一种促进蓝莓开花的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种促进蓝莓开花的siRNA及其应用。
背景技术
蓝莓是一种小浆果，果实呈蓝色、果肉细腻、种子极小，具有“浆果之王”和“水果皇后”的美誉。蓝莓果实平均重0.5～2.5g，最大重5g，可食率为100％，甜酸适口，且具有香爽宜人的香气，为鲜食佳品。蓝莓不仅富含常规营养成分，如蛋白质、维生素、矿物质及微量元素等，而且还含有极为丰富的花青素、黄酮类和多糖类化合物，具有缓解视力疲劳，促进视网膜细胞中的视紫质再生，预防近视，改善和增进视力等功效。
除缓解视力疲劳外，蓝莓还具有诸多保健功能，如预防心脑血管疾病、防癌、提高免疫力、缓解咽喉疼痛及腹泻等等，所以，对蓝莓的利用和衍生品开发越来越受到重视。
花是果树极为重要的生殖器官之一，而花芽分化是果树由营养生长向生殖生长转变的重要阶段，对果树的成花过程、花数量和坐果率起着关键作用。花芽分化的早晚和质量对农林业果树生产的产量、质量有重要影响。温度是诱导植物花芽分化的关键环境因子之一，落叶果树通常要经历一个较低温度的积累量(即需冷量)才能够正常诱导花芽分化和开花，需冷量不足通常会导致果树花芽分化不完整，花器官畸形或严重败育。落叶果树花芽分化机制研究起步较晚，相关研究成果主要借鉴拟南芥等模式植物的研究。植物开花有4条不同途径，分别是依赖光周期的开花途径、自主开花途径、依赖春化的开花途径和赤霉素途径。FLC(FLOWE%20RING%20LOCUS%20C)基因属于MADS－box基因家族成员，在植物开花过程中具有重要作用[5]。在拟南芥中，低温通过对AtFLC基因的转录及蛋白表达水平进行负调控，从而调控拟南芥花芽分化和成花过程。
鉴于蓝莓广阔的市场前景及极高的社会和经济效益，蓝莓已经成为新一代健康水果的引领者，国内的种植规模逐年提升。为了提供不同时间段的蓝莓鲜果并提高收益，可以采取冷棚，暖棚等方式。也有通过育种获得早熟，晚熟蓝莓品种的，但目前国内的蓝莓成熟期还是相对集中。
本发明了一种促进蓝莓开花的siRNA，将该siRNA当做肥料喷施在蓝莓花芽或叶芽上，可以促进蓝莓开花，从而使蓝莓早结果早成熟，并提早进入市场，获得较好经济效益。
发明内容
本发明的目的是解决蓝莓成熟期集中的技术问题，提供了一种促进蓝莓开花的siRNA，具有促进蓝莓开花、早结果和早成熟的技术效果。
本发明提供的技术方案为：
一种促进蓝莓开花的siRNA，所述siRNA为siRNA1、siRNA2或siRNA3中的一种；
所述siRNA1的序列为：
正义链：5’-tctatacgcttcagttgaaccctgcc-3’，
反义链：5’-ggcagggttcaactgaagcgtataga-3’；
所述siRNA2的序列为：
正义链：5’-tctatacgcttcagttgaaccctgcc-3’；
所述siRNA3的序列为：
反义链：5’-ggcagggttcaactgaagcgtataga-3’。
优选的是，所述siRNA为siRNA2。
优选的是，所述siRNA为siRNA3。
优选的是，在促进蓝莓开花、早结果和早成熟中的应用。
优选的是，将siRNA制成3-5mM的溶液喷涂在蓝莓花芽或叶芽上至开
花前。
优选的是，所述喷涂次数为1-3次。
优选的是，所述siRNA可促进提早开花1-7天。
本发明的有益效果体现在以下方面：
本发明提供了一种促进蓝莓开花的siRNA，将该siRNA当做肥料喷施在蓝莓花芽或叶芽上，可以促进蓝莓开花，从而使蓝莓早结果早成熟，并提早进入市场，获得较好经济效益，干扰效率极高、特异性好、灵敏度高、操作简便、实验周期短、价格低廉。
附图说明
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
FLC基因是MADS-box家族的重要成员，参与调控植物花芽分化和开花过程，在春化作用中起关键作用。本试验研究关于调控FLC基因中可提调控提前开花的siRNA序列,发现其中一个siRNA的靶基因转录及蛋白表达水平进行负调控，从而调控蓝莓花芽分化和成花过程。具体设计过程参照Yiu%20SM,Wong%20PW[1]涉及的siRNA设计方法。
参考文献
[1]Yiu%20SM,Wong%20PW,Lam%20TW,Mui%20YC,Kung%20HF,Lin%20M,Cheung%20YT.Filtering%20ofIneffective%20siRNAs%20and%20Improved%20siRNA%20Design%20Tool.Bioinformatics.2005Jan%2015；21(2):144-51
实施例1
所述siRNA1的序列为：
正义链：5’-tctatacgcttcagttgaaccctgcc-3’，
反义链：5’-ggcagggttcaactgaagcgtataga-3’。
