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一种解淀粉芽孢杆菌及采用该菌制备γ-聚谷氨酸肥料增效剂的方法

2021-03-12 09:17:00

一种解淀粉芽孢杆菌及采用该菌制备γ-聚谷氨酸肥料增效剂的方法

　　技术领域

　　本发明涉及一株芽孢杆菌，具体涉及一种解淀粉芽孢杆菌，本发明还包括了该芽孢杆菌的在制备肥料增效剂方面的用途，以及采用该菌制备γ-聚谷氨酸肥料增效剂的方法。

　　背景技术

　　我国是化肥使用大国，但是肥料利用率普遍较低，据统计，当季氮肥利用率约为30～35％，磷肥当季利用率约为10～25％，钾肥利用率约为40～50％，这种利用率和世界发达国家水平相比还有差距。大量肥料的流失，不仅造成巨大的经济损失，而且还会造成严重的环境污染。具体地，过量使用化肥对环境的污染主要集中在对土壤、水体和大气等方面。以其对土壤的危害为例，单独大量长期地施用化肥，将导致土壤结构变差、容重增加、孔隙度减少；并且，施用化肥可能使土壤有机质上升速度减缓甚至下降，部分养分含量相对较低或养分间不平衡，不利于土壤肥力的发展；再者，单独施用化肥将导致土壤中有益微生物数量甚至微生物总量减少；最后，由于部分化肥中含有污染成分，过量施用(其中特别是磷肥)将对土壤产生相应的污染。目前我国大部分耕地质量退化，对化肥的依赖性愈来愈强，主要是由于大量施用化肥的后果。

　　同时，我国也是水资源相对较短缺的国家之一，这一直也是困扰我国农业发展的主要因素。尤其是近年来，干旱灾害频繁发生，研究表明，干旱胁迫是植物经常遭受的逆境胁迫之一。另据统计，每年由于干旱胁迫给生态建设工程造成的损失相当于其他所有环境因子胁迫所造成损失的总和。为了应对这种情况，目前也有厂家研制各种抗旱保水剂。其基本原理是通过具有三维网状结构的有机高分子聚合物，反复吸水，在土壤中能将雨水或浇灌水迅速吸收储存，进而减少水分流失。天旱时再缓慢释放供植物利用。常见的保水剂在吸水、贮水、放水性能上能达到一定的抗旱保墒作用。但这一类保水剂在大规模使用上仍然存在缺陷，例如聚丙烯酰胺类土壤保水剂，会显著增加农业生产成本，且其在常年使用过程中，对环境是否会造成不可逆影响，仍有待验证。再者，单一的保水功能并不能对实际生产种植起到决定性的作用。

　　聚谷氨酸是以谷氨酸为基础原料，并结合有机碳源、氮源及矿物质，利用微生物酦酵生化合成的生物高分子聚合物，是仅有的可由微生物合成的四种高分子均聚氨基酸之一。其中γ-聚谷氨酸(γ-PGA)更是具有诸多优良的理化性质，例如：1)超强保水性能，每分子聚谷氨酸(γ-PGA)含有1000个以上的—COOH官能集团；2)γ-PGA携带的负电游离羧基，与养分离子吸附交换的能力是自然土壤的100倍左右并且能有效阻止化肥中硫酸根、磷酸根、草酸根等与钙、镁等微量元素的结合；3)聚谷氨酸(γ-PGA)是谷氨酸的聚合物,具有酸、碱两性的性能，对酸、碱具有绝佳缓冲能力；4)聚谷氨酸(γ-PGA)，对土壤中微量元素有极佳的螯合吸附能力。而通过化学合成的聚天冬氨酸等其他类型肥料增效剂，分子量较小，增效的功能则受到一定限制。因此，也有厂商根据γ-PGA的这一特性研制出众多类型的肥料增效剂。应该说，相比较于传统的单纯的肥料增效剂或者单纯的土壤保水剂而言，聚谷氨酸(γ-PGA)不仅具有减缓肥料流失、抗旱保水、抗病增产等多重功效，而且具有生产成本低、性能优越、使用方便等有益效果。这是其他类型肥料增效剂所不可比拟的优势。

