一株分解煤矸石的草酸青霉菌
技术领域
本发明属于环境生物技术领域，具体涉及一株具有耐受重金属、高效解磷以及分解煤矸石的草酸青霉菌。
技术背景
煤矸石是一种采煤过程中的固体废弃物，综合排放量占原煤产量的10％～15％，是我国排放量最大的工矿业固体废弃物之一。煤矸石的大量堆放，不仅占用大量土地资源，而且煤矸石在自然氧化和风吹雨淋作用下，不断产生的酸性废水导致煤矸石中有毒重金属元素如铅、镉、铬等释放到周边环境，造成环境污染。目前，煤矸石的主要处理方式是填埋，对煤矸石的资源化利用主要为铺路、生产建筑材料、燃烧发电、制作工艺品等方面。此外，还有煤矸石发电，工业提炼氧化铝、硅产品、岩棉、硫等，建筑业制砖、水泥等。以上的解决办法的共同特点：项目投资大、生产成本高、伴有二次废弃物产生、产品没有优势、同类产品代替性强等。
对于煤矸石的测定结果表明，煤矸石中含有一定量的有机质、磷、钾以及多种微量元素，而且煤矸石粉碎物或风化物具有土壤的某些物理特性，如颗粒粗、孔隙大、渗透系数高、田间持水量、凋萎系数和累积蒸发量低，具有一定保水性能，有效水利用率较高，有效养分不高。煤矸石经过理化或生物处理后，改良其物理性状或提高其有效养份含量及利用率，使其成为植物生长的基质或土壤。中国专利(公开号：CN109438116A)公开了一种高温焙烧(600-900℃)对煤矸石进行改性活化制备土壤改良剂的方法，上述专利制备改性煤矸石时煤矸石均需要高温条件焙烧，从而大大增加了能耗和成本。
微生物在自然界中普遍存在，具有体积小、繁殖快、适应性强，食谱广等特点，在废弃物资源化利用和污染环境治理中发挥着不可替代的作用。其中真菌类群在自然界中分布广泛，对环境的适应性极强，例如中国专利(公开号：CN103923839A)公开了一种耐受重金属青霉菌，该真菌分离于煤矿区，对多种重金属具有耐受性，对煤矸石重金属污染修改具有重要意义。有研究表明木霉菌对煤矸石有分解作用，其菌丝可伸入到矿物内部获取营养，促进矿物破碎分解。因此，针对煤矸石废弃物的特点，筛选既能够耐受其中重金属，又能够解离其难溶性磷使煤矸石分解的微生物，对于煤矸石的资源化利用具有重要意义。
本专利涉及的菌种是从湖南省湘西州花垣县的铅锌尾矿区分离筛选出的一株高效解磷草酸青霉，而且该菌株对Pb2+、Zn2+、Cr2+、Mn2+等重金属具有很强的抗性，该菌株已经申请中国专利(公开号：CN103614302A)，进一步的研究表明该菌具有分解煤矸石的作用。目前关于既耐受重金属，又具有高效解磷、分解煤矸石作用的草酸青霉的研究在国内还未见相关报道，该专利菌株的开发对煤矸石的资源化利用，改善煤矸石理化性质，促进植物生长具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种能够分解煤矸石草酸青霉菌，该菌能够溶解煤矸石中的难溶性磷，分解煤矸石，进而促进植物生长及提高基质养分和微生物量。
本发明提供的技术方案是：一株分解煤矸石的草酸青霉菌(Penicilliumoxalicum)TJ2，保藏编号CGMCC No.7699，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心.