(1)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(2)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成3mM的水溶液，在花芽萌发前，实施喷洒2次，做好记录。
实施例2
所述siRNA1的序列为：
正义链：5’-tctatacgcttcagttgaaccctgcc-3’，
反义链：5’-ggcagggttcaactgaagcgtataga-3’；
(1)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(2)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成4mM的水溶液，在花芽萌发前，实施喷洒2次，做好记录。
实施例3
所述siRNA1的序列为：
正义链：5’-tctatacgcttcagttgaaccctgcc-3’，
反义链：5’-ggcagggttcaactgaagcgtataga-3’；
(1)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(2)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成5mM的水溶液，在花芽萌发前，实施喷洒2次，做好记录。
实施例4
所述siRNA2的序列为：
正义链：5’-tctatacgcttcagttgaaccctgcc-3’。
(3)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(4)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成3mM的水溶液，在花芽萌发前，实施喷洒2次，做好记录。
实施例5
所述siRNA1的序列为：
正义链：5’-tctatacgcttcagttgaaccctgcc-3’。
(1)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(2)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成4mM的水溶液，在花芽萌发前，实施喷洒2次，做好记录。
实施例6
所述siRNA1的序列为：
正义链：5’-tctatacgcttcagttgaaccctgcc-3’。
(1)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(2)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成5mM的水溶液，在花芽萌发前，实施喷洒2次，做好记录。
实施例7
所述siRNA3的序列为：
反义链：5’-ggcagggttcaactgaagcgtataga-3’。
(1)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(2)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成3mM的水溶液，第一朵花开放期，实施喷洒2次，做好记录。
实施例8
所述siRNA1的序列为：
反义链：5’-ggcagggttcaactgaagcgtataga-3’。
(1)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(2)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成4mM的水溶液，在花芽萌发前，实施喷洒2次，做好记录。
实施例9
所述siRNA1的序列为：
反义链：5’-ggcagggttcaactgaagcgtataga-3’。
(1)将上述基因片段连接而成的人工基因构建到有颈环结构的表达载体pET-SAAK上。
(2)转化后的大肠杆菌进行发酵。
(3)离心收集大肠杆菌菌体，以均质机破碎法破菌，得到RNA抽提物。
(4)用大孔树脂进行吸附，洗脱液用酒精沉淀回收dsRNA，再以RNaseⅢ将dsRNA切成18-25bp的siRNAs，除去RNaseⅢ，获得siRNA1。
(5)按照质量比为大豆磷脂：胆固醇：维生素E＝80:10:1的配比，称取以上物质溶解于CHCl3中，在30°减压旋蒸浓缩形成脂膜，以氮气除去残存CHCl3，在35℃抽气条件下，加入数颗玻璃珠，以1克脂膜加入25毫升pH为7的含0.5％吐温80,5mg维生素C和待包埋siRNA1的磷酸缓冲液对脂膜进行旋蒸15min，冰水浴条件下对水化液进行超声处理2次，每次5min，得到包埋siRNA1的脂质体。
