一种以鸡粪为基质的乳酸菌培养物及应用
技术领域
本发明涉及生物发酵饲料领域，具体涉及一种以鸡粪为基质的乳酸菌培养物及应用。
背景技术
近年来随着微生物发酵工艺的发展，生物发酵饲料引起业界广泛的兴趣。微生物发酵饲料与传统饲料相比具有其自身独特的优越性，符合当前健康环保型养殖业发展的要求。生物发酵饲料是指在人为控制的条件下，以动植物性农副产品为原料，如豆粕、棉籽粕、菜籽粕等，通过枯草芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌等微生物的代谢作用，将原料中的抗营养因子经过分解及合成而转化为更适合被动物采食、吸收的养分的生物原料。李永凯等研究表明，生物发酵饲料经过益生菌发酵后会产生更多的活性益生菌菌体、各种酶、多种维生素、活性小肽、氨基酸、抑菌素、免疫增强因子、促生长因子等有益物质，其可以促进动物生长，维持动物肠道菌群平衡，同时有效避免了添加抗生素等药物，不会产生耐药性、药物残留等问题。
鸡粪中含有动物所需的大部分营养物质和矿物质。鸡粪干物质中，粗蛋白28.0％、纯蛋白11.3％、可消化蛋白质14.4％、粗脂肪2％左右、粗纤维10％左右、钙6％～8％、磷2.5％～3.0％，还含有锌、铜、锌、铁等矿质元素以及丰富的B族维生素，对畜禽的生产均有益。但是，鸡粪中可能含有某些寄生虫卵、病原微生物及抗生素残留，而且直接用鸡粪饲喂猪、鸡等单胃动物，蛋白质利用率很低，代谢能量低，营养价值低。因此，要提高鸡粪应用价值，必须提高其粗蛋白质的利用率，最好的方法是对鸡粪进行发酵加工，通过微生物利用鸡粪中有机酸和无机氮等来实现蛋白质的再生成。
现有技术中采用鸡粪发酵生产饲料的方法很多，主要有干燥法、化学法、膨化处理法，热喷处理法和发酵法等，其中干燥法、化学法、膨化处理法和热喷处理法需要消耗大量能量，且极大破坏了蛋白质和氨基酸等的结构，降低了饲料的营养成分。李贤柏等采用米曲霉和白地霉发酵鸡粪及辅料，利用米曲霉和白地霉发酵鸡粪及辅料,将鸡粪粗蛋白(占干物质的%2028.12％)中的非氨基氮(占粗蛋白的70.27％)重建成氨基氮,使培养物粗蛋白中的氨基氮由发酵前的56.89％提高到发酵后的95.36％,大大提高了鸡粪的利用价值。喻东等采用乳酸菌、酵母菌、嗜热异养氨氧化细菌和嗜热侧孢霉菌组成混合微生物菌剂，将雏鸡鸡粪与由玉米粉、麸皮和豆粕组成的混合辅料混合发酵48h。结果表明，与发酵前相比，利用微生物发酵可很大程度上改善鸡粪的感观特征，提高其适口性，并可再次用于肉鸡养殖。但是由于养殖户和消费者心理接受程度的原因，鸡粪发酵生物饲料通常不用于畜禽养殖，目前仍停留在研究阶段。
鸡粪在传统水产养殖中也常直接用作鱼饲料和鱼肥，但是使用过程中容易污染环境,被浮游生物所利用的过程较长,且在矿化过程中大量消耗水体中的氧气，造成水产动物缺氧死亡。未发酵处理鸡粪的大量施用也会带来环境、水质污染和水产品的生物安全等一系列问题，在很多水产养殖区域己被限用或禁用。生物发酵鸡粪，经过微生物的发酵降解过程，改变了原料的理化性状，提高原料的消化吸收率、降解原料的有毒物质，或将原料转化为大量微生物菌体蛋白，同时积累了有益微生物活菌和大量的中间代谢产物，不会造成抗生素残留和抗药性等问题。在水产养殖中使用，可作为鱼虾饲料；亦具有肥料效果，促进水体浮游生物的大量增长，从而为滤食性鱼类提供饵料生物。
同时，鸡粪的原料来源广泛、成本低廉，能节省大量的原料成本。随着当前水产养殖行业向绿色产业发展，对水产品的安全、无污染、无残留的要求也更加严格。生物发酵饲料对新时期下的水产养殖业具有重大的现实意义，也必然会成为大势所趋。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以鸡粪为基质生产乳酸菌培养物，该培养物是以鸡粪为基质或者基质之一，利用植物乳杆菌L16发酵获得，所述的植物乳杆菌L16的保藏编号为：CCTCC%20NO：M2019502。
本发明的另一个目的在于提供乳酸菌培养物的应用，该培养物可用于制备成水产养殖中的鱼虾饲料，或是制备成水产肥料，可以降解水体亚硝酸盐，增加水中浮游生物含量。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
植物乳杆菌L16的获得：
