一种规则六面体碳酸钙材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种规则六面体碳酸钙材料及其制备方法和应用，具体地，涉及该规则六面体碳酸钙材料在促进骨髓间充质干细胞成骨分化中的应用。
背景技术
干细胞是尚未成熟、具备一定分化能力的细胞，其不仅能够实现快速的自我更新与增殖，同时在一定的外界刺激下会发生不对称分裂而分化成前体细胞或者体细胞。
骨髓来源的骨髓间充质干细胞(MSC)具备多项分化潜能，且来源广泛、容易获取、具有较低的异体排斥性，近年来受到研究者的广泛关注。研究表明，MSC具备跨胚层分化能力，可分化为骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪、神经等一系列组织，即便在连续传代培养和冷冻保存后依然具备良好的分化能力。因此，MSC在细胞治疗和组织修复等领域具有良好的应用前景。MSC在骨组织修复和骨组织工程中常被用做种子细胞，在临床上可用于骨组织修复和细胞治疗。基于这些特性，MSC在组织修复和再生中发挥着重要作用，在组织工程和再生医学中有着巨大的应用潜力。
碳酸钙材料在生物医学领域是一种较常见的无机非金属材料，关于碳酸钙材料的研究多集中于其进入细胞的方式、细胞中的分布、细胞毒性、基因毒性和药物缓释等方面。虽然碳酸钙材料在上述方面有诸多研究，但在其对干细胞分化功能的影响方面研究尚未发现。
发明内容
本发明的目的是提供一种生物相容性好、诱导和促进骨髓间充质干细胞成骨分化的规则六面体碳酸钙材料及其制备方法和应用。碳酸钙材料作为一种生物医学材料，研究其在骨髓间充质干细胞分化过程中影响可以为组织工程等生物医用领域的应用提供数据支持和参考。
为达到上述目的，本发明的解决方案是：
一种规则六面体碳酸钙材料的制备方法，其包括以下步骤：
(1)将Na2HPO4和CTAB溶于水中，边搅拌边滴入CaCl2，滴加过程中用0.1M氨水调节溶液pH范围在9.5±0.5；
(2)室温搅拌后过滤，在过滤液中加入等量体积无水乙醇；
(3)离心后水洗，干燥后得到白色粉末样品，即规则六面体碳酸钙材料。
其中，上述的规则六面体碳酸钙材料的长边约为3.5±0.2μm，短边约2.5±0.2μm。
上述的规则六面体碳酸钙材料能够用于培养骨髓间充质干细胞。具体地，规则六面体碳酸钙材料作为骨髓间充质干细胞的培养液或成骨诱导液的添加剂，以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。培养液由α-MEM、胎牛血清、青链霉素混合液以(100±10)：(10±1)：(1±0.1)的比例混合而成。成骨诱导液在培养液中加入地塞米松100nmol、抗坏血酸50μmol和β-甘油磷酸钠10mmol制成。
优选地，所述的规则六面体碳酸钙材料的制备方法包括以下步骤：
(1)、将1.25±0.25mM Na2HPO4、0.45±0.10mM CTAB溶于240mL蒸馏水中，得到第一混合溶液；Na2HPO4在第一混合溶液中的浓度为5.21±1mmol/L，CTAB(中文名称为十六烷基三甲基溴化铵；英文名称为Hexadecyl trimethyl ammonium Bromide)在第一混合溶液中的浓度为1.88±0.4mmol/L；
(2)、边搅拌该第一混合溶液边缓慢将60mL CaCl2溶液逐滴滴入(CaCl2溶液中的CaCl2浓度为4.99±0.1mM)，滴加完毕后得到第二混合溶液；滴加过程中利用0.1M氨水调节该第二混合溶液的pH范围在9.5±0.5；
(3)、室温搅拌第二混合溶液24-48h后，用0.22μm滤膜过滤，过滤掉杂质后得到过滤液；在过滤液中加入等量体积无水乙醇(无水乙醇体积与过滤液体积相同)，得到第三混合溶液；使用离心机使第三混合溶液在14000rpm条件下离心10min，蒸馏水多次清洗，干燥后得到白色粉末样品(微米级规则六面体碳酸钙材料)。
其中，微米级规则六面体碳酸钙材料中碳酸钙晶体的边长长度中长边约3.5±0.2μm，短边约2.5±0.2μm。碳酸钙晶体为六面体，长边与短边边长不等。规则的含义是指微米粒子的大小规则。
