一种降解纤维素、吸附镉的黄蓝状菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及环境治理技术领域，特别涉及一种降解纤维素、吸附镉的黄蓝状菌菌株及其应用。
背景技术
随着工业的迅速发展，土壤重金属污染现象也日趋严重。常见的土壤污染重金属主要有Hg、Cd、Pb、As等，随着此类重金属在生态环境中迁移、转化，并不断积累，达到一定限度值时，就会通过食物链循环危害动植物、人类的生命健康。
中国专利CN 102286383A公开了一种黄色蓝状菌在植物病原菌防治方面的应用，该菌株能够抑制多种病原菌，如花生网斑病菌、番茄早疫病菌、立枯丝核菌、玉米纹枯病菌、苹果腐烂病菌、烟草赤星病菌等；此外，有关黄蓝状菌的研究报道包括该菌种的半纤维素降解特性，以及其解磷特性(1.尹小,谈家金,方爱琴.一株黄蓝状菌(Talaromycesflavus)SH16解磷特性的测定[J].南京林业大学学报(自然科学版),2017(5)；2.顾文杰,徐有权,徐培智,等.酸性土壤中高效半纤维素降解菌的筛选与鉴定[J].微生物学报,2012,52(10).)。目前，暂未见有关具有同时降解纤维素、吸附重金属镉能力的黄蓝状菌的报道。
发明内容
本发明提供了一种降解纤维素、吸附镉的黄蓝状菌菌株及其应用，其目的是为了使黄蓝状菌菌株适用于镉污染稻田的生物修复，降解水稻秸秆的同时，也能达到修复重金属污染土壤的效果。
为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种降解纤维素、吸附镉的黄蓝状菌菌株，所述菌株的分类命名为黄蓝状菌(Talaromycesveerkampii)CAF2，其保藏编号为：ACCC 32732,生物学特性为：菌落质地絮状兼绒状，边缘白色至淡黄色，中部淡绿色，产黄绿色孢子；最适培养pH为6.5；最适培养温度为28℃；固体发酵25～28℃条件下培养3～5天即可产孢；能以葡萄糖、蔗糖、麸皮或秸秆为微生物碳源进行生长；能以蛋白胨、酵母膏或玉米粉为微生物氮源进行生长。
优选地，所述黄蓝状菌菌株的镉离子浓度耐受范围为0～100mg/L。
本发明还提供一种上述黄蓝状菌菌株在水稻秸秆降解中的应用。
优选地，上述应用包括如下步骤：
(1)配制水稻秸秆液体培养基；
(2)将所述黄蓝状菌菌株制备成种子液，按10％的接种量接于水稻秸秆液体培养基中，于28℃、120r/min的转速下振荡培养5～30天。
更优选地，所述水稻秸秆液体培养基由CMC-Na、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、蛋白胨、酵母膏、蒸馏水以及水稻秸秆组成。
更优选地，所述水稻秸秆液体培养基包括如下重量份组分：CMC-Na 10份、KH2PO4 1份、MgSO4·7H2O 0.5份、NaCl 0.5份、蛋白胨2份、酵母膏0.5份、蒸馏水1000份，以及剪切后水稻秸秆10份。
优选地，评价黄蓝状菌菌株对水稻秸秆降解效果包括将经步骤(2)培养后的水稻秸秆溶液进行离心、清洗和烘干处理，计算水稻秸秆失重率。
本发明还提供一种所述黄蓝状菌菌株在镉污染土壤治理中的应用。
上述应用包括如下步骤：
(1)将所述黄蓝状菌菌株经固体发酵、烘干和粉碎后得到孢子粉；
(2)将镉污染土壤烘干、除杂、碾碎、过筛后备用；
(3)将步骤(1)所得孢子粉加入步骤(2)处理后的镉污染土壤中，使土壤中孢子含量为1×106～1×107CFU/g，加水搅拌后在室温下自然培育10～50天。
优选地，经步骤(3)自然培育30天后黄蓝状菌菌株对隔的吸附率超过74％。
本发明的上述方案有如下的有益效果：
本发明提供的黄蓝状菌菌株CAF2，分类命名为黄蓝状菌(Talaromycesveerkampii)WAF6，保藏于中国农业微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为：ACCC 32732。它能够产纤维素酶，并对水稻秸秆有良好的降解效果；将其应用在水稻秸秆的降解中，水稻秸秆在第15天被降解一半；同时，该菌株具有吸附重金属镉的能力，能够降低污染土壤中的重金属镉的生物有效性且在土壤中具有良好的定殖能力，将其应用在镉污染土壤治理中，在第30天后，黄蓝状菌菌株对隔的吸附率超过74％。该菌株适用于镉污染稻田的生物修复，降解水稻秸秆的同时，也能达到修复土壤重金属污染的效果。
