一种木薯渣发酵专用菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于农业基质微生物发酵技术领域，具体涉及一种木薯渣发酵专用菌剂及其制备方法。
背景技术
木薯又称木番薯或树薯，块根富含淀粉，有“淀粉之王”、“能源作物”的美誉。木薯渣是使用木薯生产加工淀粉或工业酒精后剩下的残渣，这些有机废弃物往往被丢弃，不仅占用土地资源，而且还会造成严重的环境污染。木薯渣营养成分丰富，含有高达78.7％的非氮化合物，其主要成分是可溶性淀粉化合物(如单糖、淀粉)和纤维类物质，淀粉含量在40％～50％，是很好的碳源。目前，有关木薯渣资源化利用方面的研究层出不穷，木薯渣作为一种可再生资源在替代草炭做基质上的应用成效显著，具有理化性质稳定、价格低廉等优点。木薯渣基质化利用发酵作为农林废弃物的可持续管理和再循环的处理方法，不仅可以提高经济效益，还能减轻由于木薯渣露天堆放产生的环境污染问题，但目前仍缺少木薯渣发酵专用微生物菌剂及其产品。开发利用高效安全的微生物菌剂进行农林废弃物基质化发酵已成为当前行业发展的趋势。
发明内容
本发明的目的是提供一种木薯渣发酵专用菌剂及其制备方法，本发明为木薯渣固体发酵菌剂快速繁殖以及木薯渣规模化基质生产上奠定基础。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：
一种木薯渣发酵专用菌剂，所述木薯渣发酵专用菌剂包含有细菌三种，分别为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；真菌两种，分别为绿色木霉(Trichoderma viride)和热带假丝酵母(Candida tropicalis(Castell.)Berkhout)；放线菌一种为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)。
本发明所述的高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿色木霉(Trichoderma viride)、热带假丝酵母(Candida tropicalis(Castell.)Berkhout)、灰略红链霉菌(Streptomycesgriseorubens)均为现有技术已知菌株，可通过市售途径进行购买获得，发明人通过筛选多个菌株，进行木薯渣发酵试验研究，可实现本发明的内容。
本发明木薯渣微生物菌剂中所用菌种：高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、绿色木霉和灰略红链霉菌，对木薯渣堆体中木质素、纤维素和半纤维素等具有较强的分解能力，有利于加快堆体温度升高，延长高温期的时间，促进发酵过程铵态氮向硝态氮的转化，减少发酵过程中的氮损失，最终提高木薯渣基质化产品质量，菌株之间无明显拮抗作用。
在一种优选的实施方式中，本发明所述的木薯渣发酵专用菌剂，高地芽孢杆菌：地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：绿色木霉：热带假丝酵母：灰略红链霉菌的体积比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)；进一步优选为，高地芽孢杆菌：地衣芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌：绿色木霉：热带假丝酵母：灰略红链霉菌的体积比为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)；进一步优选的，高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、热带假丝酵母和灰略红链霉菌等体积混合。
本发明还提供所述的木薯渣发酵菌剂的制备方法，其特征在于，
(1)分别培养高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、绿色木霉、热带假丝酵母和灰略红链霉菌6种微生物的悬液；
