一种适用于油菜的生物有机肥料及应用
技术领域
本发明属于生物有机肥料领域，具体公开了一种适用于油菜的生物有机肥料及应用。
背景技术
作为现代农业生产中的重要物资投入品，肥料在保障作物丰产稳产及品质潜力发挥中起%20到了极为重要的不可替代的作用。我国油菜种植面积过亿亩，与世界其他油菜主要生产国相%20比，我国油菜种植整体立地条件较差，土壤有机质含量低、养分缺乏的种类多和程度高、土%20壤保肥能力差，导致土壤基础地力水平较低，加上我国大部分油菜作为冬季作物种植，气温%20低、土壤湿度过大与墒情不足并存等因素造成土壤养分供应能力下降。以上各种因素叠加在%20一起，导致目前我国油菜主产区平均基础地力仅能满足油菜丰产对养分需求的50％左右。%20目前，油菜的肥料通常使用传统的复合肥或者有机肥等，而传统的复合肥配方较为单一，不%20能充分满足油菜植株生长的需要，其实施效果不明显。而有机肥通常以畜禽粪便为主值得，%20若发酵不彻底则含有大量致病菌及虫卵、重金属等有害物质，直接施用会污染土壤。现在大%20多通过生物发酵技术来处理禽畜粪便，使禽畜粪便中的硫化氢、吲哚、胺等臭味成分迅速消%20解，还能使禽畜粪便中的纤维素、蛋白质等降解转化为对植物有益并可直接吸收的物质。而%20现有的有机肥生物发酵技术存在以下缺点：多采用畜禽粪便原料成分差异大，发酵周期长，%20杀灭有害细菌及虫卵不彻底，有机物质转换率低，除臭效果较差，可能有重金属或者药物残%20留具有一定的安全隐患。
为此，有必要研究一种能促进油菜植株生长的生物有机肥料，通过对植物性原料无害化%20处理，制成能促进油菜植株生长的、能改良土壤的、能提高油菜品质的、能提高产量的高效%20生物有机肥。油菜粕和油菜秸秆均来源于油菜作物，符合油菜作物生长的大部分养分需求，%20但是直接施用则有植物病原微生物感染作物的潜在安全风险。本发明以油菜粕和油菜秸秆作%20为有机肥发酵的主要原料，通过复合微生物高温堆肥进行腐熟和植物病原微生物的杀灭，生%20产适用于油菜生长需求的生物有机肥。
发明内容
本发明的目的是提供一种适用于油菜的生物有机肥，该有机肥利用油菜秸秆、白酒糟等%20废弃物，不含有害细菌及虫卵，无重金属等有毒有害物质的含量，可降低生产成本，改善油%20菜品质，提高产量。
本发明的另一个目的在于提供一种适用于油菜的生物有机肥的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种适用于油菜的生物有机肥，通过用复合微生物制剂对物料进行堆肥发酵，发酵结束%20后堆置陈化即得；
所述的物料中的组分以重量份计，包括：白酒糟粉45-55、油菜粕20-25、油菜秸秆粉%2015-25、复合微生物菌剂0.3-0.5、小龙虾壳粉5-8；
所述的符合微生物菌剂的有效活菌数为110-150亿CFU/g，包括：嗜热毁丝霉菌9-12%20亿CFU/g，枯草芽孢杆菌80-120亿CFU/g，哈茨木霉菌1-3亿CFU/g，凝结芽孢杆菌15-30亿CFU/g，多粘类芽孢杆菌1-3亿CFU/g、米曲霉菌1-3亿CFU/g、植物乳杆菌3-5亿CFU/g；
所述的嗜热毁丝霉为：Myceliophthora%20thermophila%20MT1810，保藏编号为：CCTCCNO：%20M2018705；
所述的米曲霉为：米曲霉(Aspergillus%20oryzae)A08，保藏编号为：CCTCC%20NO：M2019505；
所述的植物乳杆菌为：植物乳杆菌(Lactobacillus%20plantaLum)L16，保藏编号为：CCTCC%20NO：M2019502；
其余菌株为商品化菌株；
以上所述的生物有机肥，优选的，所述的物料中的组分以重量份计，包括：白酒糟粉%2050、油菜粕20、油菜秸秆粉24，复合微生物菌剂0.5、小龙虾壳粉5.5；
以上所述的生物有机肥，优选的，所述的物料中的组分以重量份计，包括：白酒糟粉%2055、油菜粕15、油菜秸秆粉23，复合微生物菌剂0.3、小龙虾壳粉6.7；
以上所述的生物有机肥，优选的，发酵温度升高到60℃以上后每天翻堆，每天1-2次；
以上所述的生物有机肥，优选的，物料的整体重量为发酵初期湿重的50％-60％，即发%20酵结束；
以上所述的生物有机肥，优选的，堆置陈化10-20天。