　　目前γ-PGA的制备主要是生物发酵法，即通过培养生产聚谷氨酸的菌种得到产品。目前国内外用于研究γ-聚谷氨酸的典型菌株主要是BacilluslicheniformisATCC9945a和Bacillus%20subtilis%20IFO3335等，发酵生产工艺通常有液体发酵和固体发酵两种。而这两种常见工艺中，又以液体深层发酵为主。但是这一工艺仍然存在生产周期过长，生产效率低下且成本较高的问题。例如，在李培培等提出的发明创造(中国专利申请公开号CN104017760A)中，具体提到利用一株地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis%20Dou-6用于进行液体发酵的工艺，其底物谷氨酸转化率仅为60％。相比较于液体发酵而言，固体发酵拥有能耗低、设备简易、成本低、产生废弃物少以及原料来源广泛等优势的特点，故常用语有机肥、饲料、酿酒等微生物发酵工业生产当中。另一方面，规模化养殖产生畜禽粪便以及农业种植产生的秸秆等农业废弃物随地弃置，不仅引起了严重的面源污染，也极大浪费了大量的养分资源(C、N、P、K、S及微量元素)。目前，以农业废弃物固态发酵生产γ-聚谷氨酸有机肥的研究也有陆续报道，如CN102674986公开了一种具有保水保肥作用的生物有机肥及其制备方法，该方法是利用单一芽孢杆菌菌株以人畜粪便、生活垃圾或植物秸秆中进行γ-聚谷氨酸有机肥生产。CN10147894公开的一种含有γ-聚谷氨酸的肥料添加剂的生产方法，该方法用单一枯草芽孢杆菌(Bacillus%20subtilis)PGA-7CCTCCM206102为发酵菌株，以氨基酸发酵废液、豆粕、花生饼粉、麸皮、稻草粉等为主要发酵基料进行固体发酵生产含γ-聚谷氨酸的肥料添加剂。

　　再例如，中国专利申请第200710130248号公开了枯草芽孢杆菌CGMCCNo.2108及利用其来制备γ-聚谷氨酸的方法，最高产量可达34.1g/L。其中虽然未涉及γ-聚谷氨酸肥料增效剂的进一步披露，但显然地，对于以γ-聚谷氨酸为主要成分的肥料增效剂来说，这样的产率非常不利于工业化生产，且不能重复利用。

　　而对于以γ-聚谷氨酸为主要原料的肥料增效剂来说，目前已经公开的组分配比，也存在诸多的不合理。例如，中国专利CN105010840B中公开了一种植物生长调节组合物，由脱落酸和聚氨基酸组成；所述聚氨基酸为聚天冬氨酸、聚天冬氨酸的盐、聚谷氨酸和聚谷氨酸的盐中的一种或几种；所述脱落酸与所述聚氨基酸的质量比为1:(80～500)。虽然在该专利公开的组合物中，含有聚谷氨酸或聚天冬氨酸之类的成分，但其仍然只能起到土壤保水剂的作用，并不能对肥料起到缓释增效的目的，也即，对于减少化肥使用，对环境改善和增产增值并没有帮助。

　　综上所述，γ-聚谷氨酸有机肥生产大都停留在以γ-聚谷氨酸单菌株发酵为主，且γ-聚谷氨酸的产率较低，因此亟需开发一种γ-聚谷氨酸的高产率的新菌株和利用此菌株高产率生产γ-聚谷氨酸的方法。并且进一步地，针对γ-聚谷氨酸类肥料增效剂的开发，也亟待技术突破。

　　发明内容

　　鉴于现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一株高产γ-聚谷氨酸菌，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus%20amyloliquefaciens)JX8-2，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC%20No.14775，保藏日期为：2017年10月9日。

