一种肥料用全酶多肽的生产工艺
技术领域
本发明涉及多肽生产技术领域，具体是一种肥料用全酶多肽的生产工艺。
背景技术
多肽分为生物活性肽和人工合成多肽两种，生物活性肽主要由蛋白质经生物提取得到，具有很强的活性，在农业应用方面，多肽不仅能够为作物提供有机态营养成分，多肽还具有螯合能力，能够与中量元素螯合生成水溶性好的螯合化合物，多肽的生理活性使得农作物在利用其中螯合的金属元素的时候，也可以将氨基酸多肽直接吸收，多肽肥料与尿素肥效相当，还能够改善土壤中微生物群落结构，增加植物叶绿素含量，但生产成本较高，并且利用传统酶解蛋白质的方法使得蛋白质水解率低，鳌合稳定性差，易被土壤中有害微生物破坏或吸收，进而造成营养流失，病害增强。
专利号CN201710254558.6公开了一种含钙水溶型复合肥料及其制备工艺，以豆粕为主要成分，辅以马铃薯、山药、茶粕、糖蜜和氯化钠制备固体发酵培养基，通过发酵乳杆菌、枯草芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌枯草亚种等多菌联合分步发酵的方法制备植物活性肽，但该肥料不具有抗菌效果，因此抑制有害菌污染的能力不理想，且发酵时间较长。
专利号CN201510944758.5公开了生物活性多肽钙肥的制备方法，克服了氢氧化钙易与空气中的二氧化碳生成碳酸钙沉淀，不易保存，所制备的产品不具备生物活性，增产效果不显著的问题，但是利用聚琥珀酰亚胺具有刺激性，使用时应避免吸入，避免与皮肤接触，这导致了制作安全性更为严格，操作性更弱。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种肥料用全酶多肽的生产工艺，具体如下：
一种肥料用全酶多肽的生产工艺，包括如下步骤：
1)电流辅助溶胀：将蛋白质置于溶胀溶液中，通入恒压正向电流处理12-18min后，通入恒压反向电流处理10-15min；
2)超声辅助酶解：向步骤1)所得物中加入其质量0.1-0.5％的活化复合酶制剂进行酶解，同时在酶解过程中每静态酶解10-13min辅以间歇超声波处理40-60s，循环操作3-6次；
3)灭酶：将步骤2)所得物进行灭酶，然后置于温度为-20～-10℃条件下冷冻干燥，即得。
所述蛋白质为植物蛋白、动物蛋白、微生物蛋白中的任意一种或几种的组成物。
所述溶胀溶液由如下质量百分数物质组成：乳酸钠1-4％、葡萄糖酸铜2-7％、磷灰石0.1-0.8％、红柱石0.3-1.4％、尿素0.3-0.9％，余量为水。
本申请溶胀溶液具有促酶解的作用，通过溶胀处理使得促酶解成分进入蛋白质结构内部，进而有助于提高酶解效率；具有转晶作用，能够使得蛋白质疏水结构中被包埋的肽键、分子肽片段暴露；具有吸附作用，能够使得蛋白质中杂质得以分离；添加了红柱石，可吸收热应力，进而防止蛋白质变性，在磷灰石与尿素的作用下，牢固了分解、脱落的游离多肽，并形成保护膜，进而提高了多肽的抗冷冻性能，防止了低温冷冻中多肽活性的降低，同时在电流溶胀过程中磷灰石还能够与红柱石组成焓变材料，放大正反电流产生的温变情况下物质热胀冷缩现象，进而有助于蛋白质结构分解，同时利用其空间结构的特殊性对多肽活性部位进行保护，防止了活性部位受损伤。
所述恒压正向电流的电压为220-340V，恒压反向电流的电压为410-470V。
本申请利用正反电流作用，并且控制反向电流大于正向电流，以及先进行正向电流处理再进行反向电流处理，使得电子与离子的移动呈现显著转变，进而防止体系中碳元素、氢元素、氧元素形成小分子糖类，进而从根本上抑制了蛋白质发生美拉德反应。
所述复合酶制剂包括如下重量份组分组成：木聚糖酶3-6份、天冬氨酸蛋白酶1-4份、玉米醇溶蛋白酶7-12份、地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶2-8份、丝氨酸蛋白酶1-6份。
本发明利用多种蛋白酶制成复合酶制剂，其适应性强，反应酸碱度与温度范围大，作用位点多，能够有效分解蛋白质形成多肽，同时具有抑制多种有害菌的作用。
