一种耐高温宫本寿芽孢杆菌及高温堆肥发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物技术和环境工程领域，尤其涉及一种耐高温宫本寿芽孢杆菌及高温堆肥发酵方法。
背景技术
高温堆肥是一个过程性名词，具体来说是一种垃圾处理的方式方法，高温堆肥技术就是在一定的外部条件下，利用微生物将垃圾中能够分解的有机物进行生物降解，使其成为一种类似于肥沃的腐殖土一类物质的过程。这种高温堆肥的方式对垃圾具有一定的特点，有机垃圾是微生物赖以生存和进行繁衍生息的前提条件。根据不同微生物的喜好和生活习性，高温堆肥分为好氧高温堆肥技术以及厌氧高温堆肥技术。其中，好氧高温堆肥技术是主要的发展方向，因为对于厌氧高温堆肥技术，好氧高温堆肥技术有以下几个优点：一，好氧高温堆肥技术的降解比较充分，在同一时间内，好氧高温堆肥技术所能降解的有机物远远高于厌氧高温堆肥技术，在降解相同数量的有机物上，好氧高温堆肥技术能够更快速并且更彻底地降解有机物。同时，好氧高温堆肥技术还具有以下几个特点：好氧高温堆肥在发酵的过程中，能够释放大量的热量，将反应堆体始终保持在一个相对高温的状态下，这种高温不仅会促进发酵过程的进一步加快，同时能够杀死一部分的细菌和病毒，有利于垃圾的无害化处理。此外，好氧高温堆肥技术有利于机械化操作，这些优势奠定了好氧高温堆肥技术在我国高温堆肥领域内的地位。
传统好氧发酵的最高温度一般维持在50～70℃，因此也将该好氧发酵技术称为高温（好氧）堆肥。温度是影响好氧发酵进程的重要因子，整个发酵过程可根据温度高低分为4个阶段：低温阶段、升温阶段、高温阶段、降温阶段。传统堆肥实践认为，堆肥发酵温度不能高于70℃，否则功能微生物会大量死亡，发酵腐熟的进程减慢，导致发酵最终不完全。
近年来已有研究表明提高堆体温度可加速腐殖化进程，缩短发酵周期．嗜热功能微生物是决定发酵温度高低的关键因子，传统高温堆肥中缺乏极端嗜热功能微生物，造成发酵温度难以达到更高。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种耐高温宫本寿芽孢杆菌及高温堆肥发酵方法，
本发明的具体技术方案为：本发明提供了一种耐高温宫本寿芽孢杆菌，其命名为NH-1，已在2019年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC 17919，微生物分类命名为宫本寿芽孢杆菌Bacillus hisashii；所述NH-1的16s核糖体亚基基因序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明菌株为分离自海南观澜湖火山岩矿温泉高温热泉环境的单一兼性好氧宫本寿芽孢杆菌菌株HN-1，经测序鉴定，HN-1菌株16s核糖体亚基基因序列最相似菌株为宫本寿芽孢杆菌杆菌（Bacillus hisashii）。其特性如下：
(1)、通过TM培养基进行筛选、传代。（每升TM培养基中含：Na2HPO4·12H2O 0.43g、KH2PO4 54.0mg、MgCl2·6H2O 0.2g、CaSO4·2H2O 40.0mg、0.01M柠檬酸铁溶液0.5mL、微量元素溶液1.0mL、氨三乙酸0.1g、胰蛋白胨2.5g、酵母提取物2.5g、琼脂（配固体培养基）15g、pH7.2，其中1000倍的微量元素溶液每升中含：Cocl2·6H2O 45.0mg、Na2MoO4·2H2O 25.0mg、CuSO4·5H2O 25.0mg、H3BO3 0.5g、ZnSO4·7H2O 0.5g、MnSO4·H2O 2.28g、Srcl2 34.0mg、Na2SiO3 4.0mg、NaF 2.4mg、浓硫酸0.5mL）
（2）、菌株HN-1在TM培养基中所需生长条件：温度35-100℃（最适75℃），pH 6-11（最适8.5），盐度0-5%（w/v，最适1%）。
（3）、菌株HN-1为革兰氏阳性杆菌，大小0.5-1×2-5（μm），无鞭毛。
（4）、在TM培养基中菌株HN-1的代时约为0.6h。
（5）、菌株HN-1对青霉素、万古霉素、链霉素、红霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素等多种抗生素敏感。
（6）、菌株HN-1主要含有的脂肪酸为饱和脂肪酸C13:0、C14:0、C15:0。
（7）、菌株HN-1具有碱性磷酸酶活性。
（8）、菌株HN-1的甲基红试验和产硫化氢试验为阳性。
（9）、菌株HN-1的产吲哚试验、V-P试验、触媒活性、氧化酶活性为阴性。
如背景技术中所述的，传统好氧发酵的最高温度一般维持在50～70℃，当堆肥发酵温度高于70℃时，鲜有功能微生物能够生存或保持高活性。为此，本发明在筛选过程中发现了本发明的宫本寿芽孢杆菌NH-1，其能够在温度35-100℃（最适75℃），pH 6-11（最适8.5），盐度0-5%（w/v，最适1%）的环境中生存并保持高活性。采用本发明菌株进行高温堆肥，可提高堆体温度，加速腐殖化进程，缩短发酵周期。
