具有抗菌效能的碳点、其制备方法、组合物及其应用
技术领域
本发明涉及纳米材料领域，特别涉及一种具有抗菌效能的碳点、其制备方法、组合物及其应用。
背景技术
病原微生物的多样性及其快速突变的特点为人类的抗菌治疗带来了巨大的挑战。随着抗生素的广泛使用，很多具有抗药性的病原微生物被筛选了出来。经过不断进化，有些细菌甚至对不止一种的药物产生耐药性，尤其是超级细菌的出现，引其极大的社会恐慌，尽管科学家们仍在开发新的抗生素，但其发展速度远远赶不上病原微生物的突变速度，因此，人类迫切需要开发出不易产生耐药性的新型抗菌药物或抗菌方法。
光热技术是基于光化学反应而发展起来的一项新技术。该技术通过外部光源(通常是近红外光)的照射，将光能转化成热能，杀死细胞。光热疗法的核心是光热材料的选择和研发。光热材料主要包括贵金属材料、有机分子材料、半导体材料和碳纳米材料等，它们都可以将吸收的光能转化成热能从而使自身温度升高。碳点因为其优异的物理和化学性质，例如良好的水溶性、优异的生物相容性、极低的细胞毒性和易于表面功能化等，被认为是一种综合性能出色的光热材料。此外，碳点的光致发光特性使其在发挥作用的同时进行高分辨荧光成像，从而实现实时监控治疗过程。肽聚糖是细菌细胞壁的重要组成部分，可以为其生长提供坚固的保护结构，使其免受外部环境和内部高渗透压的影响。肽聚糖的合成是由一系列酰胺连接酶(MurC、MurD、MurE和MurF等)催化完成的，其中MurD对D-Glu具有很强的亲和能力，而且人等哺乳动物不能代谢D-Glu。
基于碳点和D-Glu表现出来的特性，有望研发出新型的抗菌产品，但现在未见公开相关方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种具有抗菌效能的碳点、其制备方法、组合物及其应用。本发明提供了一种具有细菌特异性结合特性和光热协同作用的碳点，该碳点表现出非常高效的光热能力，在短时间内就能升温到50℃以上，足以破坏细菌的生理功能；且该碳点本身就可以有效地抑制细菌的生长，再辅以激光照射之后，结合其高效的光热能力，可以高效地杀死细菌，并避免抗药性的产生；另外，该碳点DG-CDs具有很好的光学特性，即使在紫外下仍能产生明亮的红色荧光，故可作为荧光探针进行应用，用来标记细菌，从而在体内或体外对细菌进行成像。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：提供一种具有抗菌效能的碳点，其通过D-Glu和邻苯二胺合成得到，该碳点具有抗菌效能和光热效应。
优选的是，该碳点还具有光致发光特性。
优选的是，该碳点的制备方法包括以下步骤：
1)称取D-Glu和邻苯二胺并溶于HCl水溶液中，待混合物变澄清透明后，将其转移至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中加热；
2)反应完成后，将产物自然冷却至室温，再将产物离心，以除去反应中产生的副产物；
3)将产物置于透析袋中在去离子水中透析；
4)透析完成后，将透析袋中剩余的液体冷冻，然后进行冷冻干燥得到产物，即为该碳点。
优选的是，该碳点的制备方法包括以下步骤：
1)称取25mg D-Glu和50mg邻苯二胺并溶于25mL浓度为1mol L-1的HCl水溶液中，待混合物变澄清透明后，将其转移至80mL的聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中加热至200℃，持续加热3h；
2)反应完成后，将产物自然冷却至室温，再将产物以3000rpm的速度离心10min，以除去反应中产生的副产物；