(2)将6种微生物的悬液进行均匀混合，得到木薯渣液态复合发酵菌剂；
(3)将步骤(2)所制得的木薯渣液态复合发酵菌剂接种于装有麸皮基料的发酵桶中培养，过筛后制得木薯渣发酵专用菌剂。
本发明步骤(1)中6种微生物的悬液的制备可以采用现有技术的方法进行制备，在一种优选的实施方案中，步骤(1)培养获得的悬液，其中高地芽孢杆菌悬液、地衣芽孢杆菌悬液、枯草芽孢杆菌悬液的OD600均为0.5～1.5；绿色木霉悬液、热带假丝酵母悬液和灰略红链霉菌悬液中孢子浓度为(0.5～1.5)*107个/ml。
在一种优选的实施方案中，步骤(2)高地芽孢杆菌悬液：地衣芽孢杆菌悬液：枯草芽孢杆菌悬液：绿色木霉悬液：热带假丝酵母悬液：灰略红链霉菌悬液的体积比为(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)：(1～5)，优选为(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)：(1～3)，更优选为等体积混合。
在一种优选的实施方案中，步骤(3)麸皮基料的含水量在10％以内，优选的，木薯渣液态复合菌剂接种于装有麸皮基料后含水率在30％以内，优选为15～30％。
在一种优选的实施方案中，木薯渣液态复合菌剂与麸皮基料的质量比为1：(3～5)，优选1：4；更优选的发酵桶中培养的温度为25～30℃，培养6～7d。
本发明所述的木薯渣发酵专用菌剂在木薯渣发酵中的应用。
本发明将各菌株活化后进行菌液摇瓶培养，通过对添加外源菌种进行拮抗验证，发现无明显拮抗作用，接种于装有麸皮等基料的发酵桶中进行发酵培养，晾干过筛后制成木薯渣发酵专用固体菌剂。
本发明还提供一种更为具体的木薯渣发酵菌剂的制备方法，
(a)试管斜面菌种的制备：将菌剂所用细菌分别接种于牛肉膏试管斜面培养基，所用真菌接种于PDA试管斜面培养基，所用放线菌接种于高氏一号试管斜面培养基，培养后得菌剂各微生物试管斜面菌种；
(b)两株外源菌种之间的拮抗验证：将步骤(1)活化的枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母斜面菌种在PDA培养基上划线培养，28℃于生化培养箱培养5天，若交叉点处两株菌长势良好，表明两株菌无明显拮抗作用；
(c)各微生物菌悬液的制备：将步骤(1)所制备的试管斜面菌种移接于液体培养基中，进行摇瓶培养，将细菌菌悬液培养至OD600约为1，真菌与放线菌的孢子浓度约为1*107个/ml时，得各微生物菌悬液；
(d)木薯渣原有菌种与外源菌种的拮抗验证：将步骤(3)中木薯渣原有菌种菌悬液以0.1/皿添加至PDA平板均匀涂布，将3个直径6mm无菌原滤纸片呈三角贴于其上，在滤纸片上加入20ul枯草芽孢杆菌菌悬液(热带假丝酵母菌悬液)，置于生化培养箱28℃培养七天，若菌落长势良好，无抑菌环出现，表明原有菌种与外源菌种之间无明显拮抗作用。
(e)木薯渣液态复合发酵菌剂的制备：将步骤(3)所制备的所有微生物菌种的菌悬液按相同体积比例混合，得木薯渣液态复合菌剂；
(f)木薯渣固体菌剂的制备：将步骤(5)所制得的木薯渣液态复合发酵菌剂接种于装有麸皮基料的发酵桶中培养，过筛后制得木薯渣发酵菌剂。
进一步的，所述步骤(a)中，所用试管采用18*180mm，硅胶塞15-19mm，牛肉膏斜面培养基的配比为每500ml灭菌水中加入牛肉膏1.5g，蛋白胨5.0g，NaCl2.5g，琼脂9.0g，调pH7.4-7.6；PDA斜面培养基的配比为每500ml灭菌水中加入马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂粉9g，自然pH；高氏一号斜面培养基的配比为每500ml灭菌水中加入KNO3 0.50g，可溶性淀粉10.0g，K2HPO4 0.25g，MgSO4.7H2O 0.25g，NaCl 0.25g，FeSO4 0.005g，琼脂9g，调pH 7.4-7.6。
进一步的，所述步骤(a)中，将细菌、真菌接种于斜面培养基后置于28℃条件下培养2～3天，将放线菌接种于高氏一号斜面培养基后置于28℃条件下培养5～7天，待长好后置于4℃冰箱中保存。