附图说明
图1为本发明的菌株培养25天对水稻秸秆的崩解效果；
图2为本发明的不同菌株对水稻秸秆的降解效果；
图3为本发明的菌株CAF2在镉污染土壤中的吸附效果。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。
实施例1：本实施例说明本发明使用到培养基
(1)分离培养基：CMC培养基：羧甲基纤维素钠(CMC-Na)10.0g，KH2PO4 0.25g，土豆汁100mL，琼脂粉18.0g，蒸馏水1000mL。
(2)纯化、保存培养基：PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20.0g，琼脂粉18.0g，蒸馏水1000mL。
(3)含镉离子培养基：马铃薯200g，葡萄糖20.0g，琼脂粉18.0g，蒸馏水1000mL，根据需要添加含镉离子母液(20mg/mL)配制成不同浓度镉离子浓度固体培养基。
(4)筛选培养基：
a.刚果红培养基：CMC-Na 2.0g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.25g，(NH4)2SO41.0g，刚果红0.1g，琼脂粉18.0g，蒸馏水1000mL；
b.复筛培养基：CMC-Na 5.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaNO3 3.0g，KCl0.5g，FeCl3·6H2O 0.01g，蒸馏水1000mL；
(5)水稻秸秆液体培养基(按重量份)：CMC-Na 10份、KH2PO4 1份、MgSO4·7H2O 0.5份、NaCl 0.5份、蛋白胨2份、酵母膏0.5份、蒸馏水1000份，以及剪切后水稻秸秆10份。
实施例2：供试菌株的分离纯化
本发明中供试菌株的分离纯化的具体方法为：采用稀释平板涂布法，将土壤样品通过梯度稀释用无菌水制成10-3-10-5菌悬液，并在分离培养基上涂布，置于26-28℃恒温培养箱中培养2-3天，将分离到的不同真菌菌株在PDA培养基中进行划线纯化及保存，将纯化好的菌种放于4℃冰箱保藏。
所述菌株的分类命名为黄蓝状菌(Talaromycesveerkampii)CAF2，其保藏编号为：ACCC 32732,生物学特性为：菌落质地絮状兼绒状，边缘白色至淡黄色，中部淡绿色，产黄绿色孢子；最适培养pH为6.5；最适培养温度为28℃；固体发酵25～28℃条件下培养3～5天即可产孢；能以葡萄糖、蔗糖、麸皮或秸秆为微生物碳源进行生长；能以蛋白胨、酵母膏或玉米粉为微生物氮源进行生长。
实施例3：菌株CAF2的镉离子耐受能力评价
本发明所述菌株CAF2的镉离子耐受能力评价方法，具体包括以下步骤:
(1)配制含不同镉离子浓度的PDA培养基，浓度设置为0、10、50、80、100、150、200mg/L；
(2)将菌株用5mm打孔器制成菌饼，在无菌条件下接种于步骤(1)所述平板培养基，于26-28℃恒温培养箱中培养3-5天，观察菌株的生长情况。
菌株CAF2在镉离子浓度为0～100mg/L的镉离子浓度的平板上生长情况良好，而在镉离子浓度为150mg/L的平板上生长完全收到抑制，故该菌株的镉离子浓度耐受范围为0-100mg/L。
实施例4：菌株CAF2的降解纤维素能力评价
具体包括以下步骤：
(1)菌株的初筛：将分离纯化得到的真菌菌株孢子悬浮液涂布于PDA上，于28℃恒温培养箱中培养2-3天，待培养基表面菌落生长均匀，用5mm打孔器制成菌饼并接种于刚果红培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养3-5天，观察菌饼周围是否有透明水解圈，并测量菌落直径(d)及水解圈直径(D)；
(2)羧甲基纤维素酶活(CMCase)的测定：