　　该菌株能够在较低底物浓度下单独发酵高产γ-聚谷氨酸。

　　菌株性状：本菌株在显微镜下观察：菌落呈短杆状，0.3～2.2*1.2～7.0um，多数运动，革兰氏染色阳性；液体发酵24h后有芽孢出现，芽孢端生，椭圆形，不明显膨胀。培养基上形成白色不透明菌落，表面粗糙，菌落边缘不规则。菌株为兼性厌氧型。

　　本发明还提供了该菌株JX8-2在制备γ-聚谷氨酸肥料增效剂中的用途。

　　本发明的另一目的是提供一种利用γ-聚谷氨酸产生菌JX8-2与一株胶冻样类芽孢杆菌制作肥料增效剂的方法，其中胶冻样类芽孢杆菌20666购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心；

　　该方法包括：

　　S1、菌种活化：将4℃斜面保存的解淀粉芽孢杆菌JX8-2和胶冻样类芽孢杆菌分别接入灭菌处理的牛肉膏蛋白胨固体培养基中和固氮培养基(CM0003)中活化；

　　S2、摇瓶培养：将活化好的解淀粉芽孢杆菌JX8-2和胶冻样类芽孢杆菌分别接入灭菌处理的牛肉膏蛋白胨液体培养基中和固氮培养基(CM0003)中，摇床振荡培养，(解淀粉芽孢杆菌JX8-2培养条件：温度35～37℃，转速200r/min，时间24h；胶冻样类芽孢杆菌的培养条件：温度30℃，转速250r/min，时间32h)，至各菌种培养液中菌种有效活菌数分别为1～2×108个/mL；

　　S3、种子液制备：将步骤S2得到的摇瓶种子液按照5％的接种量分别接入牛肉膏蛋白胨液体培养基和固氮培养基(CM0003)中进行种子罐发酵培养(解淀粉芽孢杆菌JX8-2培养条件：温度35～37℃，转速200r/min，时间24h；胶冻样类芽孢杆菌的培养条件：温度30～32℃，转速250r/min，时间32h)，至各菌种培养液中菌种有效活菌数分别为1～2×108个/mL；

　　S4、发酵罐发酵：将步骤S3得到的种子液分别移入产聚谷氨酸液体发酵灭菌培养基和固氮培养基(CM0003)中，在发酵罐中进行发酵在(解淀粉芽孢杆菌JX8-2培养条件：温度35～37℃，转速200r/min，时间48～72h；胶冻样类芽孢杆菌的培养条件：温度30～32℃，转速250r/min，时间32～48h)，至各菌种培养液中菌种有效活菌数分别为1～2×108个/mL；

　　S5、将解淀粉芽孢杆菌JX8-2发酵得到的含聚谷氨酸发酵液与胶冻样类芽孢杆菌发酵液按体积比1:1混合，得到混合发酵液。

　　S6、将S5中混合菌液与活性腐殖酸粉按3:7的比例进行吸附、搅拌、风干，得到富含菌群及γ-聚谷氨酸的混合物。

　　S7、向S6所得到的混合物中，添加复合氨基酸、氮、磷及钾中的一种或多种、微量元素、生长因子等物质，再进行混合、干燥，所得即为聚谷氨酸肥料增效剂。

　　本发明的另一目的是提供一种γ-聚谷氨酸肥料增效剂，其中，每1000g该肥料增效剂中各组分含量比例为：

　　在一些实施方式中，其中牛肉膏蛋白胨培养基的pH为7.0～7.4，其构成组分至少包含：牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、NaCl、琼脂或水中的一种或多种。

　　在一些实施方式中，其中产聚谷氨酸液体发酵培养基的pH为7.2～7.5，其构成组分为：柠檬酸15g，葡萄糖5g，(NH4)2SO4 5.0g，谷氨酸钠8g，丙三醇60g，K2HPO4 1.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·2H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.1g，蒸馏水1000ml。