(6)取siRNA1的脂质体配成5mM的水溶液，在花芽萌发前，实施喷洒2次，做好记录。
试验例
供试地点
试验于2016年5～7月在云南省丽江市拉市海普蓝高科蓝莓基地进行，基地地理位置东经100°7’33”，北纬26°54’39”，海拔2450m，属高原性西南季风气候，昼夜温差大,雨季多集中于6～10月，2016年平均气温13.6℃，总降雨量966.3mm，总日照时数2332.8h，无霜期229d，试验地的土壤pH值为5.01，铵态N和速效K百分含量分别为0.32％、0.049％，速效P土壤内含量为31.89mg/kg，土壤含水量在70％左右。
供试品种
试验材料为云南省主要栽培品种，为别是半高丛品种‘北陆’、南高丛品种‘密斯蒂’‘奥尼尔’和北高丛品种‘蓝丰’、‘布里吉塔’，均为定植第2年，株行距为100cm×200cm，无病虫害，栽培管理方法一致，生长发育正常。
试验内容与方法
越橘的物候期对比
于2015～2016年进行两年物候期调查。选取生长健壮、发育正常、管理一致的植株作为标准株，每个品种随机选5个标准株，做挂牌标记，每隔两天做一次调查，分别记录五个越橘品种第一朵花开放期、初花期(开花量达到25％)、盛花期(开花量达到50％)、落花期(开花量达到75％)、幼果期、果实膨大期、果实变色期和果实成熟期等时期的起始时间。
表1不同越橘品种的物候期
试验例1
将实施例1中物质在五个越橘品种花芽萌发前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表2。
表2实施例1对不同越橘品种的物候期
试验例2
将实施例2中物质在五个越橘品种花芽萌发前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表3。
表3实施例2对不同越橘品种的物候期
试验例3
将实施例3中物质在五个越橘品种花芽萌发前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表4。
表4实施例3对不同越橘品种的物候期
试验例4
将实施例4中物质在五个越橘品种花芽萌发前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表5。
表5实施例4对不同越橘品种的物候期
试验例5
将实施例5中物质在五个越橘品种花芽萌发前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表6。
表6实施例5对不同越橘品种的物候期
试验例6
将实施例6中物质在五个越橘品种第一朵花开放期前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表7。
表7实施例6对不同越橘品种的物候期
试验例7
将实施例7中物质在五个越橘品种第一朵花开放期前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表8。
表8实施例7对不同越橘品种的物候期
试验例8
将实施例8中物质在五个越橘品种第一朵花开放期前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表9。
表9实施例8对不同越橘品种的物候期
试验例9
将实施例9中物质在五个越橘品种花芽萌发前喷涂2次，其开花和果实成熟情况见表10。
表10实施例9对不同越橘品种的物候期
如试验例1-9所示，将实施例1-9中所涉及本发明的三种siRNA1、siRNA2、siRNA3序列试剂均可提前供试植物的开花时间和结果时间，其中实施例1、实施例2和实施例3可分别提前开花时间(第一朵花开放期+初花期+盛花期+落花期)平均为1天、2天和2天，提前结果时间(幼果期+果实膨大期+果实变色期+果实成熟期)分别为4天、5天和5天；实施例4、实施例5和实施例6可分别提前开花时间(第一朵花开放期+初花期+盛花期+落花期)平均为3天、3天和4天，提前结果时间(幼果期+果实膨大期+果实变色期+果实成熟期)分别为6天、7天和8天；实施例7、实施例8和实施例9可分别提前开花时间(第一朵花开放期+初花期+盛花期+落花期)平均为2天、2天和2天，提前结果时间(幼果期+果实膨大期+果实变色期+果实成熟期)分别为4天、5天和6天。
综上，三种siRNA1、siRNA2、siRNA3序列试剂均可提前供试植物的开花时间和结果时间，其中实施例6中siRNA2序列试剂，浓度为5mM的水溶液，效果最佳。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用。它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改。因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