进一步的，所述步骤(c)中，将各菌种接种于装有液体培养基的150ml锥形瓶中，摇瓶培养参数设置为200r/min，震荡培养24h。
进一步的，所述步骤(f)中，麸皮经过紫外杀菌处理，发酵桶为消毒塑料桶中，表面盖无菌纱布，21℃～28℃环境中培养6～7天，每天人工翻匀1次，即得木薯渣发酵菌剂，采用稀释涂布法检测菌剂中有效活菌数，固体菌剂中细菌、真菌和放线菌有效活菌数达到微生物菌剂国家标准(≥0.5×108cfu/g)。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供的木薯渣发酵菌剂，菌株之间可以很好的共生，微生物菌种之间无拮抗作用，采用桶式发酵方法，制作木薯渣固体发酵菌剂，操作简便易行，实用性较强，生产成本降低，可以实现基质发酵菌剂产品的批量生产。
本发明所述的木薯渣发酵菌剂可加速木薯渣发酵堆体的升温，可以加快木薯渣堆腐物料的发酵速度、减轻堆体中的恶臭味，提高木薯渣发酵质量，各项指标均优于未添加菌剂的木薯渣堆体，本发明为木薯渣固体发酵菌剂快速繁殖以及在木薯渣基质规模化生产上提供技术支持。
附图说明
图1显示为一种木薯渣发酵专用菌剂及其制备方法的技术路线图。
图2显示为两株外源菌种之间的拮抗试验图片。
图3显示为原有菌种与枯草芽孢杆菌拮抗试验图片。
图4显示为原有菌种与热带假丝酵母拮抗验证图片。
图5显示为木薯渣发酵专用固体菌剂成品。
图6显示为添加木薯渣发酵专用固体菌剂(T3)与未添加菌剂自然发酵(CK)和添加市售菌剂的温度变化对比。
图7显示为添加添加木薯渣发酵专用固体菌剂(T3)与未添加菌剂自然发酵(CK)和添加市售菌剂的含水率变化对比。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，凡在本发明的构思前提下对本发明制备方法的简单改进都属于本发明的保护范围之内。下面实施例未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1：
如附图1所示的一种木薯渣发酵专用菌剂及其制备方法，具体操作步骤如下：
(1)试管斜面菌种的制备：将菌剂所用细菌：高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(均可购自商城北纳生物)分别接种于pH 7.4的牛肉膏试管斜面培养基(培养基成分为：牛肉膏1.5g，蛋白胨5.0g，NaCl 2.5g，琼脂9.0g，灭菌水500ml)，所用真菌绿色木霉和热带假丝酵母(均可购自商城北纳生物公司)接种于自然pH的PDA试管斜面培养基(培养基成分：马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂粉9g，灭菌水500ml)，所用放线菌灰略红链霉菌(也可由商城北纳生物公司购得)接种于pH为7.4的高氏一号试管斜面培养基(培养基成分为：KNO30.50g，可溶性淀粉10.0g，K2HPO4 0.25g，MgSO4.7H2O 0.25g，NaCl 0.25g，FeSO4 0.005g，琼脂9g，灭菌水500ml)，试管规格采用18*180mm，硅胶塞采用15～19mm，接种后于28℃生化培养箱进行倒置培养，3天后得细菌、真菌试管斜面菌种置于4℃冰箱保存备用，6天后得放线菌试管斜面菌种置于4℃冰箱保存备用。
(2)两株外源菌种之间的拮抗验证：将步骤(1)活化的枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母斜面菌种在PDA培养基上划线培养，28℃于生化培养箱培养5天，如图2所示，交叉点处两株菌长势良好，两株菌无明显拮抗作用。
(3)各微生物菌悬液的制备：将步骤(1)所制备的细菌、真菌、放线菌试管斜面菌种分别移接于装有牛肉膏液体培养基、PDA液体培养基、高氏一号液体培养基的20ml锥形瓶中，28℃条件下，160转摇菌培养24h,将细菌菌悬液培养至OD600约为1，真菌与放线菌的孢子浓度约为1*107个/ml时，得各微生物菌悬液。