作为优选，所述耐高温宫本寿芽孢杆菌还可以为前述宫本寿芽孢杆菌NH-1的培养物或者传代后的培养物。
本发明还提供了一种耐高温宫本寿芽孢杆菌的突变体，所述突变体为对前述宫本寿芽孢杆菌NH-1进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
本发明还提供了一种含有上述耐高温宫本寿芽孢杆菌或含有上述突变体的菌体培养物。
本发明还提供了一种菌体培养物，所述菌体培养物为菌液、菌剂或活性污泥等。
本发明还提供了一种含有上述耐高温宫本寿芽孢杆菌或上述突变体的酶制剂或单细胞蛋白。
本发明还公开了可将上述耐高温宫本寿芽孢杆菌或上述突变体应用于污水处理、垃圾处理、堆肥、酶制剂生产、单细胞蛋白生产中。
本发明还提供了高温堆肥发酵方法，包括以下步骤：
1）首批物料预处理。
2）菌种投放：将所述耐高温宫本寿芽孢杆菌或所述突变体发酵完成后所得发酵液与木屑充分混合，在55-65℃下烘干形成菌剂，将菌剂投放至首批物料中。
3）物料加热。
4）高温发酵：发酵温度为70-100℃。
5) 半连续进料出料。
作为优选，步骤1）具体为：将作为首批物料的原始有机垃圾物料切割粉碎成直径为3-7cm的碎块，与其质量2-5%的生石灰混合，所得混合物控制含水率在75-85%；并按每吨原始有机垃圾物料中投入0.5-1.0g碱性淀粉酶，0.2-0.6g碱性蛋白酶、0.4-1.2g 酯酶，充分混合，静置0.5-1h。
本发明采用特殊的物理切割、加热、化学水解、酶法水解等预处理手段，使肥堆能够快速发热升温至50℃以上，从而快速进入堆肥的高温阶段，使得HN-1菌种快速成为肥堆体系内的绝对优势菌种，并以此为基础，实现可每日补料出料的连续堆肥发酵工艺。
在本发明预处理中，物理切割的原因是物料粒径越小越容易分解，但是，考虑到在增加物料表面积的同时，还必须保持一定程度的孔隙率，以便于通风而使物料能够获得充足的氧供应，因此此处将有机物料切割粉碎成3-7cm的碎块。物料中加入2-5%的生石灰，可以与物料中多余的水分反应放热，使物料快速升温，同时可以控制物料的含水率在75-85%的最佳反应湿度。物料中投入的碱性淀粉酶，碱性蛋白酶、酯酶则可以辅助将物料中的淀粉类、蛋白类、脂类物质提前水解为易于被高温菌种利用的小分子，从而使堆肥快速进入高温阶段。
作为优选，步骤2）中，所述发酵液与木屑的体积比为1:0.8-1.2；所述菌剂的添加量至少为首批物料重量的30%。
作为优选，步骤3）具体为：将首批物料和菌剂在1h内升温至40℃以上，并维持加热2-4h，待温度上升至55-65℃后，停止加热。
作为优选，步骤4）中，发酵环境空气湿度控制在85-90%，若湿度不足则进行补水；高温发酵时间为48-72h。
本发明菌剂在40℃温度条件下激活后，迅速繁殖并分解有机质，产生大量热量，使得物料温度升高至70-100℃，并可维持该高温直至物料完成腐殖化并将大部分水分气化。发酵完成后，物料可减重65-90%。在发酵过程中，设备控制发酵容器内空气湿度在85-90%之间，湿度不足则设备通过喷水来补水。HN-1菌可抑制有害杂菌生长，不产生恶臭、馊味等异味。
作为优选，步骤5）具体为：经过步骤4）的高温发酵后完成腐殖化，开始出料进料；其中，出料比例不超过20wt%；而后投入新的未经过预处理的有机质垃圾物料，投放量不超过步骤4）所得物料的20wt%；新的有机质垃圾物料补充后18-24h内进行第二次出料补料，依此反复操作进行半连续进料出料。
作为优选，每一批菌剂投放后可满足15-30次出料补料操作所需，此后需根据步骤2）-5）重新开始发酵周期。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
1）本发明菌株能够在35-100℃、pH 6-11、盐度0-5%（w/v）范围内正常代谢生长，可利用多种单糖、寡糖、多糖、有机酸、醇作为碳源，以及可利用胰蛋白胨、鱼蛋白胨、牛肉膏等多种复合氮源进行生长，底物谱十分宽广。
2）本发明菌株配合本发明特殊高温堆肥工艺可用于对餐厨垃圾、农产品尾料、屠宰场废料等多种有机质进行高温好氧堆肥处理，使得有机质物料完全腐殖质化、脱水干化并减重65-90%，最终形成品质优良的有机肥。
3）本发明高温堆肥工艺还涉及到特殊的物理切割、加热、化学水解、酶法水解等预处理手段，使肥堆能够快速发热升温至50℃以上，从而快速进入堆肥的高温阶段，使得HN-1菌种快速成为肥堆体系内的绝对优势菌种，并以此为基础，实现可每日补料出料的连续堆肥发酵工艺。
附图说明
图1为宫本寿芽孢杆菌NH-1在不同温度下的生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
总实施例
一种耐高温宫本寿芽孢杆菌，其命名为NH-1，已在2019年6月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC 17919，微生物分类命名为宫本寿芽孢杆菌Bacillus hisashii；所述NH-1的16s核糖体亚基基因序列如SEQ ID NO.1所示。
