基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法
技术领域
本发明涉及乙酰胆碱酯酶检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法。
背景技术
由于有机磷农药的过度使用，它们的残留物可能存在于大气、土壤、地下水甚至农业产品中，这些残留物即使浓度很低也对人体健康和生态环境有害，这给人们正常生活带来了极大的危险。有机磷农药主要通过抑制乙酰胆碱酯酶活性引起神经递质乙酰胆碱的积累，从而诱发严重的临床并发症，严重时会导致呼吸道纤维性化并最终死亡。尽管目前检测到大多数有机磷农药的浓度均没有超过标准，但其生物体内的累积效应和持续接触会提高对人类健康安全的风险，因此，有机磷农药残留分析是保证食品质量安全、保护生态环境和保护人类健康免受危害的重要手段。传统的有机磷农药残留检测方法通常采用高效液相色谱法、气相色谱法和质谱法等常规色谱技术进行。但这些方法有前处理过程繁琐、分析时间长、仪器及药品成本高等不足。因此，建立简单、快速且灵敏度高的有机磷农药检测方法逐渐成为研究重点。
单发射荧光模式的检测平台方法是一种简单、快速的有机磷农药检测方法，然而这些单发射荧光探针在进行检测时容易受到实验条件和共存物质干扰，降低了检测的灵敏度和准确性。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明的另一个目的是提供一种过程简单方便，灵敏度高，检测限低，可实现比率型检测的碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法。
本发明提供的方案具体如下：
一种基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法，包括：
步骤一、制备n份不同浓度的有机磷农药标准溶液，其中，n≥2；
步骤二、将每份不同浓度的有机磷农药标准溶液分别与乙酰胆碱酯酶混合反应，再与硫代乙酰胆碱混合反应，最后添加铜离子、碳点、碲化镉量子点和Tris-HCl缓冲液后继续混合反应得到n份待检测标准溶液；
步骤三、在365nm激发波长下测定每份待检测标准溶液的荧光光谱，记录碳点在490nm处的荧光强度I490和碲化镉量子点在645nm处的荧光强度I645，建立比率荧光信号I490/I645与有机磷农药浓度之间的线性关系式。
上述技术方案中，碲化镉量子点表面的巯基丙酸与铜离子的亲和常数高，能通过形成络合物降低碲化镉量子点的稳定性，结合到碲化镉量子点表面的铜离子可通过电子转移猝灭碲化镉量子点的荧光。当存在乙酰胆碱酯酶时，硫代乙酰胆碱被水解并生成硫代胆碱，巯基化合物能通过对铜离子的络合作用降低碲化镉量子点的荧光猝灭，此时，碳点的荧光强度仍不会发生改变，当有机磷农药存在时，乙酰胆碱酯酶活性被抑制，从而抑制上述整个过程的发生，达到检测有机磷农药的目的。
上述技术方案中，选用具有优异的荧光性能的碳点和碲化镉量子点作为荧光探针，在整个体系的设计中，对有机磷农药浓度变化敏感的碲化镉量子点作为比率型荧光探针中的工作信号，而碳点具有良好的光稳定性和化学惰性且对有机磷农药浓度变化不敏感，因此碳点被选作比率型荧光探针中的参比信号。
上述技术方案中，采用比率型荧光检测方法，相对于单信号的荧光检测方法，比率型荧光方法的两个荧光峰的存在提供了对外部干扰的内在校正，以削弱甚至消除探针的浓度、基质的光散射、激发光源波动和样品所处的微环境因素的干扰，增加本方法检测的灵敏度和准确性。
上述技术方案检测过程简单方便，灵敏度高，实现了有机磷农药的灵敏和比率型检测，并降低了有机磷农药的检测限。
优选的是，所述的基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法中，所述碳点的制备过程包括：
步骤Ⅰ、将间苯二胺溶于无水乙醇中搅拌并超声匀化，然后在180℃恒温反应12小时，冷却至20～25℃室温后得到棕色粗产物溶液；