所述活化是将复合酶与载体液按1：(10-14)的质量比混合后，得混合液，将混合液在1-5℃、25-45W微波条件下照射120-180s，即得活化复合酶制剂；所述载体液为质量分数为2-7％的左旋聚乳酸溶液。
本发明中左旋聚乳酸溶液生物相容性好，无毒害作用，能够在复合酶制剂白形成羰基(C＝O)、羧基(O＝C-O)、羟基(C-OH)活性基团，进而有利于提高对蛋白质的靶向作用，并且利用微波处理，使得复合酶具有抗磁性干扰的能力，进而在超声波间歇处理时复合酶不会受到电磁波干扰而造成活力降低，并且利用左旋聚乳酸溶液进行复合酶活化，不仅提高了还提高了复合酶的酶解活性、耐热性、耐酸碱性性能以及耐有机溶剂性能。
所述超声波处理的频率为35-45kHz。
本发明利用超声波并控制超声波频率，能够使得体系中水分、碳水化合物等电解质吸收电磁波，体系中的极性分子间相互碰撞和摩擦，进而产生微弱热量，适宜于复合酶活性，并且超声波辅助酶解能够产生电磁场、水分场和压力场，进而使得蛋白质结构发生变化，有助于蛋白质分解。若频率太小，热量不足，复合酶活力差，若频率太大，振荡过度，使得蛋白质结构过度破损，不利于蛋白质分解成多肽。
所述灭酶是将步骤2)所得物置于温度为120-140℃下处理180-300s，再置于红外光下处理10-30s，循环处理2-5次。
本发明采用超低温和紫外交替处理，逐渐钝化复合酶表面羰基(C＝O)、羧基(O＝C-O)、羟基(C-OH)等活性基团的活性能力，使得聚乳酸在复合酶表面形成保护膜，彻底分离复合酶与多肽物质，不仅保证了酶解反应的充分进行，更重要的是，严格降低灭酶工艺参数，还防止了多肽活性降低或肽键断裂；由于多肽物质中含有聚乳酸包覆的复合酶，在用于肥料时，聚乳酸能够被土壤中微生物所分解，使得复合酶流出，达到抑制有害菌的效果，再配合多肽等流动性和渗透性，能够使得复合酶向深层土壤渗透。
本发明制备的肥料用全酶多肽用于制作多肽螯合肥，与金属离子按1：(0.1-0.6)的质量比进行螯合。
所述金属离子为钙离子、钠离子、钾离子、锌离子、锰离子、铁离子、镁离子中的一种或多种。
所述螯合的工艺条件为：温度为40-50℃，pH为5.5-8.5。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明的肥料用全酶多肽具有较好的生理活性、渗透性以及稳定性，易被农作物吸收，不易受到环境影响而失活，具有螯合工艺条件低，能够螯合不同化学活泼性的金属离子，如钙离子、钠离子、钾离子、锌离子、锰离子、铁离子、镁离子；同时，本发明的多肽还具有抑制土壤中有害菌的能力，且抑菌谱广泛，能够抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、炭疽病菌、大斑病菌、赤霉病菌、枯萎病菌、灰霉病菌等。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。
实施例1
一种肥料用全酶多肽的生产工艺，包括如下步骤：
1)电流辅助溶胀：将蛋白质置于溶胀溶液中，通入恒压正向电流处理18min后，通入恒压反向电流处理15min；
2)超声辅助酶解：向步骤1)所得物中加入其质量0.5％的活化复合酶制剂进行酶解，同时在酶解过程中每静态酶解13min辅以间歇超声波处理60s，循环操作6次；
3)灭酶：将步骤2)所得物进行灭酶，然后置于温度为-10℃条件下冷冻干燥，即得；
所述蛋白质为植物蛋白；
所述溶胀溶液由如下质量百分数物质组成：乳酸钠4％、葡萄糖酸铜7％、磷灰石0.8％、红柱石1.4％、尿素0.9％，余量为水；
所述恒压正向电流的电压为340V，恒压反向电流的电压为470V；
所述复合酶制剂包括如下重量份组分组成：木聚糖酶6份、天冬氨酸蛋白酶4份、玉米醇溶蛋白酶12份、地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶8份、丝氨酸蛋白酶6份；