　　在一些实施方式中，其中微量元素包括锰、钙、锌、铜、钼或硼中的一种或多种。

　　在一些实施方式中，其中复合氨基酸包括:丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸中的一种或多种的混合物或其聚合物。

　　相比较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明使用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JX8-2可以单独高效率生产γ-聚谷氨酸，且发酵培养过程粗放，可以使用多种不同的碳源及氮源。另外，由本发明的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)JX8-2生产的γ-聚谷氨酸能够鳌合氮磷钾及多种微量元素，复配成肥料增效剂，促进作物对氮磷钾的吸收，提高农作物对于水分和肥料的利用率，减少水分和养分的流失；同时能缓释养分，减少施肥量，提高肥料的利用率，增加产量及提升产品质量；形成有益微生物菌群，有效抑制土壤中致病微生物的繁殖，显著减少多种土传病害的发生。

　　具体实施方式

　　下面，以下结合对本发明的技术方案做进一步详细的说明。

　　实施例1

　　一种制备γ-聚谷氨酸肥料增效剂的方法

　　1、γ-聚谷氨酸产生菌JX8-2的选育

　　称取10g含有目标菌株的土壤样品，加入装有90ml无菌水的三角瓶中，震荡摇匀，将所得悬浮液按10-1，10-2，10-3，10-4，10-5浓度梯度依次稀释，然后分别从各个浓度的稀释液中取0.1ml，涂布于琼脂培养基中，置于35℃恒温培养箱中培养24～28h。挑选生长良好的菌落反复划线培养三次以上，经纯化后得到该菌株。其中培养基成分为：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，NaCl 5g，琼脂20g，PH7.0，补水至1000ml。

　　2、将牛肉膏蛋白胨固体培养基和固氮培养基(CM0003)进行灭菌处理后备用。牛肉膏蛋白胨固体培养基组分为：牛肉膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，NaCl5g，琼脂20g，补水至1000ml，PH7.0～7.4；固氮培养基(CM0003)组分为：酵母提取物0.5g，甘露醇20.0g，KH2PO40.2g，K2HPO4 0.8g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4·2H2O 0.1g，FeCl3微量，Na2MoO4·2H2O微量，琼脂20.0g，补水至1000ml，PH7.2。

　　3、菌种活化：将4℃斜面保存的解淀粉芽孢杆菌JX8-2和胶冻样类芽孢杆菌分别接入灭菌处理的牛肉膏蛋白胨固体培养基中和固氮培养基(CM0003)中活化。

　　4、摇瓶培养：将活化好的解淀粉芽孢杆菌JX8-2和胶冻样类芽孢杆菌分别接入灭菌处理的牛肉膏蛋白胨液体培养基中和液体固氮培养基(CM0003)中，摇床振荡培养，(解淀粉芽孢杆菌JX8-2培养条件：温度35～37℃，转速200r/min，时间24h；胶冻样类芽孢杆菌的培养条件：温度30℃，转速250r/min，时间32h)，至各菌种培养液中菌种有效活菌数分别大于1～2×108个/mL。

　　5、种子液制备：将步骤4得到的摇瓶种子液按照5％的接种量分别接入牛肉膏蛋白胨液体培养基和固氮培养基(CM0003)中进行种子罐发酵培养(解淀粉芽孢杆菌JX8-2培养条件：温度35～37℃，转速200r/min，时间24h；胶冻样类芽孢杆菌的培养条件：温度30～32℃，转速250r/min，时间32h)，至各菌种培养液中菌种有效活菌数分别大于1～2×108个/mL；

　　6、产γ-聚谷氨酸液体发酵培养基在发酵罐中灭菌后备用。产γ-聚谷氨酸液体发酵培养基组分为：柠檬酸15g，葡萄糖5g，(NH4)2SO4 5.0g，谷氨酸钠8g，丙三醇60g，K2HPO41.0g，FeSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·2H2O 0.2g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.1g，PH7.2～7.5。