作为优选，所述耐高温宫本寿芽孢杆菌还可以为前述宫本寿芽孢杆菌NH-1的培养物或者传代后的培养物。
一种耐高温宫本寿芽孢杆菌的突变体，所述突变体为对前述宫本寿芽孢杆菌NH-1进行诱变、驯化、基因重组或者经自然突变而获得的突变体。
一种含有上述耐高温宫本寿芽孢杆菌或含有上述突变体的菌体培养物。
一种菌体培养物，所述菌体培养物为菌液、菌剂或活性污泥等。
一种含有上述耐高温宫本寿芽孢杆菌或上述突变体的酶制剂或单细胞蛋白。
本发明还公开了可将上述耐高温宫本寿芽孢杆菌或上述突变体应用于污水处理、垃圾处理、堆肥、酶制剂生产、单细胞蛋白生产中。
本发明菌株在不同温度（70℃，80℃，90℃，100℃）下的生长曲线如图1所示。从NH-1在70℃，80℃，90℃，100℃下的生长曲线可以看出，高温菌株在70-90℃时随温度升高，代谢活性略有降低，但代谢活性总体较好，100℃下活性仍可达到70℃活性的75%。
一种高温堆肥发酵方法，包括以下步骤：
1）首批物料预处理：将作为首批物料的原始有机垃圾物料切割粉碎成直径为3-7cm的碎块，与其质量2-5%的生石灰混合，所得混合物控制含水率在75-85%；并按每吨原始有机垃圾物料中投入0.5-1.0g碱性淀粉酶，0.2-0.6g碱性蛋白酶、0.4-1.2g酯酶，充分混合，静置0.5-1h。
2）菌种投放：将前述耐高温宫本寿芽孢杆菌或前述突变体发酵完成后所得发酵液与木屑充分混合，在55-65℃下烘干形成菌剂，将菌剂投放至首批物料中。其中，所述发酵液与木屑的体积比为1:0.8-1.2；所述菌剂的添加量至少为首批物料重量的30%。
3）物料加热：首批物料以及菌种投放至带有电加热、搅拌、通气、和补水功能的发酵装置中，采用电加热的方式使物料在1小时内升温至40℃以上，并维持加热2-4小时，待物料温度上升至55-65℃后，停止电加热。
4）高温发酵：发酵温度为70-100℃，发酵环境空气湿度控制在85-90%，若湿度不足则进行补水；高温发酵时间为48-72h。
5）半连续进料出料：经过步骤4）的高温发酵后完成腐殖化，开始出料进料；出料比例不超过20%，而后投入新的有机质垃圾物料，新料投入无需再进行预处理，也无需控制水分比例，可以直接投放，投放的比例不得超过肥堆原始重量的20%。新料补充后18-24h内即可进行第二次出料补料，反复操作即可实现半连续发酵。其中，每一批菌剂投放后可满足15-30次出料补料操作所需，此后需根据步骤2）-5）重新开始发酵周期。
实施例1：餐厨垃圾堆肥处理
取5吨餐厨垃圾，加入带切割搅拌的发酵装置进行连续切割搅拌为5cm左右的碎块，投入3%生石灰，物料的含水率控制在80%，待混匀后投入2.5g碱性淀粉酶，1g碱性蛋白酶、2.5g酯酶继续混合搅拌，开启电加热升温至35℃并维持1h。投入2吨HN-1菌剂木屑，（制作时，液体菌剂与干木屑的体积比例为1：1.1）充分搅拌，加大电加热功率升温至45℃，启动高温堆肥。启动4h后，肥堆温度升至65℃，并在启动24小时内逐步升高温度，最后达到85-100℃，湿度由初始的80%逐步降低，最后约为50%。随后温度缓慢下降，在启动48小时内温度回落至65℃，此时排出20%体积的老料，补充1吨新料继续发酵。肥堆温度继续回升，并根据补料的有机质含量情况维持温度在70-100℃之间，补料24h后，再次相同方式出料补料。出料补料10次后，总共获得的有机肥料2.3吨，含水率35%，物料减重84.7%。
实施例 2 ：养殖固废堆肥
取10吨养猪场粪便，投入4%生石灰，搅拌均匀，物料的含水率控制在82%，投入5.5g碱性淀粉酶，5.0g碱性蛋白酶、10g酯酶继续混合搅拌，开启电加热升温至40℃并维持1h。投入4吨HN-1菌剂木屑，（制作时，液体菌剂与干木屑的体积比例为1：0.8）充分搅拌，加大电加热功率升温至45℃，启动高温堆肥。启动4h后，肥堆温度升至65℃，并在启动24小时内逐步升高温度，最后达到85-100℃，湿度由初始的80%逐步降低，最后约为55%。随后温度缓慢下降，在启动48小时内温度回落至65℃，此时排出20%体积的老料，补充2吨新料继续发酵。肥堆温度继续回升，并根据补料的有机质含量情况维持温度在70-100℃之间，补料24h后，再次相同方式出料补料。出料补料10次后，总共获得的有机肥料4.5吨，含水率38%，物料减重85.0%。
实施例 3 ：农副产品肥料堆肥
取5吨秸秆，加入带切割搅拌的发酵装置进行连续切割搅拌为6cm左右的碎片，投入3%生石灰，搅拌均匀，物料的含水率控制在85%，投入3.0g碱性淀粉酶，2.5g碱性蛋白酶、4.0g酯酶继续混合搅拌，开启电加热升温至40℃并维持2h。投入2.5吨HN-1菌剂木屑，（制作时，液体菌剂与干木屑的体积比例为1：1.2）充分搅拌，加大电加热功率升温至45℃，启动高温堆肥。启动6h后，肥堆温度升至65℃，并在启动24小时内逐步升高温度，最后达到85-100℃，湿度由初始的85%逐步降低，最后约为55%。随后温度缓慢下降，在启动60小时内温度回落至65℃，此时排出25%体积的老料，补充1.25吨新料继续发酵。肥堆温度继续回升，并根据补料的有机质含量情况维持温度在70-100℃之间，补料24h后，再次相同方式出料补料。出料补料10次后，总共获得的有机肥料2.78吨，含水率35%，物料减重84.1%。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 浙江佳河绿环境科技有限公司
