一种含地衣芽孢杆菌的降解秸秆的复合菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及一种微生物领域，具体涉及一种含地衣芽孢杆菌的低温下有效降解秸秆的复合菌及其应用。
背景技术
秸秆中含有丰富的木质纤维素是地球上储量最大的可再生资源，同时微生物对其降解、转化也是自然界碳循环的重要环节，如果能充分利用这些资源，对解决当今世界所面临的能源紧张、环境污染等问题有着深远的意义。目前有很多研究人员开展了在农业废弃物和城市垃圾堆肥过程中添加外源木质纤维素降解菌的研究，虽然在添加外源木质纤维素降解菌是否能够加快堆肥发酵腐熟速率、提高堆肥品质上还存在有争议，但添加外源木质纤维素降解菌在堆肥中的作用已成为研究人员的研究重点。由于北方的气温长期很低，秸秆在短期内不易腐解，导致秸秆资源长期没有得到合理的开发，除少量用于垫圈、喂养牲畜、部分用于堆沤肥外，大部分都作为生活燃料烧掉了，但秸秆中纤维素含量高，也存在少量木质素，在常温下性质十分稳定，因此降解非常缓慢。国内现有的秸秆腐熟剂很多，但大都由于环境温度或菌体生长速度的限制而对秸秆的降解效果表现不良，微生物降解秸秆的腐熟利用更受到限制。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含地衣芽孢杆菌的低温下有效降解秸秆的复合菌剂，通过低温驯化6株菌株，按一定配比混合而成，尤其适合北方低温天气，对腐熟秸秆效果优异。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：
一种含地衣芽孢杆菌的低温下有效降解秸秆的复合菌剂，其特征在于：该复合菌剂含有%206株菌株并按一定质量比混合，产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、地衣芽孢杆菌30％，
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus%20cellulosilyticus)CGMCC%201.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria%20humicola)CGMCC%203.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus%20mucilaginosus%20Krassilnikov)GIM%201.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella%20tengchongensis)CCTCC%20AA208050
Laceyella；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus%20licheniformis)CGMCC1.519；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌为(Myrothecium%20verrucaria)突变菌株T2901，是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的，其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年7月5日，保藏单位地址是中国湖北省武市武昌区珞珈山街16号武汉大学，保藏号是CCTCC%20NO:M2017413。
一种含地衣芽孢杆菌的低温下有效降解秸秆的复合菌剂，是通过以下技术路线实现：富集培养各菌株、低温降解纤维素复合菌系的筛选及驯化、复合菌剂的混合、复合菌剂对秸秆的降解。
更具体地，将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、地衣芽孢杆菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/mL，将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、地衣芽孢杆菌30％，进行充分搅拌混合获得混合菌液。
上述复合菌在降解秸秆中的应用。
本发明获得的有益效果：
本发明的所提供一种含地衣芽孢杆菌的低温下有效降解秸秆的复合菌剂，所述复合菌剂由6株菌株构成，在室外温度1℃-6℃的环境下可以使玉米秸秆腐熟天数提高2-3天，特别适合北方地区。将本发明的复合菌剂与玉米秸秆混合腐熟还田对种植黄瓜效果较好，与对照组相比植株生长更旺盛更健壮，叶片更浓绿，果实更大，平均单果增重21g，产量增加613kg%20每亩，病虫害发生率降低4.1％。本发明提供的复合菌剂以及含大量的地衣芽孢杆菌在腐熟玉米秸秆还田种植黄瓜时能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。
实施例1疣孢漆斑菌的诱变筛选
(1)形态鉴定及筛选
采集长白山自然保护区林区土壤，常规方法在PDA培养基上培养，菌株菌丝起初呈现白色絮状，向外周发散生长，菌落近似不规则圆形，在平板上生长5d后有分生孢子座出现，分生孢子最初呈现墨绿色，培养8d后，分生孢子颜色继续加深，并出现胶點团；培养10d后，菌落呈同心轮纹状，分生孢子胶點团呈现黑色，菌落背面出现淡褐色发射状褶皱。
用打孔器打取直径为1cm的菌块，接种到苯胺蓝选择培养基上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察苯胺蓝褪色情况，挑选褪色速率快，能力强的菌株为候选菌株。
同时为了定向性筛选降解木质素的菌株，设计培养基以木质素为唯一碳源的液体发酵培养基，通过单一碳源的限定，测定木质素的去除率，选择在木质素培养基中涨势良好，且对木质素有一定去除能力的菌株进行后续玉米秸秆的预处理试验。
(2)菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子分类
