一种具有解磷特性的中间根瘤菌属菌株及其应用
技术领域
本发明属于农用微生物技术领域，具体涉及一种中间根瘤菌菌株YTM-3及其在解磷方面的应用。
背景技术
磷素是植物必须的第二大无机营养元素，参与植物体内许多重要的酶促反应及代谢调节。因此磷素对植物的生长代谢具有重要意义。东南丘陵区红壤主要分布于亚热带和热带地区，包括湘、赣、浙、闽、桂、粤、琼及鄂、苏、皖南部，面积约113万km2，占全国土地总面积的11.8％。红壤中磷以各种化学形式存在，其中无机磷占总磷的35％-70％，有机磷占总磷的30％-65％。然而红壤中的磷素容易被金属离子Al3+、Fe3+和Ca2+等吸附结合固定，导致磷的溶解性和移动性下降，使红壤呈现磷素有效磷严重缺乏的状态，降低了磷肥利用率。长期以来，大量施用磷肥已成为缓解土红壤磷素胁迫、实现作物高产稳产的重要措施之一。有估测指出，按现有的磷肥生产能力，不可再生的磷矿石资源在60～90年内将枯竭。因此，提高红壤磷素和磷肥利用率，挖掘磷肥资源潜能对我国农业的可持续发展具有重要意义。
解磷菌通过自身分泌的有机酸和磷酸酶等代谢产物，能使红壤中难溶性或不溶性的磷转化成易于被植物吸收利用的有效态磷，从而提高土壤供磷水平，增加作物吸磷量，提高作物产量；同时还能促进农作物对植物根系锌、铜等其它营养元素的吸收，增强植物抗病能力，并减少环境污染，因此利用解磷菌制成的菌剂具有重大开发应用价值。解磷菌的筛选主要集中于盐碱地区域，然而红壤酸性和瘠薄的特性会严重限制解磷菌功能的发挥，即使在当地施用效果良好的菌株，当添加到酸性红壤中，其效果显著下降。分离筛选适合旱地红壤应用的高效土著解磷菌，并对其培养条件进行优化，制成菌剂与有机肥配施于有效磷含量较低的酸性旱地红壤，以期发挥其高效解磷作用、提高红壤农田磷肥利用效率、部分代替无机磷肥并促进玉米增产。
目前我国已研发出适用于某些土壤和作物的解磷菌菌肥，并在一些地区的瓜果、蔬菜、花生、中药材、小麦等作物生产中得到应用，但是适用于酸性红壤和促进玉米增产的解磷菌的研发报道还比较少见。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有解磷特性的中间根瘤菌属菌株，以提高红壤磷素的活化与供应能力，促进玉米植株生长和产量。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种具有解磷能力的中间根瘤菌属菌株，该菌株为中间根瘤菌属(Mesorhizobium.sp)菌株YTR-M3，已于2019年4月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.17532。
所述中间根瘤菌属菌株YTR-M3分离于中国科学院鹰潭红壤生态实验站有机培肥长期定位试验小区玉米根际土壤，经土壤悬液的稀释、LB培养基的接种培养分离纯化后获得一株中间根瘤菌(Mesorhizobium amorphae)，命名为YTR-M3，其在Genbank的基因登录号为MK138663。
该菌株的生物学性质分别如下：
(1)形态学特征：在LB培养基上形成明显的圆形、乳白色菌落，边缘整齐，凸状，不透明，表面光滑湿润，革兰氏染色呈阴性，电镜观察下细胞形状呈杆状。
(2)培养特征：生长温度范围为22℃～28℃，最适pH为7.0，需氧或兼性厌氧，生长于LB培养基中。培养基成分：Tryptone 10.0g/L，Yeast extract 5.0g/L，NaCl 10.0g/L。
本发明的第二个目的是提供一种含有中间根瘤菌属(Mesorhizobium.sp)菌株YTR-M3的微生物菌剂。
本发明的第三个目的是提供上述中间根瘤菌属(Mesorhizobium.sp)菌株YTR-M3的应用，该菌株具有高效的解磷特性，能够分解无机磷和有机磷，例如磷酸铝、磷酸铁、卵磷脂，能够显著增加红壤有效磷含量。
优选的，中间根瘤菌属菌株YTR-M3能够用于改善玉米生长状况，将中间根瘤菌属菌株YTR-M3菌液回接到红壤改善玉米的生长状况，能够增加玉米地上部和地下部生物量、提高玉米叶片可溶性糖以及可溶性蛋白含量，增加红壤有效磷含量。
优选的，所述中间根瘤菌属菌株YTR-M3与木醋液配施，以改善玉米的生长状况。
有益效果：本发明从中国科学院鹰潭红壤生态实验站有机培肥长期定位试验小区土壤筛选出一株高效解磷菌，对其进行了鉴定，并通过实验证明YTR-M3具有高效的解磷特性，与木醋液混合使用，显著增加了红壤有效磷含量，改善玉米的生长状况。
附图说明
图1为本发明分离的中间根瘤菌菌株YTR-M3在固体培养基上的菌落特征图和电镜图；
图2为菌株YTR-M3的解磷圈图片；
图3为菌株YTR-M3系统发育树的构建图；
图4a-图4d分别为接种中间根瘤菌YTR-M3盆栽玉米的可溶性糖、可溶性蛋白、盆栽土壤有效磷含量以及玉米地上部地下部生物量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做更进一步的解释。