步骤Ⅱ、用二氯甲烷和甲醇混合物作为洗脱剂，用硅胶柱层析分离法纯化棕色粗产物溶液；
步骤Ⅲ、将纯化的棕色粗产物溶液经过旋转蒸发和真空干燥除去溶剂后，得到固体粉末即为所述碳点。
优选的是，所述的基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法中，所述碲化镉量子点的制备过程包括：
步骤Ⅰ、将碲粉和硼氢化钠添加到超纯水中，在氮气保护下冰浴搅拌得到NaHTe溶液；
步骤Ⅱ、将氯化镉水合物和巯基丙酸溶解在水中，并使用氢氧化钠将溶液的pH值调节至10.5，在氮气保护下搅拌均匀后，将制得的NaHTe溶液注入，并继续通氮气20分钟；
步骤Ⅲ、将步骤Ⅱ制得的混合物加热回流，获得发射红色荧光的碲化镉量子点粗产物；将碲化镉量子点粗产物用乙醇沉淀后，离心除去未反应的杂质得到碲化镉量子点溶液；最后，将所得的碲化镉量子点溶液经过旋转蒸发、真空干燥除去溶剂后，最终得到的固体粉末即为碲化镉量子点。
优选的是，所述的基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法中，步骤一中的有机磷农药标准溶液的配制过程具体包括：
步骤a、使用敌敌畏原液和超纯水配制含有机磷农药的原溶液；
步骤b、分别量取不同体积的原溶液，并分别用相同浓度的Tris-HCl缓冲液稀释至相同体积，配制成不同浓度的有机磷农药标准溶液。
优选的是，所述的基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法中，步骤一中，n＝7，7份有机磷农药标准溶液的浓度分别为0ppb、0.1ppb、0.5ppb、1ppb、5ppb、10ppb和50ppb。
优选的是，所述的基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法中，步骤二中，待检测标准溶液分为7份，每份分别加入步骤一配置的有机磷农药标准溶液，每份中加入的乙酰胆碱酯酶、硫代乙酰胆碱和铜离子的体积为100μL，碳点和碲化镉量子点的体积均为50μL，7份待检测标准溶液中乙酰胆碱酯酶浓度为1.5U/L，硫代乙酰胆碱浓度为80μM，铜离子浓度为0.3μM，碳点的最终浓度为0.75μg/mL，碲化镉量子点的最终浓度为2μg/mL。
优选的是，所述的基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法中，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为50mM，用量为550μL，pH为7.5。
优选的是，所述的基于碳点与碲化镉量子点作为荧光探针检测有机磷农药的方法中，步骤三中荧光检测的激发狭缝和发射狭缝均为10nm。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明检测过程简单方便，灵敏度高，实现了有机磷农药的灵敏和比率型检测，并降低了有机磷农药的检测限。
本发明的方法中，碲化镉量子点表面的巯基丙酸与铜离子的亲和常数高，能通过形成络合物降低碲化镉量子点的稳定性，结合到碲化镉量子点表面的铜离子可通过电子转移猝灭碲化镉量子点的荧光。当存在乙酰胆碱酯酶时，硫代乙酰胆碱被水解并生成硫代胆碱，巯基化合物能通过对铜离子的络合作用降低碲化镉量子点的荧光猝灭，此时，碳点的荧光强度仍不会发生改变，当有机磷农药存在时，乙酰胆碱酯酶活性被抑制，从而抑制上述整个过程的发生，达到检测有机磷农药的目的。
本发明选用具有优异的荧光性能的碳点和碲化镉量子点作为荧光探针，在整个体系的设计中，对有机磷农药浓度变化敏感的碲化镉量子点作为比率型荧光探针中的工作信号，而碳点具有良好的光稳定性和化学惰性且对有机磷农药浓度变化不敏感，因此碳点被选作比率型荧光探针中的参比信号。