在确定性状稳定后将菌株送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，鉴定结果此种菌株为疣孢漆斑菌T2901。
(3)菌株的诱变及筛选
突变株的制备主要采用的是常压室温等离子体诱变(ARTP)法，用疣孢漆斑菌T2901%20制备孢子悬浊液。而后进行稀释，调整孢子浓度为107/mL，取10μL稀释好的菌悬液滴于%20ARTP的载片上，进行诱变，用ARTP诱变育种系统4mm射距照射，最佳诱变时间为75s。
将稀释的菌悬液均匀涂布到愈创木酚选择性培养基(愈创木酚浓度为0.4％加入PDA培养基中)上，于需氧培养箱中30℃条件下培养10d，观察变色圈情况，挑选变色圈的大的菌株为候选菌株。正向突变株T2901漆酶活力较野生型菌株提升约50％，经多次传代培养，菌株T2901可稳定遗传。
实施例2菌株的低温驯化
(1)富集培养菌株
将菌株接种到盛有150mL%20PDA培养基的三角瓶中，加入大小均为长度5cm，宽度2cm的滤纸片，30℃恒温震荡培养1h混匀，并将上清液做10-1-10-9稀释，各取1mL稀释液接种在滤纸为唯一碳源的PDA培养基里，28℃静止富集培养4代。筛选出滤纸断裂时间短、溃烂程度高的材料。PDA培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂15g/L
天然玉米秸秆粉摇床培养：称取菌种来源样品5g加入以天然玉米秸秆粉为唯一碳源的%20100mL玉米秸秆粉培养基(将PDA培养基中滤纸用玉米秸秆粉替代中，28℃150rpm培养，15d吸取5mL培养液转入新的玉米秸秆粉富集培养基，富集培养4代。
(2)低温降解纤维素复合菌系的初筛及驯化
采用滤纸崩解法，上述富集培养物接种到滤纸条培养基中驯化低温纤维素分解菌系，初始培养温度为28℃，在该温度下继代培养4代，选择滤纸溃烂程度高的、断裂时间短，pH接近中性的培养物继续传代。每继代培养一次培养温度降低2℃，直至培养温度降低至4℃，通过观察滤纸的断裂情况判断培养物的纤维素分解能力，传代的同时挑选出降解能力保持较好的培养物，在驯化过程中，在8℃温度条件下连续培养8代，滤纸条断裂时间一致时停止低温驯化。
经过初步的低温驯化，结果在4℃条件下，得到的6株菌生长较好，说明其能够在低温条件正常生长。
该6株菌株为：产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、地衣芽孢杆菌，
所述产纤维素酶类芽孢杆菌(Bacillus%20cellulosilyticus)CGMCC%201.15312；
所述产木聚糖酶链格孢菌(Alternaria%20humicola)CGMCC%203.2917；
所述产木素过氧化物酶胶质芽孢菌(Bacillus%20mucilaginosus%20Krassilnikov)GIM%201.16；
所述产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌(Laceyella%20tengchongensis)CCTCC%20AA208050
Laceyella；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus%20licheniformis)CGMCC1.519；
所述菌株均可以从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)、中国典型培养物保藏中心(CCTCC)和广东省微生物保藏中心(GIM)购买得到。
所述产漆酶疣孢漆斑菌(Myrothecium%20verrucaria)突变菌株T2901，是本实验室从长白山采集土壤样品中分离筛选并突变得到的，其已在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2017年7月5日，保藏号是CCTCC%20NO:M2017413。
实施例3复合菌剂的制备
将产纤维素酶类芽孢杆菌、产木聚糖酶链格孢菌、产漆酶疣孢漆斑菌、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌、地衣芽孢杆菌按照常规方式活化、培养至菌液中活菌数达到2.0×108个/mL。
将菌液按照以下质量比混合：产纤维素酶类芽孢杆菌20％、产木聚糖酶链格孢菌10％、产漆酶疣孢漆斑菌20％、产木素过氧化物酶胶质芽孢杆菌10％、产锰过氧化物酶放线莱斯氏菌10％、地衣芽孢杆菌30％，进行充分搅拌混合获得混合菌液。
实施例4秸秆的降解
实验地点选在吉林省吉林农大试验田中，昼夜温度为1℃-6℃，将玉米秸秆收获后将秸秆铺于实验田中，添加本发明复合菌剂，实验田按照每亩施用1.6kg实施例1制备的菌剂，对照组则不用秸秆发酵复合菌剂，然后灌水，观察秸秆腐熟,变化情况：
表1不同处理的秸秆腐熟情况
结果表明，与未添加复合菌剂相比，复合菌剂能将秸秆降解腐熟时间提前到8-9天，即使在1℃到6℃的低温天气也能使秸秆有效腐熟，十分适合北方天气。
实施例5复合菌处理玉米秸秆后还田种黄瓜
实验地点选在吉林省吉林农大试验田中，将玉米秸秆粉粹至3-5cm，秸秆与复合菌剂按质量比800：1混合，堆肥4天得到微生物有机肥，作为基肥一次性施入，施用量1500kg/亩，栽种黄瓜后，加入常规氮磷化肥作为追肥，每次追肥10kg/亩，整个植物生长期和果实成熟期追肥5次，对照组与实验组加入等量的玉米秸秆，并用加等量的常规氮磷化肥作追肥。每隔4天对棚内的室温、叶子和果实生长情况进行数据测试记录，结果如表2：
表2
试验结果表明，将本产品与常规化肥混合施入土壤后，植物植株生长旺盛，植株健壮，叶片浓绿，果实较大,平均单果增重21g，产量增加613kg每亩，病虫害发生率降低4.1％。本发明添加大量的地衣芽孢杆菌能产生抗活性物质，并具有独特的生物夺氧作用机制，能抑制致病菌的生长繁殖。本发明的复合菌剂作用于秸秆还田对作物生长具有很大的促进作用，可有效地增强黄瓜对病虫害的抵抗能力，增加果实重量和产量。