申请人自泡菜、果园根际土、菜地腐烂叶以及剁辣椒样品中，分离乳酸菌，同时进一步筛选对刺盘孢菌、茄链格孢菌以及尖刀镰孢菌黄瓜专化型抑制效果最佳的菌株，最终获得了一株植物乳杆菌，该菌株已于2019年6月28日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Lactobacillus%20plantarum%20L16，保藏编号为：CCTCC%20NO：M2019502，地址：中国武汉武汉大学。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus%20plantarum)L16为革兰氏阳性球菌，无芽胞。在MRS%20固体培养基上菌落为乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐，菌落直径约%203mm。菌株经简单染色后在显微镜下观察，形状呈直或弯的杆状，单个、成对或成链状，大小为0.9-1.0μm×4.5-6.0μm，无鞭毛。兼性厌氧，不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。能在葡萄酸盐中生长，并产CO2；利用葡萄糖同型乳酸发酵产L-乳酸；发酵1分子的核糖或其他的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。最适生长温度为35℃。
一种以鸡粪为基质生产乳酸菌培养物，所述的培养物的制备过程包括：以鸡粪为基质或者基质之一，利用植物乳杆菌L16发酵。
以鸡粪为基质生产乳酸菌培养物的应用，包括该培养物用于制备成鱼虾饲料，或是制备成水产肥料。
与现有技术相比，具有以下优点：
1.本发明以鸡粪为基质制得乳酸菌培养物产品应用广泛，可应用于多种滤食性和杂食性鱼类，可以降解水体亚硝酸盐，增加水中浮游生物含量。
2.与同类产品相比，本发明乳酸菌培养物产品益生菌、氨基酸和有机酸含量较高，能有效增强水产动物的健康状态，有利于提升品质。
3.本发明原料价格低廉，来源广泛，设备投资少，生产工艺简便，是一种废物再利用，解决环境污染的绿色产品。
具体实施方式
根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
植物乳杆菌L16菌株的筛选：
1.培养基的配制：
BCP培养基:蛋白胨5g；酵母膏3g；乳糖5g；琼脂20g；0.5％溴甲酚紫10ml；蒸馏水1000ml；pH值6.8～7.0。
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；牛肉浸粉10g/L；柠檬酸二铵2g/L；醋酸钠5g/L；吐温80%201g/L；K2HPO4%202g/L；MgSO4·7H2O%200.058g/L；%20MnSO4·4H2O%200.25g/L；蒸馏水1000ml；pH6.5-6.8。
PDA培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂15～20g；蒸馏水1000ml；自然PH。
固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂，所有培养基115℃灭菌20min。
2.初筛：取泡菜、果园根际土、菜地腐烂叶以及剁辣椒样品各5g置于300ml%20MLS液体培养基培养12h后，取1ml培养液梯度稀释，涂布于BCP平板，37℃培养48h后挑选其中典型乳酸菌菌落形态(菌落周边变黄)的菌落进行划线分离培养，每个样品挑选5个左右，将得到的单菌落转接到MRS液体培养基培养12h，MRS斜面保藏。
3.复筛：对初筛得到的20个菌株(编号L1-L20)进行平板复筛，分别针对番茄早疫病(病原菌：茄链格孢菌)、黄瓜炭疽病(病原菌：刺盘孢菌)以及黄瓜枯萎病(尖刀镰孢菌黄瓜专化型)三种常见植物病菌检测其抑菌性能，具体如下：
用直径0.6cm的打孔器在PDA平板上打取培养好的病原菌菌片,转接于另一个PDA平板中央,用挑针将活化的乳酸菌(编号L1-L20)分别对称接种在距病原菌菌落边缘3cm处,对照只接病原菌，之后26℃恒温培养。待对照长满平板时,测量病原菌的平均菌落直径和乳酸菌的平均抑菌带宽,计算抑菌率,以乳酸菌的平均抑菌率大小和平均抑菌带宽来衡量拮抗作用的强弱。