本发明采用比率型荧光检测方法，相对于单信号的荧光检测方法，比率型荧光方法的两个荧光峰的存在提供了对外部干扰的内在校正，以削弱甚至消除探针的浓度、基质的光散射、激发光源波动和样品所处的微环境因素的干扰，增加本方法检测的灵敏度和准确性。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明实施例3中利用碳点和碲化镉量子点作为荧光探针检在不同浓度的待检测标准溶液下，在激发波长为365nm时得到的荧光光谱图；
图2为本发明实施例3中建立荧光强度I645/I490与(其中I490为碳点的荧光，为I645为碲化镉量子点的荧光)有机磷农药浓度的对数之间的线性关系式。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
制备碳点：将0.5g的间苯二胺溶于50mL无水乙醇中搅拌并超声匀化5分钟。然后转移到25mL的高压反应釜中，在180℃条件下恒温反应12小时，冷却至室温后得到棕色粗产物溶液。用二氯甲烷和甲醇混合物作为洗脱剂，用硅胶柱层析分离法纯化棕色粗产物溶液。纯化的棕色粗产物溶液经过旋转蒸发后真空干燥除去溶剂后，最终得到固体粉末为碳点。最后将得到的碳点配制成浓度为15μg/mL的碳点溶液备用。
实施例2
制备碲化镉量子点：将0.0638g的碲粉和0.1g的硼氢化钠添加到1ml超纯水中，在氮气保护下冰浴搅拌6小时得到NaHTe溶液。将0.0457g的氯化镉水合物和42μL的巯基丙酸溶解在50mL水中，并使用1.0M的氢氧化钠将溶液的pH值调节至10.5，在氮气保护下经过30分钟在剧烈搅拌后，将200μL新鲜制备的NaHTe溶液迅速下注入并继续通氮气20分钟。将所得的混合物加热到100℃后将回流6小时，以获得发射红色荧光的碲化镉量子点粗产物。所得碲化镉量子点粗产物用三倍体积的乙醇沉淀后，通过以5000转/分钟离心5分钟除去未反应的杂质得到碲化镉量子点溶液，该纯化过程重复三次。最后，将得到的碲化镉量子点溶液经过旋转蒸发后真空干燥除去溶剂，最终得到固体粉末为碲化镉量子点。最后将得到的碲化镉量子点配制成浓度为40μg/mL的碲化镉量子点溶液。
实施例3
步骤一、使用敌敌畏原液和超纯水配制含有机磷农药的原溶液；分别量取不同体积的原溶液，并分别用相同浓度的Tris-HCl缓冲液稀释至相同体积，配制成7份不同浓度的有机磷农药标准溶液；7份有机磷农药标准溶液的浓度分别为0ppb、0.1ppb、0.5ppb、1ppb、5ppb、10ppb和50ppb。
步骤二、将待检测标准溶液分为7份，将每份不同浓度的有机磷农药标准溶液100μL与100μL的乙酰胆碱酯酶(15U/L)混合并在25℃下反应20分钟，然后与硫代乙酰胆碱(0.8mM)混合并在37℃反应20分钟，最后每份中添加100μL铜离子(3μM)、50μL的实施例1制得的碳点(15μg/mL)、50μL实施2制得碲化镉量子点(40μg/mL)和550μL的浓度为50mM的Tris-HCl缓冲液后继续在室温下反应5分钟，制得7份待检测标准溶液。
步骤三、将步骤二中的7份待检测标准溶液在365nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。如图1所示，可得知碲化镉量子点在645nm处的荧光强度随有机磷农药的浓度增加而增加，而碳点在490nm处的荧光强度稳定不变，图1中有机磷农药的浓度由小至大依次对应a-f线。
步骤四、记录碳点在490nm(I490)处的荧光强度和碲化镉量子点在645nm(I645)处的荧光强度。如图2所示，建立比率荧光信号I645/I490与有机磷农药浓度之间的线性关系式，以有机磷农药浓度的对数为横坐标，比率荧光信号I645/I490为纵坐标，可得关系式I645/I490＝-0.25×log[C敌敌畏/ppb]+0.83，其中R2＝0.995，检出限可达0.078ppb。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。