该微米级规则六面体碳酸钙材料能够用于培养大鼠骨髓间充质干细胞，也即，该微米级规则六面体碳酸钙材料作为大鼠骨髓间充质干细胞的培养液或成骨诱导液的添加剂。
该微米级规则六面体碳酸钙材料对于促进骨髓间充质干细胞成骨分化的培养方法如下：大鼠骨髓间充质干细胞贴壁后，在培养液中或成骨诱导液中加入灭菌的规则六面体碳酸钙材料，然后与骨髓间充质干细胞共培养7-14天，培养环境为培养液微环境或成骨诱导液微环境。上述规则六面体碳酸钙材料在培养液中或成骨诱导液中的分布浓度可以为1-200μg/ml，也可以为50-150μg/ml，还可以为100μg/ml。
其中，上述微米级规则六面体碳酸钙的边长长度中长边约3.5±0.2μm，短边约2.5±0.2μm
其中，大鼠骨髓间充质干细胞贴壁后生长至70-80％后再与上述规则六面体碳酸钙材料共培养，开始诱导其成为成骨细胞。在培养液条件下或成骨诱导液条件下，利用规则六面体碳酸钙材料促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。
其中，上述材料的灭菌方式为紫外灭菌。
其中，上述促进骨髓间充质干细胞定向分化成成骨细胞的方法中，培养液成分为α-MEM、胎牛血清、青链霉素混合液，其体积比例为(100±10)：(10±1)：(1±0.1)。α-MEM购自Gibco公司，产品名称为MEMα,Nucleosides,GlutaMAXTM；胎牛血清购自ScienCell公司，产品名称为Fetal Bovine Serum；青链霉素混合液购自ScienCell公司，产品名称为Penicillin/Streptomycin Solution(其中青霉素钠盐浓度为1x 107units/L；链霉素浓度为10g/L；NaCl浓度为8.5g/L)。
上述成骨诱导液成分为在培养液中另外加入塞米松100±10nmol、抗坏血酸50±5μmol和β-甘油磷酸钠10±1mmol制成。
一种促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的制剂，其中含有上述的微米级规则六面体碳酸钙。该微米级规则六面体碳酸钙在制剂中的浓度为1-200μg/ml。
由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种规则六面体碳酸钙材料在骨髓间充质干细胞中的应用。不同浓度的规则六面体碳酸钙材料对骨髓间充质干细胞的存活率无明显影响。在培养液和成骨诱导液中，加入一定浓度的规则六面体碳酸钙材料可促进大鼠骨髓间充质干细胞的矿化，增强碱性磷酸酶(ALP)的活性，上调成骨相关基因OCN、OPN和RUNX2的表达。本发明为组织工程等生物医用领域的应用提供数据支持和参考。
总之，规则六面体碳酸钙材料具有良好的细胞相容性，并促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，明显提高骨髓间充质干细胞的成骨能力。
附图说明
图1是本发明的规则六面体碳酸钙扫描电镜图；
图2是本发明的规则六面体碳酸钙材料的X射线粉末衍射谱图以及对应的PDF标准卡片；
图3是本发明的规则六面体碳酸钙材料的傅里叶红外光谱图；
图4是加入不同浓度规则六面体碳酸钙后，在24h和72h时，通过MTT法检测的骨髓间充质干细胞存活率测试图；
图5是在培养液条件下，加入不同浓度规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、14天后的茜素红染色照片图；
图6是在成骨诱导液条件下，加入不同浓度规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、14天后，茜素红染色照片图；
图7是在培养液条件下，加入不同浓度规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养14天后，茜素红染色定量照片；