(4)木薯渣原有菌种与外源菌种的拮抗验证：将步骤(3)中木薯渣原有菌种菌悬液以0.1ml/皿添加至PDA平板均匀涂布，将3个直径6mm无菌原滤纸片呈三角贴于其上，在滤纸片上加入10ul枯草芽孢杆菌菌悬液(热带假丝酵母菌悬液)，置于生化培养箱28℃培养6天，如图3、图4所示，菌落长势良好，无抑菌环出现，则原有菌种与外源菌种之间无拮抗作用。
(5)木薯渣液态复合发酵菌剂的制备：将步骤(3)所制备的所有微生物菌种的菌悬液按相同体积比例混合，得木薯渣液态复合发酵菌剂。
(6)木薯渣固体菌剂的制备：将步骤(5)所制得的木薯渣液态复合发酵菌剂接种于装有麸皮基料的发酵桶中培养，如图5所示，过筛后制得木薯渣固体菌剂。
所用固态发酵基料为麸皮(使用前紫外灭菌处理)，将含水率控制在10％以内，然后按照木薯渣液态菌剂：基料＝2：8(质量比)混合均匀，控制含水率在30％以内，置于消毒发酵桶中，搅拌，润料1h后，表面盖无菌纱布，28℃～33℃培养7d，每天人工翻匀1次，得木薯渣专用固体菌剂，采用稀释涂布法检测菌剂中有效活菌数。固体菌剂中细菌、真菌和放线菌有效活菌数达到微生物菌剂国家标准(≥0.5×108cfu/g)。
实施例2：
如附图1所示的一种木薯渣发酵专用菌剂及其制备方法，具体操作步骤如下：
(1)试管斜面菌种的制备：将菌剂所用细菌：高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(均可购自商城北纳生物)分别接种于pH 7.6的牛肉膏试管斜面培养基(培养基成分为：牛肉膏1.5g，蛋白胨5.0g，NaCl 2.5g，琼脂9.0g，灭菌水500ml)，所用真菌绿色木霉和热带假丝酵母(均可购自商城北纳生物)接种于自然pH的PDA试管斜面培养基(培养基成分：马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂粉9g，灭菌水500ml)，所用放线菌灰略红链霉菌(也可由商城北纳生物公司购得)接种于pH为7.6的高氏一号试管斜面培养基(培养基成分为：KNO30.50g，可溶性淀粉10.0g，K2HPO4 0.25g，MgSO4.7H2O 0.25g，NaCl 0.25g，FeSO4 0.005g，琼脂9g，灭菌水500ml)，试管规格采用18*180mm，硅胶塞采用15～19mm，接种后于30℃生化培养箱进行倒置培养，2天后得细菌、真菌试管斜面菌种置于4℃冰箱保存备用，5天后得放线菌试管斜面菌种置于4℃冰箱保存备用。
(2)两株外源菌种之间的拮抗验证：将步骤(1)活化的枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母斜面菌种在PDA培养基上划线培养，33℃于生化培养箱培养7天，交叉点处两株菌长势良好，则两株菌无明显拮抗作用。
(3)各微生物菌悬液的制备：将步骤(1)所制备的细菌、真菌、放线菌试管斜面菌种分别移接于装有牛肉膏液体培养基、PDA液体培养基、高氏一号液体培养基的2000ml锥形瓶中，33℃条件下，250转摇菌培养24h,将细菌菌悬液培养至OD600约为1，真菌与放线菌的孢子浓度约为1*107个/ml时，得各微生物菌悬液。
(4)木薯渣原有菌种与外源菌种的拮抗验证：将步骤(3)中木薯渣原有菌种菌悬液以0.2ml/皿添加至PDA平板均匀涂布，将3个直径6mm无菌原滤纸片呈三角贴于其上，在滤纸片上加入20ul枯草芽孢杆菌菌悬液(热带假丝酵母菌悬液)，置于生化培养箱33℃培养7天，菌落长势良好，无抑菌环出现，则原有菌种与外源菌种之间无拮抗作用。
(5)木薯渣液态复合发酵菌剂的制备：将步骤(3)所制备的所有微生物菌种的菌悬液按相同体积比例混合，得木薯渣液态复合发酵菌剂。
(6)木薯渣固体菌剂的制备：将步骤(5)所制得的木薯渣液态复合发酵菌剂接种于装有麸皮基料的发酵桶中培养，过筛后制得木薯渣固体菌剂。
所用固态发酵基料为麸皮(使用前紫外灭菌处理)，将含水率控制在10％以内，然后按照木薯渣液态菌剂：基料＝2：8(质量比)混合均匀，控制含水率在30％以内，置于消毒发酵桶，搅拌，润料2h后，表面盖无菌纱布，28℃培养7d，每天人工翻匀1次，得木薯渣专用固体菌剂，采用稀释涂布法检测菌剂中有效活菌数。固体菌剂中细菌、真菌和放线菌有效活菌数达到微生物菌剂国家标准(≥0.5×108cfu/g)。