本发明所述草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)TJ2已于2013年6月14日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮政编码：100101)，其保藏号为CGMCC No.7699，经检测存活。
本发明所述菌株的培养，培养基配方：大豆饼粉50份、玉米粉50份、麸皮50份，无机盐混合液，按固态基质总重量的1％添加，蒸馏水量按大豆饼粉与麸皮总重量的25％添加，自然pH，接种108/ml的菌液，接种量5％，培养基与菌液搅拌均匀，放置于28℃培养箱中培养，培养时间5天，之后按培养物与无菌水1：10添加，然后置于150rpm摇床中振荡1h，取出后静置10min，按照血球计数板法计数草酸青霉菌孢子的含量，以用于后续实验。
本发明所述菌株在不同培养温度下对难溶性磷酸钙的溶解作用，取草酸青霉菌的孢子悬，按与液体解磷培养基(蔗糖10g/L，磷酸钙10g/L，氯化钠0.3g/L,氯化钾0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.03g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸铵0.5g/L，酵母提取物0.5g/L，pH7.2)体积比1：20接种，培养5天后取样测定可溶性磷含量。
本发明所述菌株对煤矸石的分解作用，利用250ml三瓶中添加50g粉碎过18目的煤矸石，添加等量的蒸馏水，在体系中加入一定量的草酸青霉菌孢子悬液，设置四个添加量：仅加蒸馏水处理(CK)、低剂量草酸青霉菌(1％)、中剂量草酸青霉菌(2.5％)、高剂量草酸青霉菌(5％)，在rpm 180转、培养温度28℃摇床中培养15天，通过测定煤矸石减重量、培养液中速效磷含量，确定本发明菌株的分解煤矸石的作用。
本发明所述菌株在煤矸石对植物生长的作用，取粉碎过8目筛子的煤矸石粉，按重量的1％、2.5％、5％添加草酸青霉菌液，以不添加菌液的处理为对照，与煤矸石粉混合均匀，装入1L体积的花盆中，种入相同数量的黑麦草种子，每周按不同处理定时浇菌液，观察种子发芽率，种植50天后测定黑麦草生物量、煤矸石养分含量、微生物量。
本发明具有以下有益效果：
本发明所述草酸青霉菌(Penicillium oxalicum)TJ2来源于重金属污染的采矿区，利用大豆饼粉与麸皮固态发酵获得最高浓度的孢子悬液。该菌具有将不溶解状态的磷转变为可溶性磷的功能，在添加草酸青霉菌液的处理中，可溶性含量高达2053.2mg/ml，而不加菌的对照体系中可溶性磷含量只有73.4mg/ml，说明本发明菌株具有高效解磷作用。
将本发明菌株以不同用量添加到含有煤矸石粉的液体培养体系中，与不加该菌的处理相比，均能不同程度地分解煤矸石、增加体系速效磷含量。煤矸石中添加草酸青霉菌液种植黑麦草的处理能够提高种子发芽率、煤矸石中养分含量、黑麦草生物量、微生物量均明显高于对照，说明本发明菌株能够使煤矸石分解、释放养分、提高微生物含量，从而有利于植物生长。本发明为煤矸石的资源化利用提供了理论和技术支撑。
附图说明
图1不同固态基质对草酸青霉菌产孢的影响
图2无机盐培养液添加草酸青霉菌产孢的影响
具体实施方式
根据下面实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，但不作为对本发明实施范围的限定。
实施例1：分解煤矸石草酸青霉菌的固态发酵
