆菌HB101是属于同一种属，因此利用大肠杆菌DH5α与大肠杆菌HB101进行的接合实验属于种内接合实验；供受体菌培养时间为14小时，三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料的量为0-0.6mg，取接合培养后的菌液涂于含氯霉素抗性及链霉素抗性的胰酪大豆蛋白胨固体培养基后，培养温度为30度，培养时间为24-36小时。
通过本发明，相对于现有技术，本发明取得了以下有益效果：
1、步骤（2）中必须将溶液2逐滴加入到溶液1中，才能充分反应、混合溶液。
2、步骤（3）加热反应温度、时间，必须控制在合适的范围内，才能使物质充分接触合成复合物。
3、步骤（5）中菌培养时间，材料的量，培养皿培养温度、时间，必须控制在合适的范围，才能使材料与大肠杆菌作用的效果达到最佳，取得显著的抑制耐药基因接合转移效果。
综上，本发明涉及三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料及其在抑制基因接合转移中的应用，包括如下步骤：将七水合硫酸亚铁加入去离子水中作为第一溶液，将次氯酸钠加入去离子水中作为第二溶液，将第二溶液逐滴加入第一溶液中，不断搅拌，直至变成淡黄色透明溶液，作为第三溶液，将第三溶液于高压釜中反应若干小时后，离心、洗涤、烘干，得到三氧化二铁纳米粒子。将硫脲和钼酸钠溶于去离子水中，并将之前合成好的三氧化二铁加入硫化钼的合成体系中，于高压釜中反应若干小时后，离心分离得到沉淀物，清洗、烘干过夜，得到硫化钼-三氧化二铁复合纳米材料。以携带具有氯霉素和氨苄青霉素抗性的性质粒的大肠杆菌DH5α作供体菌株，以具有链霉素抗性的大肠杆菌HB101为受体菌株。使用适当用抗生素培养好的供体和受体细菌离心，去除上清液，用磷酸盐缓冲液悬浮。反复几次洗涤后将细菌重新用磷酸盐缓冲液制成特定浓度的菌液。后将供体和受体混合，加入三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料。并设空白对照实验与实验组在30℃培养箱中培养后，计数并计算转移率。该三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料用于抑制种间耐药基因转移，具有易回收、成本低、性能好、生物毒性小等优点，未来在处理含耐药基因的畜禽粪便，及污染的土壤、水中的应用提供良好的理论基础和现实指导意义。
附图说明
图1为本发明实施例1的三氧化二铁复合纳米材料的透射电镜图；
图2为本发明实施例1的硫化钼复合纳米材料的透射电镜图；
图3为本发明实施例1的三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料的透射电镜图；
图4为本发明实施例2的三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料在不同浓度下抑制耐药基因接合转移效果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
本发明的一种半导体钒酸铋-羟基氧化铁纳米酶的制备，依次包括如下步骤：
实施例1
（1）称取8mmol的七水合硫酸亚铁加入15ml的去离子水中，作为溶液1，称取1.6mmol的次氯酸钠加入到16ml去离子水中，作为溶液2；
（2）将溶液2逐滴加入到溶液1中，并不断搅拌，直到出现淡黄色透明溶液，作为溶液3，将溶液3移入100ml的聚四氟乙烯高压反应釜中，180℃下加热反应12h。待冷却到室温后，离心分离得到沉淀物，分别用去离子水和无水乙醇清洗，60℃烘干，研磨，得到三氧化二铁；
（3）称取5mmol的硫脲和1mmol的钼酸钠于60ml去离子水中，再加入0.1g的步骤（2）中的三氧化二铁纳米粒子，将混合液置于100ml高压釜中，加热至200度，反应20小时后，冷却到室温，得到黑色混合沉淀；
（4）将步骤（3）中的黑色混合物离心分离，分别用去离子水和无水乙醇洗涤几次， 50-60度干燥得到三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料。
图1为三氧化二铁复合纳米材料的透射电镜图，图2为硫化钼复合纳米材料的透射电镜图，图3为硫化钼-三氧化二铁复合纳米材料的透射电镜图。图中可以看出所得的复合物具有片状包裹纳米球的形态。
结合具体实施例进一步说明本发明中一种半导体钒酸铋-羟基氧化铁纳米酶检测过氧化氢的方法。
实施例2
将实施例1所得三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料用于抑制基因接合转移性能，具体过程如下：
1) 实验前准备：15ml玻璃试管若干，5ml玻璃管若干，1.5ml离心管若干，胰酪大豆蛋白胨液体培养基，胰酪大豆蛋白胨固体培养基，磷酸缓冲溶液，全部进行高压蒸汽灭菌121度，40分钟，备用；氯霉素、氨苄青霉素、链霉素溶液过滤灭菌，备用。
2) 摇菌：取两只15ml玻璃试管，分别加入10-12ml的胰酪大豆蛋白胨液体培养基培养液，其中在接种大肠杆菌DH5α试管中加入适当氯霉素和氨苄青霉素，接种大肠杆菌HB101的试管中加入适当链霉素，将试管置于恒温振荡器，在37度下，160r/min培养14小时，获得供体菌株—携带具有氯霉素和氨苄青霉素抗性的性质粒的大肠杆菌DH5α，受体菌株—具有链霉素抗性的大肠杆菌HB101，并使得菌落计数达到约5×108 CFU/mL；
3) 取 37度培养过夜的供体大肠杆菌DH5α与受体大肠杆菌HB101用0.2 mol的磷酸缓冲溶液洗涤2~3次以去除菌体中的培养基以及抗生素，再用磷酸缓冲溶液将细菌稀释到一定的浓度；
4) 分别取1.5毫升c)中的细菌悬浮液于5ml玻璃试管中并混匀，在玻璃管分别加入0-0.6mg步骤（4）的三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料，并以未加材料的组份作为对照；
5) 将以上加入不同浓度三氧化二铁-硫化钼复合材料的实验组和未加三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料的对照组置于特定温度下接合培养，培养结束以后取一定体积的菌液涂于含氯霉素抗性及链霉素抗性的胰酪大豆蛋白胨固体培养基上，然后30度培养24-36小时。统计各平板上的菌落数，计算接合转化子以及接合转移频率，然后分析不同剂量的三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料对耐药基因在种内接合转移的影响。
图4为三氧化二铁-硫化钼复合纳米材料在不同浓度下抑制基因接合转移性能图。图中可以看出，复合纳米材料具有显著的抑制基因接合转移效果。
以上所述仅为本发明之较佳可行实施例而已，非因此局限本发明的专利保护范围。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式，例如可以将复合纳米材料的量，取样涂板时间适当放大。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。本发明未经描述的技术特征可以通过或采用现有技术实现，在此不再赘述。