图8是在成骨诱导液条件下，加入不同浓度规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养14天后，茜素红染色定量照片；
图9是在培养液条件下，加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天后，碱性磷酸酶活性数据图；
图10是在成骨诱导液条件下，加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天后，碱性磷酸酶活性数据图；
图11是在成骨诱导液条件下，加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、10天后，成骨相关基因OCN表达数据图；
图12是在成骨诱导液条件下，加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、10天后，成骨相关基因OPN表达数据图；
图13是在成骨诱导液条件下，加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、10天后，成骨相关基因RUNX2表达数据图。
具体实施方式
本发明提供了一种规则六面体碳酸钙材料及其制备方法和应用。微米级规则六面体碳酸钙材料在室温条件下通过化学沉淀法制备。将该材料以一定浓度与骨髓间充质干细胞在正常培养液或成骨诱导液中共培养后，检测骨髓间充质干细胞的存活率；采用茜素红染色矿化实验、碱性磷酸酶活性测试评估规则六面体碳酸钙材料对骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响；利用实时荧光定量PCR检测三种成骨相关基因OCN、OPN、RUNX2的表达情况。结果表明，规则六面体碳酸钙材料具有良好的细胞相容性，并促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，明显提高骨髓间充质干细胞的成骨能力，此研究结果为骨组织工程提供数据支持，具有较大应用前景。
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步的详细描述。
实施例1：制备规则六面体碳酸钙材料
(1)将Na2HPO4(1.25mM)、CTAB(0.45mM)溶于240mL蒸馏水中，搅拌下缓慢将60mLCaCl2(5mM)滴入，滴加过程中利用0.1M氨水调节溶液pH范围在9.5±0.5；
(2)室温搅拌24h后，用0.22μm滤膜过滤，滤后在过滤液中加入等量体积无水乙醇；
(3)离心机在14000rpm条件下离心10min，蒸馏水3遍洗，得白色粉末样品。
对制备出的规则六面体碳酸钙材料做扫描电镜表征，如图1所示，图中六面体碳酸钙材料的长边约3.5μm，短边约2.5μm，结构呈六面体形，尺寸均一，具有光滑的表面。图1的左图(图1A)的放大倍数为3×103倍，右图(图1B)的放大倍数为8×103倍。
图2是规则六面体碳酸钙材料的X射线粉末衍射谱图。纵坐标为强度，横坐标为角度。该图说明了规则六面体碳酸钙的谱图对应XRD的PDF标准卡片编号是NO:05-0586，可知其晶体结构是方解石，在谱图20°至50°范围相对应的晶面分别为(012)、(104)、(006)、(110)、(113)、(202)、(024)、(018)、(116)，在XRD谱图中未见其他的杂质峰，表明是纯净的方解石物相，同时各衍射峰尖锐，表明结晶度较高。
图3是规则六面体碳酸钙材料的傅里叶红外光谱图。谱图中，在714cm-1和876cm-1处出现了方解石的吸收峰，进一步证明规则六面体碳酸钙材料的物相为方解石。
检测例1：规则六面体碳酸钙的生物相容性