一种适用于油菜的生物有机肥的应用，包括用于制备成抗油菜菌核病的有机肥，或是直%20接制备成油菜有机肥。
与现有技术相比，本发明具有以下特点：
1.本肥料的主要原料是白酒糟、油菜秸秆、小龙虾壳等工农业废弃物，而在目前的有机%20生物肥中，通常采用畜禽粪便等原料。畜禽粪便通常含有致病微生物、蛔虫卵、重金属和药%20物残留等，具有一定的安全风险。本发明的生物有机肥主要采用植物基质原料，安全可控，%20无上述风险。
2.本制备方法中由于加入了小龙虾壳，在堆肥发酵过程中被微生物降解为壳聚糖。壳%20聚糖用于调节土壤养分，促进植物对N、C、P和矿物质元素的吸收，其还可以诱导植物产%20生抗病性，促进作物生长，改善作物品质。
3.本制备方法采用堆置发酵腐熟技术，利用复合微生物的代谢活动分解和转换物料中%20的有机质，使物料中的营养元素及有机质达到稳定和无害化；同时添加自主筛选的菌株，增%20加了肥料中的氨基酸含量，同时具有抑制油菜核盘菌的效果。
4.本生物有机肥能改良土壤，培肥地力，为农作物提供营养，还可促进土壤微生物的%20活动，特别适合于油菜植株的生长使用，从而增加油菜的产量和提高油菜的品质。
具体实施方式
根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但所述的实施例是为了更好的解释本发明，%20而不是对本发明的限制。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所%20述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
本发明实施例涉及到的菌株来源如下：
所述的嗜热毁丝霉为：Myceliophthora%20thermophila%20MT1810，保藏编号为：CCTCCNO：%20M2018705；
所述的米曲霉为：米曲霉(Aspergillus%20oryzae)A08，保藏编号为：CCTCC%20NO：M2019505；
所述的植物乳杆菌为：植物乳杆菌(lactobacillus%20plantaLum)L16，保藏编号为：CCTCC%20NO：M2019502；
所述的枯草芽孢杆菌为：Bacillus%20subtilis，来源于湖北华扬科技发展有限公司；
所述的哈茨木霉为：Trichoderma%20harzianum，来源于湖北中向生物工程有限公司；
所述的凝结芽孢杆菌为：Bacillus%20coagulans，来源于湖北华扬科技发展有限公司；
所述的多粘类芽孢杆菌为：Paenibacillus%20polymyxa，来源于武汉科诺生物科技有限公司；
使用的白酒糟粉为以高粱为原料采用浓香型白酒工艺生产白酒后的白酒糟粉。
实施例1：
米曲霉蛋白酶高产菌株的诱变筛选：
钴60诱变在湖北省农科院辐照中心进行。取新鲜的、孢子丰富的米曲霉菌株斜面，用%20适量的含0.1％吐温80的无菌水冲洗孢子，血球板、稀释涂平板计数，保证孢子数在107个%20/mL以上。各取5ml孢子悬液置于4个无菌三角瓶内，分别接受剂量为185Gy、395Gy、605Gy、%20815Gy的钴60伽马射线照射，对照不接受辐照。将各接受射线照射后的孢子液，涂布于酪%20蛋白培养基上，培养、计数并挑选透明圈大的菌落70-80株，保存至PDA斜面上。
将初筛保存的菌株分别用麸皮培养基培养，测定蛋白酶酶活，保存高酶活菌株；同时%20将将筛选出的高酶活菌株接种于以黄酒糟为主要基质的培养基中，进行酶活测定，选取酶活%20最高菌株进行下一轮诱变。
经过三轮钴60诱变，筛选到一株生长速度快，产酶能力强的米曲霉高产菌株，在麸皮%20固体培养基上以1％(m/m)接种量接种，在28℃下生长48h，蛋白酶酶活可达5150U/g(以干基计)。
该菌株于2019年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，分类命名：Aspergillus%20oryzae%20A08，保藏编号为CCTCC%20NO：M%202019505，地址：中国武汉武汉大学。
酪蛋白培养基：干酪素4g，MgSO4·7H2O%200.5g，Na2HPO4·7H2O%201.07g，KH2PO40.36g，%20琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH6.5-7.0，121℃灭菌30min。