根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
中间根瘤菌属(Mesorhizobium.sp)菌株YTR-M3的筛选与鉴定
1、筛选过程
(1)称取1g取自江西鹰潭红壤试验站长期定位试验地的高肥处理的根际土壤放入离心管中，加入9mL 0.9％的生理盐水制成10-1的菌悬液，放入180r/min的震荡箱中震荡10min，取出后静置1h。
(2)将静置好的土壤悬液在无菌条件下吸取5μL加45μL无菌水稀释到制成10-2菌悬液。依次将菌悬液稀释成10-3、10-4、10-5，分别取5mL 10-5的菌悬液加入50mL和500mL的LB培养基中制成10-6和10-7的培养液，将10-6和10-7的培养液加入96孔板中，每个孔中加入250μL，每个浓度分别加三块板。最后将96孔板放入酶标仪中，室温培养下观察其生长状况。
(3)将板中生长出菌液的孔径中的液体取200μL至保藏管中，加200μL甘油保存，并标上其对应的孔板和孔序号，剩下的50μL用来做菌落PCR扩增。PCR扩增条件：94℃预变性10min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，变性退火延伸共35个循环，72℃延伸10min，终止反应。经测序后所得有效序列于NCBI上进行比对后，结果显示与中间根瘤菌同源性最高。
中间根瘤菌属(Mesorhizobium.sp)菌株YTR-M3的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
中间根瘤菌属(Mesorhizobium.sp)菌株YTR-M3的解磷特性
(1)将菌株YTR-M3保存于甘油管中，经活化后在LB固体培养基上划线保存备用。
(2)配制蒙金娜有机磷(卵磷脂)、磷酸铝、磷酸铁培养基平板，每个平板划分6个区域，依次吸取6μL点在每个区域的中心，在转速180r/min下25℃培养4天，观察记录解磷圈直径(单位D/cm)、菌落直径(单位d/cm)，计算D/d比值，以此确定菌株对不同难溶性磷的解磷能力与解磷效率。培养基配方如下：①蒙金娜有机磷(卵磷脂)细菌培养基(1L)葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，KCl0.3g，CaCO3 1.0g，卵磷脂0.3g，琼脂20g，pH 7.0。②蒙金娜无机磷(磷酸铝)细菌培养基(1L)葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4·H2O0.03g，KCl 0.3g，CaCO3 1.0g，AlPO4 3.93g，琼脂20g，pH 7.0。3○蒙金娜无机磷(磷酸铁)细菌培养基(1L)葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl 0.3g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4 0.03g，MnSO4·H2O 0.03g，KCl 0.3g，CaCO3 1.0g，FePO4 4.86g，琼脂20g，pH 7.0。解磷圈结果见图3。菌株对溶性磷的溶解能力见表1；
表1:中间根瘤菌菌株YTR-M3溶磷特性分析
中间根瘤菌(Mesorhizobium.sp)菌株YTR-M3在三种供试的难溶性磷培养基上均长势良好，菌株YTR-M3不仅能分解无机磷也能分解有机磷，在固体培养基上菌落直径大小依次为：磷酸铁>磷酸铝>卵磷脂。由此可知菌株对Fe-P的溶解性较强。而红壤中大量存在的为Fe-P，因此该菌株在解决红壤磷缺乏方面具有很大的应用价值。
实施例3
玉米盆栽实验
1、实验共设置3个处理，分别为对照、木醋液(含氨基酸的木醋液复合水溶肥)、木醋液+菌剂(YTR-M3)、每种处理4个重复。
2、土、肥用量：每个10×10(cm)的盆里大约土用量为500g，施加木醋液的处理每个盆加15mL木醋液(1:800稀释)作为底肥。之后每隔一周以根部滴灌和叶面喷施的方式施加一次。
3、育苗：1)种子消毒，选取适量种子，首先用70％的酒精消毒1min，再用1％的次氯酸钠消毒15min，最后用无菌水冲洗五次。将消毒好的种子放在无菌水上，置于28℃的光照培养箱中待其发芽；2)在种子发芽的第五天选取长势一致的幼苗移栽到红壤中。
4、加菌液：玉米苗移栽后的第二个星期施加菌液，在LB培养基中分别摇瓶培养YTR-M3菌液100mL，培养18h后分别测三瓶发酵液的OD600值，当OD600值达到1的时候，菌液的浓度大约为1×109CFU，按照每克土100μL的量，将菌液进行离心，用0.9％的生理盐水洗涤沉淀3次，最后用无菌水将菌体悬浮制成菌剂，加到土壤中。