将大鼠骨髓间充质干细胞按5000cell/孔加入96孔板中，置于细胞培养箱中培养24小时后加入0、1、5、10、25、50、100、200μg/ml的规则六面体碳酸钙；将96孔板在细胞培养箱中孵育24和72小时后，加入MTT，再孵育4小时；吸出上清液，每孔加入150μL DMSO，在摇床上摇匀；酶标仪在550nm处检测吸光度值。规则六面体碳酸钙材料由MTT法测出的细胞存活率如图4所示。图4中，纵坐标表示细胞存活率，横坐标表示规则六面体碳酸钙材料的浓度。每条柱状体的左边条状(黑色)表示对应浓度下培养24小时时细胞的存活率，每条柱状体的右边条状(灰色)表示对应浓度下培养72小时时细胞的存活率。从图中可以看出，规则六面体碳酸钙的生物相容性良好，在很高浓度下也不会造成细胞存活率较大的降低。
检测例2：规则六面体碳酸钙诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的钙形成检测
将大鼠骨髓间充质干细胞按30000每孔铺于24孔板中，待细胞贴壁后生长至70-80％后加入10、25、50μg/ml的规则六面体碳酸钙共培养7天(图5中D7-培养液所示)或14天(图5中D14-培养液所示)。培养条件为培养液(α-MEM、胎牛血清、青链霉素混合液，三者比例为100：10：1)或成骨诱导液(培养液中加入地塞米松100nmol、抗坏血酸50μmol和β-甘油磷酸钠10mmol)。PBS洗3次，用4％多聚甲醛固定15分钟；吸去4％多聚甲醛，水洗3次，加入1％茜素红染色液，染色1小时；吸去染色液，蒸馏水洗3次，在倒置显微镜下拍照。染色结果如图5、图6所示。
图5表示在加入不同浓度0μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL的规则六面体碳酸钙后，分别在7天(D7)、14天(D14)用培养液对MSC进行钙结节茜素红染色的照片。结果显示，在7天或14天时，在培养液体系中，无规则六面体碳酸钙组未出现钙结节；规则六面体碳酸钙浓度为10μg/mL组出现零星钙结节；浓度为25μg/mL组出现少量钙结节；50μg/mL组出现部分钙结节。因为成骨分化产生的钙结节通常在成骨诱导液培养14天时产生，所以结果说明，在培养液体系中，不加入任何成骨分化药物，规则六面体碳酸钙也能使MSCs产生钙结节，表明其具有促使MSCs成骨分化的能力，且随着浓度的增加，产生的钙结节增加；同时，在培养7天时，便有钙结节产生，说明规则六面体碳酸钙可以加快MSCs的成骨分化能力。
图6表示在加入不同浓度0μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL的规则六面体碳酸钙后，分别在7天、14天用成骨诱导液对MSC进行钙结节茜素红染色的照片。结果显示，在7天时，在成骨诱导液体系中，无规则六面体碳酸钙组未出现钙结节；规则六面体碳酸钙浓度为10μg/mL组出现零星钙结节；浓度为25μg/mL组出现少量钙结节；50μg/mL组出现部分钙结节。在14天时，无规则六面体碳酸钙组未出现零星钙结节，规则六面体碳酸钙浓度为10μg/mL组出现少量钙结节；浓度为25μg/mL组出现部分钙结节；50μg/mL组出现大量钙结节。结果说明，在诱导7天时，便有钙结节产生，说明规则六面体碳酸钙可以加快MSCs的成骨分化能力；在14天时，与无规则六面体碳酸钙组对比，加入规则六面体碳酸钙后产生钙结节量明显增多，说明规则六面体碳酸钙可以促进MSCs的成骨分化。
图5和图6的结果对比说明不加入成骨分化药物时，在培养液中，规则六面体碳酸钙可以促使MSCs成骨分化；在培养液或成骨诱导液中，加入规则六面体碳酸钙都能够促进MSCs的成骨分化，但在成骨诱导液中产生的钙结节更多。
染色后，加入10％氯代十六烷基吡啶进行茜素红染色定量检测，在570nm处测定吸光度值。茜素红染色定量结果如图7、图8所示。
图7的纵坐标为吸光度OD值，横坐标为浓度。结果表明，在培养液中，规则六面体碳酸钙会促使MSCs产生的钙结节，对MSCs的成骨分化产生促进作用，并且表现出浓度依赖现象。
图8的纵坐标为吸光度OD值，横坐标为浓度。结果表明，在成骨诱导液中，规则六面体碳酸钙会促进MSCs产生的钙结节，促进MSCs向成骨细胞分化，规则六面体碳酸钙加入的量越多，产生的钙结节越多。
对比图7和图8的吸光度OD值说明，在成骨诱导液中，规则六面体碳酸钙促进MSCs产生的钙结节量比在培养液中产生的钙结节量多。