　　7、发酵罐发酵：将步骤5得到的种子液分别移入产γ-聚谷氨酸液体发酵灭菌培养基和固氮培养基(CM0003)中，在发酵罐中进行发酵(解淀粉芽孢杆菌JX8-2培养条件：温度35～37℃，转速200r/min，时间48～72h；胶冻样类芽孢杆菌的培养条件：温度30～32℃，转速250r/min，时间32～48h)，至各菌种培养液中菌种有效活菌数分别大于1～2×108个/mL时，可停止发酵。

　　8、菌液复配：将解淀粉芽孢杆菌JX8-2发酵得到的含γ-聚谷氨酸发酵液与胶冻样类芽孢杆菌发酵液按体积比1:1混合，得到混合菌液。

　　9、将步骤8中的混合菌液与活性腐殖酸粉按3:7的比例进行吸附、搅拌、风干，得到富含菌群及γ-聚谷氨酸的混合物。

　　10、制备γ-聚谷氨酸肥料增效剂：向步骤9所得到的混合物中，添加复合氨基酸、氮、磷及钾中的一种或多种、微量元素、生长因子等物质，再进行混合、干燥，所得即为聚谷氨酸肥料增效剂。

　　(1)一种γ-聚谷氨酸肥料增效剂，每1000g中各组分含量比例为：

　　(2)微量元素包括锰、钙、锌、铜、钼或硼中的一种或多种。

　　(3)复合氨基酸包括:丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸中的一种或多种的混合物或其聚合物。

　　实施例2

　　γ-聚谷氨酸肥料增效剂在小白菜种植上的田间应用试验。

　　1、试验时间：2017年5月5日～2017年6月10日；

　　2、试验地点：陕西省杨陵示范区杨凌职业技术学院试验基地；

　　3、试验作物：小白菜；

　　4、试验方法

　　试验共设3个处理,随机区组排列,重复3次,小区面积60m2。

　　试验组1：常规施肥；

　　试验组2：60％常规施肥+细沙；

　　试验组3：60％常规施肥+γ-聚谷氨酸肥料增效剂(每亩用量2kg)；

　　试验是在当地常规施肥的基础上进行。常规施肥为:苗移栽前亩施45％有机-无机复混肥(15-15-15)25Kg。试验田于5月5日苗移栽前，按试验方案将γ-聚谷氨酸肥料增效剂、细沙、常规肥料等撒施，旋耕，犁透耙平。于6月10日收获完成。分小区记载实际产量并同时进行田间调查。试验除按方案要求的操作外,其它管理措施同一般番茄田间生产。

　　5、结果与分析

　　5.1γ-聚谷氨酸肥料增效剂的保水性能分析

　　(1)测量施用“γ-聚谷氨酸肥料增效剂”10、20、30天后，0～10cm土壤含水量(％)。(以下数据均为平均值)

　　表1土壤含水量情况对比

　　由表1可看出，γ-聚谷氨酸肥料增效剂可有效提高土壤含水量60％左右，可起到保水保肥的作用。

　　5.2γ-聚谷氨酸肥料增效剂的节肥效用分析

　　在小白菜生长到30天左右时，收取果实，测定并记录每组试验的生长情况。

　　表2小白菜产量及外观情况

　　由表2的数据可以看出，γ-聚谷氨酸肥料增效剂可以显著提高果实产量，在减少40％常规肥施肥量后，产量并未减少，并且稍多于常规施肥组，因此可得出γ-聚谷氨酸肥料增效剂具有提高肥料利用率，增强肥效，节省肥料的功能，可提高肥效30％～40％；并且可增强果实质量，提升口感，减少病虫害的影响。