所述活化是将复合酶与载体液按1：14的质量比混合后，得混合液，将混合液在5℃、45W微波条件下照射180s，即得活化复合酶制剂；所述载体液为质量分数为7％的左旋聚乳酸溶液；
所述超声波处理的频率为45kHz；
所述灭酶是将步骤2)所得物置于温度为140℃下处理300s，再置于红外光下处理30s，循环处理5次。
实施例2
一种肥料用全酶多肽的生产工艺，包括如下步骤：
1)电流辅助溶胀：将蛋白质置于溶胀溶液中，通入恒压正向电流处理12min后，通入恒压反向电流处理10min；
2)超声辅助酶解：向步骤1)所得物中加入其质量0.1％的活化复合酶制剂进行酶解，同时在酶解过程中每静态酶解10min辅以间歇超声波处理40s，循环操作3次；
3)灭酶：将步骤2)所得物进行灭酶，然后置于温度为-20℃条件下冷冻干燥，即得；
所述蛋白质为动物蛋白；
所述溶胀溶液由如下质量百分数物质组成：乳酸钠1％、葡萄糖酸铜2％、磷灰石0.1％、红柱石0.3％、尿素0.3％，余量为水；
所述恒压正向电流的电压为220V，恒压反向电流的电压为410V；
所述复合酶制剂包括如下重量份组分组成：木聚糖酶3份、天冬氨酸蛋白酶1份、玉米醇溶蛋白酶7份、地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶2份、丝氨酸蛋白酶1份；
所述活化是将复合酶与载体液按1：10的质量比混合后，得混合液，将混合液在1℃、25W微波条件下照射120s，即得活化复合酶制剂；所述载体液为质量分数为2％的左旋聚乳酸溶液；
所述超声波处理的频率为35kHz；
所述灭酶是将步骤2)所得物置于温度为120℃下处理180s，再置于红外光下处理10s，循环处理2次。
实施例3
一种肥料用全酶多肽的生产工艺，包括如下步骤：
1)电流辅助溶胀：将蛋白质置于溶胀溶液中，通入恒压正向电流处理15min后，通入恒压反向电流处理12min；
2)超声辅助酶解：向步骤1)所得物中加入其质量0.3％的活化复合酶制剂进行酶解，同时在酶解过程中每静态酶解12min辅以间歇超声波处理50s，循环操作4次；
3)灭酶：将步骤2)所得物进行灭酶，然后置于温度为-15℃条件下冷冻干燥，即得；
所述蛋白质为微生物蛋白；
所述溶胀溶液由如下质量百分数物质组成：乳酸钠2％、葡萄糖酸铜4％、磷灰石0.5％、红柱石0.8％、尿素0.6％，余量为水；
所述恒压正向电流的电压为280V，恒压反向电流的电压为440V；
所述复合酶制剂包括如下重量份组分组成：木聚糖酶4份、天冬氨酸蛋白酶3份、玉米醇溶蛋白酶9份、地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶5份、丝氨酸蛋白酶3份；
所述活化是将复合酶与载体液按1：12的质量比混合后，得混合液，将混合液在3℃、35W微波条件下照射150s，即得活化复合酶制剂；所述载体液为质量分数为4％的左旋聚乳酸溶液；
所述超声波处理的频率为40kHz；
所述灭酶是将步骤2)所得物置于温度为130℃下处理180-300s，再置于红外光下处理20s，循环处理3次。
实施例4
一种肥料用全酶多肽的生产工艺，包括如下步骤：
1)电流辅助溶胀：将蛋白质置于溶胀溶液中，通入恒压正向电流处理14min后，通入恒压反向电流处理15min；
2)超声辅助酶解：向步骤1)所得物中加入其质量0.2％的活化复合酶制剂进行酶解，同时在酶解过程中每静态酶解12min辅以间歇超声波处理45s，循环操作5次；
3)灭酶：将步骤2)所得物进行灭酶，然后置于温度为-15℃条件下冷冻干燥，即得；
所述蛋白质为植物蛋白、动物蛋白、微生物蛋白的组成物；
所述溶胀溶液由如下质量百分数物质组成：乳酸钠3％、葡萄糖酸铜3％、磷灰石0.7％、红柱石1.2％、尿素0.7％，余量为水；
所述恒压正向电流的电压为300V，恒压反向电流的电压为450V；
所述复合酶制剂包括如下重量份组分组成：木聚糖酶5份、天冬氨酸蛋白酶3份、玉米醇溶蛋白酶10份、地衣芽胞杆菌碱性蛋白酶7份、丝氨酸蛋白酶2份；