检测例3：规则六面体碳酸钙对骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶活性影响的检测
碱性磷酸酶活性(ALP)的升高是MSCs成骨分化的早期特征之一，计算碱性磷酸酶表达量与总蛋白含量之比探究规则六面体碳酸钙对间充质干细胞成骨分化的影响。利用对硝基苯基磷酸钠法测定碱性磷酸酶活性、BCA法测定样品总蛋白浓度。MSCs消化后计数，按每孔30000个接种于12孔板中，待细胞长至80％满后，加入含有50μg/mL规则六面体碳酸钙材料的培养液或成骨分化诱导液1mL，连续培养7天，每3天换一次液。7天后利用碧云天碱性磷酸酶检测试剂盒和碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。测定结果如图9、图10所示。
图9是加入50μg/mL浓度的规则六面体碳酸钙用培养液培养7天后的ALP活性，对比组是培养液中不加入样品培养的细胞。相对空白组，加入规则六面体碳酸钙后，每克蛋白中ALP活性从34.9上升至40.5U，表明在不加入成骨诱导药物时，也可以加强MSCs的成骨分化能力。
图10是加入50μg/mL浓度的规则六面体碳酸钙用成骨诱导液培养7天后的ALP活性，对比组是培养液中不加入样品培养的细胞。相对空白组，加入规则六面体碳酸钙后，每克蛋白中ALP活性从37.5上升至77.3U，表明MSCs的成骨分化能力增强。
对比图9、10说明规则六面体碳酸钙加强了MSCs的碱性磷酸酶活性的表达，对成骨分化起到了促进作用，且在不加入成骨诱导药物时，规则六面体碳酸钙也可以在一定程度上加强MSCs的成骨分化。
检测例4：规则六面体碳酸钙诱导骨髓间充质干细胞成骨分化的成骨特异性基因表达
在成骨诱导液诱导分化7天、10天后，PBS洗三次，采用MiniBEST Universal RNAExtraction Kit(TaKaRa)，提取总RNA；采用PrimeScriptTMRT Master Mix(TaKaRa)进行定量RT-PCR扩增。根据各目的基因的Ct值以及内参GAPDH基因的Ct值进行定量分析，确定目的基因OCN、OPN、RUNX2的表达水平。所扩增基因的引物序列如下表所示：
图11是在成骨诱导液条件下，加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、10天后，成骨相关基因OCN表达数据图。图11中每栏的左边柱状为空白对照，右边柱状为规则六面体碳酸钙。结果显示，OCN的表达在第7天相比空白组上调4.6倍，第10天相比空白组上调2.6倍，说明加入规则六面体碳酸钙加强了成骨相关基因OCN的表达。
图12是在成骨诱导液条件下，加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、10天后，成骨相关基因OPN表达数据图；图12中每栏的左边柱状为空白对照，右边柱状为规则六面体碳酸钙。结果显示，OPN的表达在第7天相比对照组上调6.4倍，第10天相比对照组下调0.15倍。说明加入规则六面体碳酸钙在第7天时，成骨相关基因OPN的表达倍数增加，在第10天时，表达量稍有减少。
图13是在成骨诱导液条件下，加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、10天后，成骨相关基因RUNX2表达数据图。图13中每栏的左边柱状为空白对照，右边柱状为规则六面体碳酸钙。结果显示，RUNX2的表达在第7天相比对照组下调0.41倍，第10天较比对照组上调3.8倍。说明加入规则六面体碳酸钙在第7天时，RUNX2的表达略减少，在第10天时，表达量倍数增加。结合图11、12、13可知，在加入50μg/ml规则六面体碳酸钙与大鼠骨髓间充质干细胞共培养7天、10天后，成骨相关基因OCN、OPN、RUNX2总体上呈现表达增强的现象，进一步证明规则六面体碳酸钙能够促进间充质干细胞的成骨分化。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