霉菌一般在固态培养基中更容易产生大量孢子，草酸青霉菌孢子的大量产生将为后续应用于煤矸石分解提供大量的菌种。研究表明，固态培养基成分的不同对产孢量有较大影响，因此本实施例对本发明菌株固态发酵培养基成分进行了研究。固态培养基成分包括麸皮、大豆饼粉、玉米粉、麸皮与大豆饼粉1：2、麸皮与玉米粉1：2、大豆饼粉与玉米粉1：1、以及麸皮、大豆饼粉、玉米粉1：1：1，记为处理1-处理7，置于500ml三角瓶中，每个三角瓶中装固态培养基总重量为20g，蒸馏水的添加量为固体重量的25％，按体系重量的2.5％添加浓度为1×108个孢子/ml的孢子悬液，28℃培养箱中静置培养，每两天用无菌玻璃棒翻搅固态培养基，培养时间5天，之后按培养物与无菌水1：10添加，然后置于rpm150转摇床中振荡1h，取出后静置10min，按照血球计数板法计数草酸青霉菌孢子的含量。以产孢量最大的固态培养基配方原料，以添加1％、3％、5％的无机盐培养液(配方：1升蒸馏水中K2HPO4 0.2g,KH2PO4 0.8g,MgSO4 0.2g,CaSO4·0.5H2O 0.1g,Na2MoO4·5H2O 0.0033g,FeSO4·7H2O0.005g，pH7.2)、不添加无机盐培养液为对照，接种量、培养条件、培养期间的操作等与前面实验一致，测定不同无机盐添加量对固态培养基产孢量的影响。结果表明，麸皮、大豆饼粉、玉米粉1：1：1配方的固态培养基产孢量最大，达到5.76×109个孢子/g基质(见附图1)，添加无机盐培养基可以提高孢子产量，其中3％的无机盐添加量的产孢量最高，达到9.52×109个孢子/g基质(见附图2)。
实施例2：温度对草酸青霉菌溶解难溶性磷酸盐的影响
选择5个温度梯度，以添加磷酸钙为难溶性磷酸盐，配成如下培养基，培养基配方如下：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，FeSO40.03g，MnSO4·H2O 0.03g，酵母粉0.5g，Ca3(PO4)2 10g，蒸馏水l000ml，pH7.0。每瓶装液量50ml，按5％的量添加草酸青霉菌孢子悬液(浓度为1×107/ml，设置的培养温度为20℃、24℃、28℃、32℃、36℃，培养时间5天，发酵液于4℃,10000r/min离心10min，用钼锑抗比色法测定发酵液中可溶性磷含量，结果见表1所示。由表1可以看出，随着培养温度的不同，草酸青霉菌解磷效果不同，其中在28℃培养温度下，解溶效果最佳，体系中可溶性磷含量达到2284.7mg/L。
表1不同培养温度对草酸青霉溶解难溶性磷的影响
实施例3：草酸青霉菌对煤矸石的分解作用
将煤矸石粉碎过18目筛子，称取50g筛下物放置于250ml三角瓶中，加等量蒸馏水，然后将草酸青霉菌孢子悬液(浓度为1.28×107/ml)按1％、2.5％、5％添加到上述体系中，以不加菌悬液的处理为对照，在rpm 180转、培养温度28℃摇床中震荡培养15天，收集液体用滤纸过滤后8000g离心，上清液用于可溶性磷测定，收集未分解的煤矸石粉自然风干后称重，通过测定煤矸石减重量，计算菌株对煤矸石的分解率。由表2可以看出，添加草酸青霉菌液对煤矸石分解有不同程度促进作用，各处理与对照相比在煤矸石分解率和可溶性磷含量方面均明显高于对照，其中添加量为2.5％处理煤矸石分解率和可溶性磷含量最高，分别为18.47％和89.89mg/L。
表2草酸青霉菌对煤矸石的分解作用
实施例4：煤矸石中添加草酸青霉菌对植物生长的促进作用
取粉碎过8目筛子的煤矸石粉，按重量的1％、2.5％、5％添加草酸青霉菌液，以不添加菌液的处理为对照，与煤矸石粉混合均匀后，装入1L体积的花盆中，种入100粒黑麦草种子，每周按不同处理定时浇菌液，观察种子发芽率，种植50天后测定黑麦草生物量、养分含量、微生物量。由表3可以看出，添加草酸青霉菌液对高羊茅种子发芽率、植株生物量、基质有效养分、微生物量均有不同程度促进作用，与对照相比，各处理上述指标均明显高于对照，其中添加量为2.5％与5％的处理差异不显著，说明2.5％的草酸青菌液添加量既可起到显著的作用。
表3草酸青霉对煤矸石粒径组成的影响