3)将产物置于1000Da的透析袋中在去离子水中透析24h，每隔3h换一次水；
4)透析完成后，将透析袋中剩余的液体放在-80℃冰箱中冷冻3h，然后进行冷冻干燥得到黑色粉末，即为该碳点。
本发明还提供一种组合物，其包括如上所述的具有抗菌效能的碳点以及药学上可接受的辅料。
本发明还提供如上所述的具有抗菌效能的碳点或组合物作为抗菌剂的应用。
本发明还提供如上所述的具有抗菌效能的碳点或组合物作为荧光探针来标记细菌以实现体内或体外对细菌进行成像的应用。
本发明还提供如上所述的具有抗菌效能的碳点或组合物作为光热材料以用于光热治疗中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的具有抗菌效能的碳点，其表面含有D-Glu的主要官能团，从而对MurD酶有很强的亲和能力，可以与MurD酶的底物发生竞争性抑制作用，干扰肽聚糖的合成，进而影响细菌细胞壁的形成，最终达到抑制细菌生长的目的；并且，该碳点还具有优秀的光热效应，升温效果明显，可以在短时间内快速升温，严重破坏细菌的细胞壁结构，进而杀死细菌；该碳点表面的D-Glu的抑菌性能与该碳点的光热效应产生协同增强效果，通过将双重抑菌方式结合于一体，获得了高效的抑菌性能；此外，碳点DG-CDs对细菌具有超强的亲和能力保证了近红外激光照射后光热效应的空间精度，即确保了光照升温直接作用于细菌本身，进一步增强了DG-CDs的杀菌效率。
本发明的碳点具有很好的光学特性，即使在紫外下仍能产生明亮的红色荧光，故可作为荧光探针进行应用，用来标记细菌，从而在体内或体外对细菌进行成像。
附图说明
图1为本发明的实施例1中的碳点DG-CDs的合成及效果模式图；
图2为本发明的实施例1中的碳点DG-CDs的TEM图像和DLS光谱；
图3为本发明的实施例1中的碳点DG-CDs的光学特性实验结果；
图4为本发明的实施例1中的碳点DG-CDs的光热特性实验结果；
图5为本发明的实施例1中的碳点DG-CDs的体外抗菌实验结果；
图6为本发明的实施例1中的碳点DG-CDs的毒性实验结果；
图7为本发明的实施例1中的大肠杆菌的共聚焦成像图；
图8为本发明的实施例1中的大肠杆菌的扫描电镜成像图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本实施例的一种具有抗菌效能的碳点，其通过D-Glu和邻苯二胺合成得到，该碳点具有抗菌效能、光热效应以及光致发光特性。
肽聚糖是细菌细胞壁的重要组成部分，可以为其生长提供坚固的保护结构，使其免受外部环境和内部高渗透压的影响。肽聚糖的合成是由一系列酰胺连接酶(MurC、MurD、MurE和MurF等)催化完成的，其中MurD对D-Glu(D-谷氨酸)具有很强的亲和能力，而且人等哺乳动物不能代谢D-Glu。本发明中，从D-Glu着手，设计针对MurD酶为靶标的碳点，可将其作为抗菌剂或荧光探针或是光热材料应用于人和动物身上，可以有效地避免对机体细胞的伤害，降低副作用。
本发明中，以D-Glu和邻苯二胺为前体合成了一种具有抗菌效能的氮元素掺杂的碳点(DG-CDs)。1、该碳点DG-CDs具有很好的光学特性，即使在紫外下仍能产生明亮的红色荧光，故可作为荧光探针进行应用，用来标记细菌，从而在体内或体外对细菌进行成像。2、该碳点DG-CDs还表现出非常高效的光热能力，在短时间内就能升温到50℃以上，足以破坏细菌的生理功能。3、根据实际效果，DG-CDs本身就可以有效地抑制细菌的生长，再辅以激光照射之后，结合其高效的光热能力，可以高效地杀死细菌，并避免抗药性的产生。综合表现使得DG-CDs能够成为一种非常出色的抗菌材料、荧光探针、光热材料进行相关应用。