最终筛选出菌株L16对三种病原菌均表现最好的拮抗效果，对刺盘孢菌的平板抑制率为44.29％，对茄链格孢菌抑制率为40％，对尖刀镰孢菌黄瓜转化型抑制率为45.71％(表1)。菌株L16表现出较好的生防潜力，接下来以菌株L16为对象进行后续研究。
表1菌株L16对植物病原菌的抑制效果
菌株L16生化鉴定：用结晶紫对筛选出来的目的菌株L16进行简单染色，并通过光学显微镜进行观察。发现该菌株为革兰氏阳性球菌，无芽胞，呈直或弯的杆状，单个、成对或成链状。在MRS固体培养基上菌落为乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐，菌落直径约3mm。生理生化鉴定菌株L16兼性厌氧，不还原硝酸盐，不液化明胶，接触酶和氧化酶皆阴性。能在葡萄酸盐中生长，并产CO2；利用葡萄糖同型乳酸发酵产L- 乳酸；发酵1分子的核糖或其他的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。最适生长温度为 35℃。
菌株的16s鉴定：挑取L16单菌落用通用引物进行扩增，对扩增产物进行16S LLNA测序分析并构建系统进化树。结果表明该序列与Lactobacillus plantaLumsubsp.aLgentoLatens 和Lactobacillus plantaLumsubsp.plantaLum的16S rDNA序列的相似性最高，达99％，可确定该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌L16。该菌株已于2019年6月28日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：lactobacillus plantaLum L16，保藏编号为：CCTCC NO：M2019502，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
植物乳杆菌L16益生性能的研究：
实验采用牛津杯法研究了植物乳杆菌L16对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌能力。由表2可以看出，L16菌株对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出一定的抑制特性，与对照组比较差异极显著，抑制金黄色葡萄球菌能力强于抑制大肠杆菌能力。
表2植物乳杆菌L16的抑菌活性
注：与对照组比较，**表示差异极显著(P<0.01)
取鱼塘水，于500mL三角瓶中分装为400mL，每组设投菌和对照2个处理，每个处理3个平行。所有水样经115℃灭菌20min，冷却后在无菌操作台中添加已灭菌的亚硝酸钠溶液至亚硝酸盐浓度为10mg/L，投菌处理按照水体含菌终浓度1×105个/mL的量投加乳酸菌L16菌液，对照处理则添加等量灭菌处理的菌液。实验期间，水温维持37℃恒温，每天定时取样，检测水体亚硝酸盐残留浓度，实验周期为4d。
结果如表3所示，实验组中水体亚硝酸盐持续下降，第4天实验结束时亚硝酸盐去除率达到68％，而对照组亚硝酸盐几乎没有变化，说明该植物乳杆菌L16具有较强的亚硝酸盐去除能力。
表3乳酸菌培养物对水体亚硝酸盐的影响
可见该菌株具有在水产养殖中的应用潜力。
实施例3：
植物乳杆菌L16高密度培养：
发酵培养基：葡萄糖50g/L；玉米浆粉15g/L；酵母提取物5g/L；蛋白胨5g/L；柠檬酸二铵2g/L；醋酸钠5g/L；吐温80 1g/L；K2HPO4 2g/L；MgSO4·7H2O 1.0g/L；MnSO4·H2O0.25g/L；FeSO4·7H2O 0.5g/L；pH 6.5-6.8，115℃灭菌20min。
补料培养基：葡萄糖200g/L，115℃高压蒸汽灭菌20min。
采用5L发酵罐进行实验。按上述配方配制发酵培养基2.5L，调节初始pH为6.5，发酵过程控制温度35℃，150Lpm搅拌。按5％接种量接入植物乳杆菌L16种子液开始发酵，用20％ NaOH溶液调节pH，控制恒pH 6.0。发酵24h后进行连续补料(补料速度3.00ml/min)，补料体积500ml。发酵过程中每隔6h取样测定还原糖浓度、OD600及pH。
结果表明，发酵过程pH始终维持6.0左右，48h时糖消耗完全，发酵结束共消耗葡萄糖80g/L。最终OD600可达30，稀释平板法测得活菌数达到267×108CFU/ml。