实施例3：
如附图1所示的一种木薯渣发酵专用菌剂及其制备方法，具体操作步骤如下：
(1)试管斜面菌种的制备：将菌剂所用细菌：高地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌(均可购自商城北纳生物)分别接种于pH 7.4～7.6的牛肉膏试管斜面培养基(培养基成分为：牛肉膏1.5g，蛋白胨5.0g，NaCl 2.5g，琼脂9.0g，灭菌水500ml)，所用真菌绿色木霉和热带假丝酵母(均可购自商城北纳生物)接种于自然pH的PDA试管斜面培养基(培养基成分：马铃薯100g，葡萄糖10g，琼脂粉9g，灭菌水500ml)，所用放线菌灰略红链霉菌(也可由商城北纳生物公司购得)接种于pH为7.4～7.6的高氏一号试管斜面培养基(培养基成分为：KNO3 0.50g，可溶性淀粉10.0g，K2HPO4 0.25g，MgSO4.7H2O 0.25g，NaCl 0.25g，FeSO40.005g，琼脂9g，灭菌水500ml)，试管规格采用18*180mm，硅胶塞采用15～19mm，接种后于28℃～30℃生化培养箱进行倒置培养，2天后得细菌、真菌试管斜面菌种置于4℃冰箱保存备用，5天后得放线菌试管斜面菌种置于4℃冰箱保存备用。
(2)两株外源菌种之间的拮抗验证：将步骤(1)活化的枯草芽孢杆菌和热带假丝酵母斜面菌种在PDA培养基上划线培养，28℃于生化培养箱培养3～5天，交叉点处两株菌长势良好，则两株菌无拮抗作用。
(3)各微生物菌悬液的制备：将步骤(1)所制备的细菌、真菌、放线菌试管斜面菌种分别移接于装有牛肉膏液体培养基、PDA液体培养基、高氏一号液体培养基的锥形瓶中，28℃～33℃条件下，160～250转摇菌培养24h,将细菌菌悬液培养至OD600约为1，真菌与放线菌的孢子浓度约为1*107个/ml时，得各微生物菌悬液。
(4)木薯渣原有菌种与外源菌种的拮抗验证：将步骤(3)中木薯渣原有菌种菌悬液以0.1ml～0.2ml/皿添加至PDA平板均匀涂布，将3个直径6mm无菌原滤纸片呈三角贴于其上，在滤纸片上加入10ul～20ul枯草芽孢杆菌菌悬液(热带假丝酵母菌悬液)，置于生化培养箱28℃培养5～7天，菌落长势良好，无抑菌环出现，则原有菌种与外源菌种之间无明显拮抗作用。
(5)木薯渣液态复合发酵菌剂的制备：将步骤(3)所制备的所有微生物菌种的菌悬液按相同体积比例混合，得木薯渣液态复合发酵菌剂。
(6)木薯渣固体菌剂的制备：将步骤(5)所制得的木薯渣液态复合发酵菌剂接种于装有麸皮基料的发酵桶中培养，过筛后制得木薯渣固体菌剂。
所用固态发酵基料为麸皮(使用前紫外灭菌处理)，将含水率控制在10％以内，然后按照木薯渣液态菌剂：基料＝2：8(质量比)混合均匀，控制含水率在30％以内，置于消毒发酵桶中，搅拌，润料l～2h后，表面盖无菌纱布，28℃培养6～7d，每天人工翻匀1次，得木薯渣专用固体菌剂，采用稀释涂布法检测菌剂中有效活菌数。固体菌剂中细菌、真菌和放线菌有效活菌数达到微生物菌剂国家标准(≥0.5×108cfu/g)。
实施例4：
木薯渣发酵专用固体菌剂堆肥效果对比，如图6、图7所示：
木薯渣发酵专用固体菌剂的堆肥对比试验，主要采用本发明所制得的木薯渣固体菌剂，按1‰的质量比加入菌剂，调木薯渣含水率到60％～70％，建成1.9m宽，1.2m高，5m长的条堆进行发酵(T3)，以未添加菌剂自然发酵的堆体为对照。主要堆肥效果有：添加木薯渣专用固体菌剂的堆体可加速升温期温度的提高，延长高温期发酵时间，有利于木薯渣物料中虫卵和病原菌的杀灭，在堆肥的第10天，温度达到55.93℃，比未添加菌剂(CK)和添加市售菌剂的堆体提前进入高温期；在堆肥过程中，添加固体菌剂进行腐熟发酵的堆体产生的不愉快气味明显小于未加菌剂发酵的堆体，木薯渣固体菌剂的使用可一定程度上减少臭味的产生；另外，添加木薯渣专用固体菌剂的堆体含水率下降速度要快于CK和添加一般市售菌剂的堆体。