所述活化是将复合酶与载体液按1：11的质量比混合后，得混合液，将混合液在4℃、30W微波条件下照射150s，即得活化复合酶制剂；所述载体液为质量分数为6％的左旋聚乳酸溶液；
所述超声波处理的频率为42kHz；
所述灭酶是将步骤2)所得物置于温度为130℃下处理280s，再置于红外光下处理15s，循环处理4次。
试验例1溶胀溶液的配方筛选
水解度(％)＝100％×(灭酶后溶液中氨基态氮含量/原料中总氮含量)；其中，采用茚三酮法测定灭酶后溶液中氨基态氮含量，采用凯氏定氮法测定原料中总氮含量；
在实施例1的基础上，采用如表1所示的溶胀溶液配方进行试验；
表1
蛋白质水解度如表2所示；
表2
对样品1-7以及实施例1的全酶多肽进行试验，选用盆栽试验法，所种植物为油菜，供试土壤为棕壤。设置清水为空白组，设置腐熟牛粪(稀释10000倍)作对照组，实验组1-8分别为在腐熟牛粪(稀释10000倍)基础上添加质量1ppm的实施例1、样品1-7制备的多肽；两次重复试验，每组试验面积为20cm×50cm，在生长期进行喷肥，每组具体喷肥量为10mL，每周喷施一次，连续喷施六次，在喷施结束后取样检测，在作物生长期间除喷施肥料不同外，其余条件均保持一致；油菜采收之后对其单株重进行测定，结果如表3所示；
表3
试验例2
水解度测定按照试验例1所述；
在实施例2的基础上进行如下调整后，进行试验；
调整情况如下：
实验组1：恒压正向电流的电压为220V，恒压反向电流的电压为220V；
实验组2：恒压正向电流的电压为410V，恒压反向电流的电压为220V；
实验组3：先进行恒压反向电流处理，再进行恒压正向电流处理；其中恒压反向电流的电压为220V，恒压正向电流的电压为410V；
实验组4：先进行恒压反向电流处理，再进行恒压正向电流处理；其中恒压反向电流的电压为410V，恒压正向电流的电压为220V；
实验组5：仅进行恒压正向电流处理；
实验组6：仅进行恒压反向电流处理；
蛋白质水解度如表4所示；
表4
试验例2
在实施例3的基础上，采用如表5所示的复合酶制剂组分进行试验；
表5
然后对其制备的多肽进行抑菌活性测定，具体如下：
对真菌的抑菌活性测定：用平皿法进行多肽对各种供试真菌的抑菌活性进行评估测定，首先将各种真菌菌株转接到PDA固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养，至平板内覆盖菌丝达70％以上，用无菌打孔器打成直径为4mm的小菌饼，然后将菌饼转接到PDA固体培养基两侧(以正三角形的方式放在距平皿中心25mm处的位置)，将牛津杯放置到固体培养基中央，分别加入200μL经0.22μm细菌过滤器除菌的以去离子水为稀释剂配制的质量分数5％的多肽液，28℃培养5d后测量抑菌圈的大小，测量菌落直径采用十字交叉法，以无菌水为对照，不加任何药剂的处理作空白对照，以加多菌灵的处理作阳性对照，每组重复做三次，无抑菌活性的用“-”表示，抑菌直径低于10mm用“+”表示，抑菌直径在10～20mm之间用“++”表示，抑菌直径超过20mm用“+++”表示；
对细菌的抑菌活性测定：将Escherichia coli和Staphyloccocus aureusRosenbach分别转接到LB固体培养基上并划线，等到单菌落长出后，选一个单菌落到LB液体培养基中，以150r/min，30℃的条件在恒温摇床中摇至菌液变浑浊，然后在紫外杀菌过的超净台中将200μL菌液移取到LB固体培养基上，用高温灭菌过的涂布器涂均匀后，把五种母液稀释到500μg/mL的多肽液，分别取200μL多肽液加入6片提前灭菌过的纸片上(对照组是用无菌蒸馏水处理的纸片)，待纸片将多肽液完全吸收，马上转接到培养过细菌的培养基中，在摇床中30℃培养一天后观察抑菌效果，无抑菌活性的用“-”表示，抑菌直径低于10mm用“+”表示，抑菌直径在10～20mm之间用“++”表示，抑菌直径超过20mm用“+++”表示；
结果如表6所示；
表6
最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