以上为本发明的总体构思，以下提供具体的实施例，以对本发明作进一步说明。
实施例1
一种具有抗菌效能的碳点，其制备方法包括以下步骤：
1)称取25mg D-Glu和50mg邻苯二胺并溶于25mL浓度为1mol L-1的HCl水溶液中，待混合物变澄清透明后，将其转移至80mL的聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中加热至200℃，持续加热3h；
2)反应完成后，将产物自然冷却至室温，再将产物以3000rpm的速度离心10min，以除去反应中产生的副产物；
3)将产物置于1000Da的透析袋中在去离子水中透析24h，每隔3h换一次水；
4)透析完成后，将透析袋中剩余的液体放在-80℃冰箱中冷冻3h，然后进行冷冻干燥得到黑色粉末，即为该碳点DG-CDs。
针对获得的碳点DG-CDs再进行以下实验，以对其特性和机理进行研究。
参照图1，为该碳点DG-CDs的合成及效果模式图，本实施例中，巧妙地利用手性分子合成了一种新型的红光碳点DG-CDs，该红光碳点DG-CDs表面含有D-Glu的主要官能团，从而对MurD酶有很强的亲和能力，可以与MurD酶的底物发生竞争性抑制作用，干扰肽聚糖的合成，进而影响细菌细胞壁的形成，最终达到抑制细菌生长的目的。并且，DG-CDs还具有优秀的光热效应，升温效果明显，可以在短时间内快速升温，严重破坏细菌的细胞壁结构，进而杀死细菌；该红光碳点DG-CDs表面的D-Glu的抑菌性能与该碳点的光热效应产生协同增强效果，通过将双重抑菌方式结合于一体，获得了高效的抑菌性能。此外，碳点DG-CDs对细菌具有超强的亲和能力保证了近红外激光照射后光热效应的空间精度，即确保了光照升温直接作用于细菌本身，进一步增强了DG-CDs的杀菌效率。
参照图2，为碳点DG-CDs的TEM图像(图2A)和DLS光谱(图2B)，从透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)光谱可以看出，该碳点的粒径分布为3-5nm。
参照图3，为碳点DG-CDs的光学特性实验结果，其中，图3A是DG-CDs的紫外吸收光谱，可以看到它在612nm附近处有明显的吸收峰；右上角插图显示了含有DG-CDs水溶液的比色皿，其中左边是DG-CDs溶液在日光灯下的照片，颜色微微泛红；右边是在365nm紫外灯下的照片，肉眼可观察到明显的红色。图3B是DG-CDs的荧光发射光谱，从图中可以看出，DG-CDs在639nm附近处有一个最高的峰，从360nm到600nm，随着激发波长的增加，CDs的荧光发射强度不断增大，且最大发射波长始终在639nm附近处。图3B中的曲线，在639nm的垂直虚线上的波峰的曲线的激发光波长，由下至上依次为：380nm、400nm、420nm、440nm、460nm、480nm、500nm、520nm、540nm、560nm、580nm、600nm。
参照图4，为碳点DG-CDs的光热特性实验结果，图4A是不同浓度的DG-CDs溶液在近红外(NIR)激光(波长808nm，照射强度1.5W/cm2)照射下的温度变化，从图中可以看出，DG-CDs溶液在激光照射下，短时间内迅速升温，并在10min内达到平稳状态。图中，由下至上4条曲线中，DG-CDs溶液的浓度分别为0μg/mL(采用PBS溶液代替DG-CDs溶液)、200μg/mL、500μg/mL和1000μg/mL，其在激光照射下最高温度分别升到了26.7℃、54.3℃、70.1℃和81.1℃，升温幅度随着CDs浓度的增加而增加，呈现明显的浓度依赖特性。图4B是含有浓度为200μg/mL DG-CDs溶液的EP管被激光照射6min后由热成像仪拍摄的图像，图像显示溶液当时温度升高到了50.3℃。