PDA培养基：马铃薯(去皮)200g，蔗糖20g，水1000mL。将马铃薯去皮，切成小块，%20于锅中加水1000mL煮沸半小时，用双层纱布过滤，取其滤液加糖，并加水补足1000mL，%20琼脂20g，pH自然。121℃灭菌30min。
麸皮培养基：小麦麸皮1000g，水1000mL，pH自然。121℃灭菌30min。
实施例2：
植物乳杆菌L16菌株的筛选：
1.培养基的配制：
BCP培养基:蛋白胨5g；酵母膏3g；乳糖5g；琼脂20g；0.5％溴甲酚紫10ml；蒸馏%20水1000ml；pH值6.8～7.0。
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母提取物5g/L；牛肉浸粉10g/L；柠檬酸二铵2g/L；醋酸钠5g/L；吐温80%201g/L；K2HPO4%202g/L；MgSO4·7H2O%200.058g/L；MnSO4·4H2O%200.25g/L；蒸馏水1000ml；pH6.5-6.8。
PDA培养基：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂15～20g；蒸馏水1000ml；自然PH。
固体培养基在液体培养基的基础上添加1.5％的琼脂，所有培养基115℃灭菌20min。
2.初筛：取泡菜、果园根际土、菜地腐烂叶以及剁辣椒样品各5g置于300ml%20MLS液体培养基培养12h后，取1ml培养液梯度稀释，涂布于BCP平板，37℃培养48h后挑选其%20中典型乳酸菌菌落形态(菌落周边变黄)的菌落进行划线分离培养，每个样品挑选5个左右，%20将得到的单菌落转接到MLS液体培养基培养12h，MLS斜面保藏。
3.复筛：对初筛得到的20个菌株(编号L1-L20)进行平板复筛，分别针对番茄早疫病%20(病原菌：茄链格孢菌)、黄瓜炭疽病(病原菌：刺盘孢菌)以及黄瓜枯萎病(尖刀镰孢菌黄瓜专化型)三种常见植物病菌检测其抑菌性能，具体如下：
用直径0.6cm的打孔器在PDA平板上打取培养好的病原菌菌片,转接于另一个PDA平%20板中央,用挑针将活化的乳酸菌(编号L1-L20)分别对称接种在距病原菌菌落边缘3cm处,对%20照只接病原菌，之后26℃恒温培养。待对照长满平板时,测量病原菌的平均菌落直径和乳%20酸菌的平均抑菌带宽,计算抑菌率,以乳酸菌的平均抑菌率大小和平均抑菌带宽来衡量拮抗%20作用的强弱。
最终筛选出菌株L16对三种病原菌均表现最好的拮抗效果，对刺盘孢菌的平板抑制率为%2044.29％，对茄链格孢菌抑制率为40％，对尖刀镰孢菌黄瓜转化型抑制率为45.71％(表1)。%20菌株L16表现出较好的生防潜力，接下来以菌株L16为对象进行后续研究。
表1菌株L16对植物病原菌的抑制效果
菌株L16生化鉴定：用结晶紫对筛选出来的目的菌株L16进行简单染色，并通过光学显 微镜进行观察。发现该菌株为革兰氏阳性球菌，无芽胞，呈直或弯的杆状，单个、成对或成 链状。在MRS固体培养基上菌落为乳白色、表面光滑湿润、液滴状、圆形、隆起、边缘整齐，菌落直径约3mm。生理生化鉴定菌株L16兼性厌氧，不还原硝酸盐，不液化明胶，接 触酶和氧化酶皆阴性。能在葡萄酸盐中生长，并产CO2；利用葡萄糖同型乳酸发酵产L一乳 酸；发酵1分子的核糖或其他的戊糖生成1分子的乳酸和1分子的乙酸。最适生长温度为 35℃。
菌株的16s鉴定：挑取L16单菌落用通用引物进行扩增，对扩增产物进行16S LLNA测 序分析并构建系统进化树。结果表明该序列与Lactobacillus plantaLumsubsp.aLgentoLatens 和Lactobacillus plantaLum subsp.plantaLum的16S rDNA序列的相似性最高，达99％，可确定 该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌L16。该菌株已于2019年6月28日送至中国典型 培养物保藏中心保藏，分类命名：Lactobacillus plantaLumL16，保藏编号为：CCTCC NO： M2019502，地址：中国武汉武汉大学。
实施例3：
植物乳杆菌L16对油菜病原微生物的抑制效果：