300L中试发酵：植物乳杆菌L16菌种用MLS液体培养基活化后，转接到300ml液体培养基中，接种量1％，35℃静置培养24h。300L发酵培养基灭菌后冷却至35℃后接种上述种子液，100Lpm搅拌维持35℃，20％NaOH溶液调节维持pH 6.0±0.2，发酵24h后直接补加10kg葡萄糖粉末，发酵48小时下罐。稀释平板法测得最终活菌数255×108CFU/ml。
将上述菌液利用本领域的常规方式进行喷雾干燥后在20℃下恒温保存，干燥三个月存活率仍有30％以上。
实施例4：
鸡粪为基质生产乳酸菌培养物的方法，步骤如下：
1)称取新鲜的鸡粪作为基料，测出其含水量，计算出干鸡粪的质量。
2)调整鸡粪水分到50％，制得培养基基质。
3)按干鸡粪的质量添加1×107CFU/g的植物乳杆菌L16至步骤2)的培养基基质中，在37℃条件下恒温培养48h。
4)在50-55℃下烘干上述培养物料，粉碎至60目，检测有效活菌数量为植物乳杆菌40.8×108CFU/g。
实施例5：
鸡粪为基质生产乳酸菌培养物的方法，步骤如下：
1)称取新鲜的鸡粪作为基料，测出其含水量，计算出干鸡粪的质量。
2)按质量比为1：1的比例将干鸡粪和麸皮混合均匀成混合物，添加蒸馏水至含水量 55％，制得培养基基质；
3)按干鸡粪和麸皮的总质量添加1×107CFU/g植物乳杆菌L16至步骤2)的培养基基质中，在27℃条件下恒温培养48h。
4)在50-55℃下烘干上述培养物料，粉碎至60目，检测有效活菌数量为植物乳杆菌62×108CFU/g。
实施例6：
鸡粪为基质生产乳酸菌培养物的理化指标检测：
新鲜鸡粪理化指标检测结果如下表4所示，新鲜鸡粪病原微生物、亚硝酸盐等指标不符合饲料卫生标准。
表4新鲜鸡粪的理化指标
将实施例4中的乳酸菌培养物进行理化指标分析，结果如表5所示。鸡粪在发酵后臭味全部消失，质地松软，不成团，带有比较浓的酸香味。产品中植物乳杆菌菌数达到62亿/g，大肠杆菌不到1000CFU/g，其他致病菌未检出，说明鸡粪饲料在发酵过程中乳酸菌益生菌占据优势地位，抑制了其他有害微生物的生长繁殖。亚硝酸盐和真菌毒素的检测结果表明该乳酸菌培养物符合国家饲料卫生标准的要求，可以用作饲料原料或者饲料添加剂使用。
表5鸡粪为基质生产乳酸菌培养物的理化指标
实施例7：
将实施例4制得的鸡粪乳酸菌培养用于水产养殖：
地点在湖北省武汉市新洲区某水产养殖基地。
试验塘施用鸡粪乳酸菌培养物(20kg/亩·m水深)兑水全池泼洒，对照塘施用常规化肥 (1kg碳酸氢铵+0.5kg尿素+1kg过磷酸钙/亩·m水深)培养饵料生物。鱼苗下塘后,每隔 10d施1次肥。鱼塘试验设计与养殖模式见表6。池塘管理按常规进行,在鱼苗生长期间，每隔15d测定一次各塘的亚硝酸盐含量]以及水体中浮游生物的数量,连续测定了6次。养殖120天后收获,并测定各塘鱼产量。
表6鱼塘试验设计
从表7、表8中可以看出，在施肥前，水体中的浮游植物、浮游动物的生物量种类都差不多，浮游植物主要种类是蓝藻、绿藻和隐藻；施肥后，水体中浮游植物的生物量及优势种类发生了一系列的变化，两种不同的肥料都能使水体中浮游植物的生物量增加，试验塘的浮游植物总生物量从3105万个/L增加到6280个/L，浮游动物总生物量从1216万个/L增加到4260个/L，远高于对照组。另外还可看出,对照塘水体中浮游植物的优势种类没有发生变化,主要种类还是蓝藻、绿藻和隐藻；而试验塘水体中的隐藻所占的比例增加,占绝对优势,水体中的浮游植物的主要种类是隐藻、绿藻和蓝藻,有效地降低了蓝藻的比例。
表7乳酸菌培养物对水体浮游植物的影响
表8乳酸菌培养物对水体浮游动物的影响
养殖代谢产物的不完全硝化作用引起亚硝酸盐升高。通过养殖动物的呼吸作用，亚硝酸盐由鳃丝进入血液而导致养殖动物缺氧窒息。从表9可以分析出，试验塘降解水体亚硝酸盐的效果也相当显著，亚硝酸盐的浓度由0.045mg/L下降到0.010mg/L左右。与此相比，对照塘的亚硝酸盐含量由0.042mg/L升高到了0.052mg/L。试验塘与对照塘相比，差异显著。
表9乳酸菌培养物对水体亚硝酸盐的影响
从表10中可以看出，试验塘的鱼产量比使用化肥显著增加，特别是鳙鱼和草鱼，增长幅度分别达到62.0％和63.3％，显著提高了产量及单位池塘面积的利润率。
表10乳酸菌培养物对鱼产量的影响