　　实施例3

　　γ-聚谷氨酸肥料增效剂在番茄种植上的田间应用试验

　　1、试验时间：2017年5月25日～2017年9月5日；

　　2、试验地点：陕西省杨凌示范区西北农林科技大学试验基地(该田块土壤类型为潮土,质地为灌於土,肥力中上等,肥力均匀)；

　　3、试验作物：番茄；

　　4、试验方法

　　试验共设3个处理,随机区组排列,重复3次,小区面积30m2。

　　处理1:常规施肥+亩用γ-聚谷氨酸肥料增效剂4kg拌干细土20kg于苗移栽后撒施；；

　　处理2:常规施肥+亩用细沙4kg拌干细土20kg于苗移栽后撒施；

　　处理3:常规施肥。

　　试验是在当地常规施肥的基础上进行。常规施肥为:苗移栽前亩施45％有机-无机复混肥(15-15-15)25Kg。试验田于5月25日苗移栽后10天，按试验方案将γ-聚谷氨酸肥料增效剂、细沙等撒施。至9月5日全部收获完成。分小区记载实际产量并同时进行田间调查。试验除按方案要求的操作外,其它管理措施同一般番茄田间生产。

　　5结果与分析

　　5.1撒施“γ-聚谷氨酸肥料增效剂”对番茄生物学性状的影响

　　表3不同处理对番茄生物学性状的影响

　　(注:表中数据为四个处理三次重复的平均值。)

　　撒施“γ-聚谷氨酸肥料增效剂”改善了番茄的生物学性状。由表3可知:处理1与处理2、处理3相比,株高分别增加14.68cm、16.11cm；横茎粗分别增加0.34cm、0.36cm，单株果数分别增加2.0个、1.9个，单果重量分别增加为21.63g、22.09g。说明在常规施肥的基础上,撒施“γ-聚谷氨酸肥料增效剂”能增加番茄的株高、横茎粗、单株果数和单果重量。

　　5.2撒施“γ-聚谷氨酸肥料增效剂”对番茄产量的影响

　　表4番茄产量结果统计表

　　表5方差分析表

　　由表4可知:处理1与处理2相比，平均亩增产389.90kg,增产率为9.44％；处理2与处理3相比,平均亩增产24.23kg,增产率为0.59％；处理3与处理4相比,平均亩增产21.20kg,增产率为0.52％。对各处理产量结果进行方差分析(见表5),处理间产量差异达显著水平。

　　6结论

　　试验结果表明:在当地常规施肥的基础上,增用γ-聚谷氨酸肥料增效剂,可以显著增加番茄株高、横茎粗、单株果数和单果重量,平均亩增产率为10％左右,并可提高番茄果实的重量。

　　实施例4

　　γ-聚谷氨酸肥料增效剂在中药材黄芩种植上的田间应用试验

　　1、试验时间：2016年4月10日～2017年11月20日；

　　2、试验地点：杨凌职业技术学院试验基地(该田块土壤类型为潮土,质地为灌於土,肥力中上等,肥力均匀)；

　　3、试验作物：黄芩；

　　4、试验方法

　　试验共设3个处理,随机区组排列,重复3次,小区面积40m2。

　　处理1:常规施肥+亩用γ-聚谷氨酸肥料增效剂2kg拌干细土20kg于第一次追肥期撒施；

　　处理2:常规施肥+用细沙2kg拌干细土20kg于第一次追肥期撒施；

　　处理3:常规施肥。

　　试验是在当地常规施肥的基础上进行。常规施肥为:每平米施土杂肥2～2.5kg，捣细散于地内。深翻20～24cm，耙细整平，做90cm宽的平畦，开好排水沟。地干时，先向畦内灌水，待水渗下后，表土稍干松时再下种。移栽前亩底施复合肥(45％)40kg,整个生育期共追肥2次,第一次亩追施尿素25kg,第二次亩追施复合肥30kg。该试验地按照试验方案要求划分小区，且于2016年4月10日移栽黄芩,2017年11月20日收获。收获时分小区记载实际产量并同时进行田间调查。试验除按方案要求的撒施γ-聚谷氨酸肥料增效剂和细沙外,其它管理措施同一般黄芩生产。

　　5结果与分析

　　5.1撒施“γ-聚谷氨酸肥料增效剂”对黄芩生物学性状的影响

　　表6田间调查统计表