1)标准曲线绘制：无水葡萄糖于80℃条件下烘干至恒重，并制备成浓度为1.0mg/mL的葡萄糖标准液，6支干净试管中分别加入葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，补蒸馏水至2.0mL，加入1.5mLDNS试剂后沸水浴5min，冷却后定容至25mL，波长540nm下测定OD值，采用Excel绘制标准曲线。
2)粗酶液制备与酶活测定：利用初筛得到的真菌菌株制备种子液，按10％的接种量接于复筛培养基中，装液量为90mL/250mL三角瓶，28℃恒温振荡培养，分别在3、5、7、9、11天取发酵液1.5mL于离心管中，10000r/min离心10min得到粗酶液，测定菌株在不同发酵时间下的羧甲基纤维素酶(CMCase)活力。酶活力测定方法参照文献“李静,张瀚能,赵翀,等.高效纤维素降解菌分离筛选、复合菌系构建及秸秆降解效果分析.应用与环境生物学报,2016,22(4):0689-0696.中分布的方法。”测定后分析记录最高酶活的出现时间。
如表1所示，为了说明比较本发明菌株的效果，表1提供了不同菌株的降解纤维素能力评价指标。水解圈直径(D)与菌落直径(d)的比值大小只能定性表现了菌株具有CMC-Na分解能力，而酶活大小则是决定菌株降解纤维素能力的定量指标；如表中所示，菌株CAF1、CAF2的最高酶活出现时间相同但CAF2的最高酶活略大于CAF1。
表1.各菌株降解纤维素能力评价
实施例5：菌株CAF2在水稻秸秆降解中的应用
具体包括以下步骤：
(1)菌株对水稻秸秆的崩解效果：用剪刀将水稻秸秆剪成约0.5cm*3cm条状，将水稻秸秆替代复筛培养基中碳源(CMC-Na)，0.5g水稻秸秆/瓶，按10％的接种量将种子液接于装液量为45mL/250mL三角瓶中，28℃、120r/min条件下恒温振荡培养，定期观察水稻秸秆崩解情况并记录。
(2)菌株对水稻秸秆的降解效果：将水稻秸秆粉碎后过40目筛，将水稻秸秆替代复筛培养基中碳源(CMC-Na)，2.0g水稻秸秆/瓶，按10％的接种量将种子液接于装液量为90mL/250mL三角瓶中，以接入10mL蒸馏水为对照，28℃、120r/min条件下恒温振荡培养，25天后，将培养物5000r/min离心10min，弃上清液，用蒸馏水反复清洗3-5次，80℃烘干至恒重，计算失重率。
如供试菌株对水稻秸秆崩解效果如表2.所示，将供试菌株接种于水稻秸秆液体培养基培养25天后，菌株CAF1和CF3分别在前5天、15天时，水稻秸秆无明显的形态变化；而从第5天开始，水稻秸秆在菌株CAF2作用下逐渐被降解，15天内，能够降解一半的水稻秸秆。
不同菌株对水稻秸秆的崩解效果如图1所示，菌株CAF2作用下，水稻秸秆被降解一半。
表2.水稻秸秆崩解程度
注：+：秸秆被降解较少；++：秸秆被降解一半；+++：秸秆基本被降解；++++：秸秆完全降解
如图2所示，各菌株对水稻秸秆均有一定的降解作用，利用本实施例菌株对水稻秸秆的降解效果中关于失重率的计算方法得到：菌株CAF2的降解效果较好，降解率为33.97％，菌株CAF1的降解率为25.22％，菌株CF3的降解效果最差，仅为2.94％。
实施例6：菌株CAF2在镉污染土壤治理中的应用
具体包括以下步骤：
1)将不同供试菌株通过固体发酵、烘干、粉碎等步骤获得孢子粉剂，并检测含量；
2)将供试土壤自然风干、去除植物根茎等杂物，碾碎过筛80目筛备用；
3)供试土壤分装，250mL烧杯中装100g镉污染土，按不同处理添加孢子粉，并调整接种量使土壤中各真菌孢子含量为1×106-1×107CFU/g，同时设置对照组；
4)土壤培育，每个处理添加100mL水并用玻璃棒搅拌均匀，放室温下自然培育10～50天；
5)在第0、10、20、30d取样测定土壤的有效镉含量，每次取样完毕后，加入等量水以确保土壤湿润状态；
如图3所示，随着土壤培育时间的延长，土壤中的有效镉含量逐渐下降，在第30天后，相比于初始有效镉含量，菌株的吸附率达到了74.27％，说明本发明中的菌株在土壤中具有良好的定殖能力，且为重金属污染修复治理中提供可利用的微生物菌种资源。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