<120> 一种耐高温宫本寿芽孢杆菌及高温堆肥发酵方法
<130> 2019
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1473
<212> DNA
<213> 宫本寿芽孢杆菌NH-1(Bacillus hisashii HN-1)
<400> 1
gacgaacgct ggcggcgtgc ctaatacatg caagtcgagc gaaccaataa gaagcttgct 60
ttttgttggt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagaccggg 120
ataactccgg gaaaccggtg ctaataccgg atagattatc tttccgcctg gagagataag 180
gaaagatggc tattgccatc acttacagat gggcccgcgg cgcattagct agttggtgag 240
gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg 300
gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac 360
gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagc gaagaaggtc ttcggatcgt aaagctctgt 420
tgttagggaa gaacaagtat cggaggaaat gccggtacct tgacggtacc tgacgagaaa 480
gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga 540
tttattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt cctttaagtc tgatgtgaaa tcttgcggct 600
caaccgcaag cggtcattgg aaactggggg acttgagtgc agaagaggaa agcggaattc 660
cacgtgtagc ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttc 720
tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg 780
gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttggagg gtttccgccc ttcagtgctg 840
cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga 900
attgacgggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatct cctgaccgcc ctggagacag ggtcttccct tcggggacag 1020
gatgacaggt ggtgcatgga tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggc gttaagtccc 1080
gcaacgagcg caacccttgg ttctagttgc cagcattcag ttgggcactc tagagggact 1140
gccggcgaca agacggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct 1200
gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aaagggcagc gaagcggcga cgcatragcg 1260
aatcccagaa aaccattcgc agttcggatt gcaggctgca actcgcctgc atgaagccgg 1320
aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca 1380
ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca cccgaagtcg gtgaggtaac cgcaaggagc 1440
cagccgccga aggtgggaca gatgattggg gtg 1473