参照图5，为碳点DG-CDs的体外抗菌实验结果，图5A是细菌在LB固体培养基上的生长情况，从左到右分别是只加入PBS的大肠杆菌、只加入DG-CDs(500μg/mL)的大肠杆菌和加入DG-CDs且经过能量密度为0.8W/cm2的808nm激光照射后的大肠杆菌。图5B是菌落数统计结果。统计数据显示，DG-CDs组的菌落数量相较于PBS组降低了约50％，激光照射导致菌落数减少了90％。表明红外激光照射引起的光热效应杀死了绝大多数的大肠杆菌，进而说明我们的DG-CDs具有非常不错的杀菌效果。并且这种杀菌效果是双重因素导致的，一方面通过与MurD酶的特异性亲和能力抑制细菌生长，另一方面通过光热作用杀死细菌。此外，由于DG-CDs与细菌的强亲和能力使其与细菌紧密结合，所以大大提高了光热杀菌的空间精度。
参照图6，为碳点DG-CDs的毒性实验结果；本发明获得的DG-CDs具有出色的光热效果和优秀的杀菌能力，一种非常不错的的抗菌材料。然而开发为具有实际应用功能的抗菌剂，必须要求其对细菌感染的宿主(如人或动物)没有明显的毒性伤害。从理论上讲，因为D-谷氨酸(D-Glu)的加入，本发明的DG-CDs对含有靶点酶的细菌具有强亲和力，但因为哺乳动物不能利用D-谷氨酸，从而在源头上避免了DG-CDs对动物细胞产生重大负面作用的可能。对于动物细胞在含有DG-CDs的环境中生长会不会受到影响，本实施例中通过MTT实验进行了详细的测试。测试结果(图6)表明，DG-CDs对细胞的安全性非常高，即使在400μg/mL的浓度下细胞仍有90％左右的存活率，表明DG-CDs毒性很低，具有良好的生物应用潜力。
参照图7-8，为碳点DG-CDs的抗菌机理研究以及光致发光特性实验结果，图7为大肠杆菌的共聚焦成像图像，可以看到，DG-CDs对细菌有很强的亲和能力，所有的细菌均被DG-CDs结合并发出明亮的荧光。从这个结果来看，DG-CDs除了可以抗菌之外还可以作为一种荧光探针用来标记细菌，从而在体内或体外对细菌进行成像。
图8为大肠杆菌的扫描电镜成像图，可以看到，未经过DG-CDs处理的细菌状态良好，细胞壁外形完整；而经过DG-CDs处理的细菌由于细胞壁的形成受阻，其细胞壁呈现出些许破裂的表型(图中箭头所示位置)；表型最显著的是经过近红外激光处理的细菌，外壁出现大面积的破损，发生了明显的致死效应，证明DG-CDs的双重抗菌作用可以强烈地破坏细菌的细胞壁，进而杀死细菌。其杀菌机理虽简单，但作用效果显著，并且主要是利用物理作用杀菌，可以极大程度上避免耐药性的产生，从而有望成为抗生素的有效替代物。
通过以上实验结果可以充分体现实施例1获得的碳点DG-CDs表现出了高效的抑菌性能、光热能力以及显著的光致发光特性，该碳点至少具备作为抑菌剂/抑菌组合物、光热材料、荧光探针进行相关应用的潜力。
实施例2
提供一种组合物，其包括如实施例1获得的碳点DG-CDs以及药学上可接受的辅料。
实施例3
实施例1获得的碳点DG-CDs或实施例2获得的组合物作为抗菌剂的应用。
实施例4
实施例1获得的碳点DG-CDs或实施例2获得的组合物作为荧光探针来标记细菌以实现体内或体外对细菌进行成像的应用。
实施例5
实施例1获得的碳点DG-CDs或实施例2获得的组合物作为光热材料以用于光热治疗中的应用，即通过碳点DG-CDs靶向识别与细菌结合，利用红外激光照射引起的光热效应破坏细菌的细胞壁结构，进而杀死细菌。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