5、玉米在土壤中生长一个月左右将其收获，分别测定每个处理玉米苗的地上部地下部生物量、叶片中的可溶性糖、可溶性蛋白以及玉米收获期的土壤有效磷含量。其结果见图4。
由本实验可知，与对照组相比，添加木醋液+中间根瘤菌(Mesorhizobium.sp)菌株YTR-M3的处理显著增加了玉米叶片中可溶性糖、可溶性蛋白的含量及地上部地下部的生物量，明显改善了玉米的生长状况。加菌剂的盆栽土壤有效磷含量显著高于对照组，分别是对照组以及只施加木醋液的4.5倍和2.5倍，说明菌株YTR-M3可有效提高土壤有效磷的含量。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南京土壤研究所
<120> 一种具有解磷特性的中间根瘤菌属菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1341
<212> DNA
<213> 中间根瘤菌(Mesorhizobium. sp)
<400> 1
tgcctccttg cggttagcgc agcgccttcg ggtaaagcca actcccatgg tgtgacgggc 60
ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga 120
ttccaacttc atgcactcga gttgcagagt gcaatccgaa ctgagatggc ttttggagat 180
tagctcgacc tcgcggtctc gctgcccact gtcaccacca ttgtagcacg tgtgtagccc 240
agcccgtaag ggccatgagg acttgacgtc atccccacct tcctctcggc ttatcaccgg 300
cagtcccctt agagtgccca actgaatgat ggcaactaag ggcgagggtt gcgctcgttg 360
cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca gccatgcagc acctgtcacc 420
ggtccagccg aactgaagga taccatctct ggtaaccgcg accgggatgt caagggctgg 480
taaggttctg cgcgttgctt cgaattaaac cacatgctcc accgcttgtg cgggcccccg 540
tcaattcctt tgagttttaa tcttgcgacc gtactcccca ggcgggaagc ttaatgcgtt 600
agctgcgcca ccgacaagta aacttgccaa cggctagctt ccatcgttta cggcgtggac 660
taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc acctcagcgt cagtaccgga 720
ccagtgagcc gccttcgcca ctggtgttcc tccgaatatc tacgaatttc acctctacac 780
tcggaattcc actcacctct tccggactct agactaccag tatcaaaggc agttccgggg 840
ttgagccccg ggatttcacc cctgacttaa tagtccgcct acgtgcgctt tacgcccagt 900
aattccgaac aacgctagcc cccttcgtat taccgcggct gctggcacga agttagccgg 960
ggcttcttct ccggttaccg tcattatctt caccggtgaa agagctttac aaccctaggg 1020
ccttcatcac tcacgcggca tggctggatc aggcttgcgc ccattgtcca atattcccca 1080
ctgctgcctc ccgtaggagt ctgggccgtg tctcagtccc agtgtggctg atcatcctct 1140
cagaccagct atggatcgtc gccttggtag gccattaccc caccaactag ctaatccaac 1200
gcgggctcat ccatctccga taaatctttc tccattagga cgtatacggt attagtccaa 1260
gtttccctgg gttattccgt agagatgggt agattcccac gcgttactca cccgtctgcc 1320
gctccccttg cggggcgctc g 1341