用直径0.6cm的打孔器在PDA平板上打取培养好的油菜病原菌菌片,转接于另一个PDA 平板中央,用挑针将活化的植物乳杆菌L16对称接种在距病原菌菌落边缘3cm处,对照只接 病原菌，之后26℃恒温培养。待对照长满平板时,测量病原菌的平均菌落直径和乳酸菌的 平均抑菌带宽,计算抑菌率,以乳酸菌的平均抑菌率大小和平均抑菌带宽来衡量拮抗作用的 强弱。
菌株L16对油菜二种病原菌均表现良好拮抗效果，对油菜核盘菌的平板抑制率为37.14％， 对油菜链格孢菌抑制率为48.57％(表2)，菌株L16在油菜表现出较好的生防潜力。
表2植物乳杆菌L16对油菜病原菌的抑菌活性
实施例4：
一种适用于油菜的生物有机肥料，通过下述步骤获得：
白酒糟、油菜秸秆、小龙虾壳粉碎至2-3mm大小；
将500kg白酒糟粉、200kg油菜粕粉、240kg油菜秸秆粉、55kg小龙虾壳粉混合，调整水分到55％，接种5kg复合微生物菌剂混合均匀，发酵温度升高到60℃以上后每天翻堆， 每天1-2次，发酵周期21天，物料的整体重量为发酵初期湿重的55％。本实施例的环境温 度为20-35℃。
所述的复合微生物菌剂的总菌数为140亿CFU/g，包括：嗜热毁丝霉菌10亿CFU/g，枯草芽孢杆菌100亿CFU/g，哈茨木霉菌2亿CFU/g，凝结芽孢杆菌20亿CFU/g，多粘类 芽孢杆菌2亿CFU/g、米曲霉菌数为2亿CFU/g、植物乳杆菌4亿CFU/g。
发酵完成后堆置陈化20天后即可得到成品。
实施例5：
一种适用于油菜的生物有机肥料，通过下述步骤获得：
将550kg白酒糟粉、150kg油菜粕粉、230kg油菜秸秆粉、67kg小龙虾壳粉混合，调整水分到55％，接种3kg复合微生物菌剂混合均匀，发酵温度升高到60℃以上后每天翻堆， 每天1-2次，发酵周期28天，物料的整体重量为发酵初期湿重的60％。本实施例的环境温 度为5-20℃。
所用的复合微生物菌剂同实施例4；
发酵完成后堆置陈化20天后即可得到成品。
实施例6：
制得的有机肥的理化指标：
参照NY884-2012生物有机肥行业标准所规定的指标和方法，对实施例4和实施例5制 得的生物有机肥进行检测，结果如下表3所示，两个样品中的有效活菌数分别为12.7亿/g 和15.2亿/g，远高于行业标准0.20亿/g。其他技术指标也全部符合NY884-2012的要求。
表3生物有机肥检测结果
对实施例4制得的生物有机肥进行黄曲霉毒素和核盘菌检测，结果如下表4所示，有机肥 中的黄曲霉毒素B1被大幅降解，降解率为65％；而经过高温堆肥发酵后，有机肥中的核盘菌 孢子被全部杀灭，发酵后检测不到。该生物有机肥可以安全用于油菜作物施肥。
表4生物有机肥中真菌毒素与核盘菌检测结果
实施例7：
将实施例4制得的生物有机肥用于油菜种植试验，以验证生物有机肥对油菜生长和病害 防治的作用。
试验共设两个处理：(1)空白对照，亩施尿素(H2NCONH2)25kg，磷酸一铵(NH4H2PO4)9kg，氯化钾(KCl)10kg，硼(Na2B4O7·10H2O)0.4kg；(2)生物有机肥组，亩施尿素(H2NCONH2)25kg，磷酸一铵(NH4H2PO4)9kg，氯化钾(KCl)10kg，硼(Na2B4O7·10H2O)0.4kg，生 物有机肥50kg。试验按随机区组排列，三次重复，每个小区面积20m2。试验油菜品种为中 油杂5号，油菜种植密度20000株/亩，每个小区600株，试验在华中农业大学校内试验田 完成。
试验结果如表5所示，生物有机肥处理组比空白对照组相比，油菜成熟期菌核病发病率 降低36.7％，病情指数下降53.2％，产量提高12.2％。
表5生物有机肥对油菜菌核病和产量的影响
本发明中，植物乳杆菌L16对油菜菌核病菌(核盘菌Sclerotinia sclerotiorum)有良好的 拮抗和抑制作用，能有效降低菌核病的发病率。同时米曲霉A08具有高蛋白酶活性，可很 好的将白酒糟和菜粕中的粗蛋白进行分解，提高发酵产物中的氨基酸含量。
同时，微生物在发酵过程中能产生大量的热量，从而能使发酵基质混合物中的水分挥发 出去，达到脱水的效果，所产生的热量能有效彻底杀灭有害细菌及虫卵。凝结芽孢杆菌和植 物乳杆菌L16能产生乳酸，使小龙虾壳中的甲壳素脱去乙酰分子基团变成壳聚糖。壳聚糖 对植物病原菌的孢子萌发和菌丝生长均有阻碍作用，对植物对病原菌感染的防护机能有诱导 作用，并能促进植物生长。
