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一株多功能里氏木霉及其应用

2021-03-08 17:37:32

一株多功能里氏木霉及其应用

　　技术领域

　　本发明属于生物防治技术领域，具体涉及一株多功能里氏木霉及其应用。

　　背景技术

　　目前，植物病害和线虫防治主要以化学防治为主，化学农药不仅严重降低蔬菜和饲草质量、污染环境、破坏生态平衡，而且对人、畜不安全。随着人们对食品安全、生态安全的重视，生物防治是实现现代农业可持续发展的重要策略之一。特别是利用自然界原本存在的植物根际有益微生物对靶标病原微生物和虫害的拮抗作用，来控制病虫害，具有较小的环境风险，是一种与环境友好的防治技术。

　　木霉是一类重要的生防真菌，以其产生多种水解酶类和拮抗物质以及营养竞争等机制，被广泛用于植物病虫害防治中。国内外已有商品化注册登记的木霉产品应用于田间。但是，现有技术中的木霉菌株大多数仅具备一种或少数几种功能，缺少同时具备集多种功能于一身的木霉菌株。

　　发明内容

　　本发明的第一个目的是提供一种多功能木霉菌株。

　　本发明提供的多功能木霉菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)H-LS，其保藏编号为CGMCC No.18108。该菌株已于2019年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。

　　本发明的第二个目的是提供里氏木霉H-LS CGMCC No.18108的新用途。

　　本发明提供了里氏木霉H-LS CGMCC No.18108在(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)、(Ⅶ)中的至少一种中的应用：(Ⅰ)促进植物生长；(Ⅱ)防治线虫；(Ⅲ)抑制植物病原菌；(Ⅳ)溶磷；(Ⅴ)解钾；(Ⅵ)降解纤维素；(Ⅶ)产几丁质酶。

　　本发明还提供了里氏木霉H-LS CGMCC No.18108在制备产品中的应用；所述产品的用途为(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)、(Ⅶ)中的至少一种：(Ⅰ)促进植物生长；(Ⅱ)防治线虫；(Ⅲ)抑制植物病原菌；(Ⅳ)溶磷；(Ⅴ)解钾；(Ⅵ)降解纤维素；(Ⅶ)产几丁质酶。

　　本发明的第三个目的是提供一种产品。

　　本发明提供的产品的活性成分为里氏木霉H-LS CGMCC No.18108或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；所述产品的用途为(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)、(Ⅶ)中的至少一种：(Ⅰ)促进植物生长；(Ⅱ)防治线虫；(Ⅲ)抑制植物病原菌；(Ⅳ)溶磷；(Ⅴ)解钾；(Ⅵ)降解纤维素；(Ⅶ)产几丁质酶。

　　本发明的第四个目的是提供一种生物菌肥的制备方法。

　　本发明提供的生物菌肥的制备方法包括如下步骤：

　　1)将发酵基质、碳源、氮源、无机盐和水混匀，灭菌，得到发酵物料；

　　所述发酵基质包括芦苇草粉、麦麸和米糠；

　　2)将里氏木霉H-LS CGMCC No.18108的孢子液接种至所述发酵物料中进行发酵培养；得到发酵产物；

　　3)将所述发酵产物风干，得到所述生物菌肥。

　　上述方法中，所述1)中，所述碳源可为如下物质中的至少一种：葡萄糖、蔗糖、糖蜜；

　　所述氮源可为如下物质中的至少一种：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、黄豆饼粉；

　　所述无机盐可为如下物质中的至少一种：磷酸二氢钾、磷酸氢二钾；

　　进一步的，所述发酵基质由芦苇草粉、麦麸和米糠组成。

　　所述碳源为葡萄糖；

　　所述氮源为蛋白胨；

　　所述无机盐为磷酸二氢钾。

　　更进一步的，所述芦苇草粉、所述麦麸、所述米糠的质量比可为(2-4):(1-3):1；具体为3:2:1。

　　所述葡萄糖在所述发酵基质中的质量分数可为0.5-1.5％；具体为1％；

　　所述蛋白胨在所述发酵基质中的质量分数可为0.03-0.07％；具体为0.05％；

　　所述磷酸二氢钾在所述发酵基质中的质量分数可为0.01-0.03％；具体为0.02％；

　　所述水在所述发酵基质中的质量分数可为30-50％，具体为40％；

　　所述灭菌的条件具体为121℃高压灭菌30min。

　　上述方法中，所述2)中，所述孢子液的制备方法包括如下步骤：将里氏木霉H-LSCGMCC No.18108在培养基(培养基可为PDA培养基)上进行培养(培养条件可为28℃培养5天)，冲洗孢子(可用灭菌蒸馏水冲洗)，得到所述孢子液；

　　进一步的，所述孢子液的浓度可为1×104-1×108个/mL；具体为1×106个/mL。

　　所述孢子液以2-8％(体积分数)的比例接种于所述发酵物料中；具体为5％。

　　所述发酵培养的条件可为(26-30)℃培养7-15天；具体为(26-30)℃培养10天。

　　所述3)中，所述风干至含水量为15％以下，具体为风干至含水量为10％。

　　按照上述方法制备得到的生物菌肥也属于本发明的保护范围。

　　本发明的第五个目的是提供上述生物菌肥在如下任一种中的应用：

　　a、促进植物生长；

　　b、抑制植物病原菌；

　　c、防治植物病原菌侵染引起的植物病害；

　　d、防治线虫；

　　e、提高蔬菜和/或饲草品质；

　　f、改善土壤养分。

　　本发明的最后一个目的是提供一种促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物病原菌侵染引起的植物病害和/或防治线虫和/或提高蔬菜和/或饲草品质和/或改善土壤养分的方法。

　　本发明提供的促进植物生长和/或抑制植物病原菌和/或防治植物病原菌侵染引起的植物病害和/或防治线虫和/或提高蔬菜和/或饲草品质和/或改善土壤养分的方法包括用上述生物菌肥处理植物的步骤。

　　上述方法中，所述处理植物的方法可为将所述生物菌肥拌入植物育苗基质或植物土壤中。

　　上述任一所述应用或方法中，所述植物病原菌可为植物病原真菌；具体可为立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、辣椒疫霉、瓜果腐霉、三线镰刀菌、极细枝孢、炭疽菌或交链格孢。在本发明的具体实施例中，所述植物病原真菌具体可为立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 43478、辣椒疫霉(Phytophthoracapsisi)：ACCC 37300、瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)：ATCC32230、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 30316、三线镰刀菌(Fusarium tricinctum)：FDW1、极细枝孢(Cladosporium tenuissimum)：CM2、炭疽菌(Colletotrichum cliviicola)：PCC1、交链格孢(Alternaria alternata)：ATH1-2、交链格孢(Alternaria alternata)：ACH2。

　　所述线虫可为根结线虫。所述根结线虫具体为番茄根结线虫(Meloidogynespp.)。

　　所述溶磷是指将植物不能直接利用的磷(例如蛋黄中的卵磷脂)转变成植物能利用的可溶性磷。

　　所述解钾是指将植物不能利用的钾(例如钾长石中的矿物质形式的钾)转变成植物能利用的可溶性钾。

　　所述降解纤维素是指将植物不能直接利用的纤维素(例如微晶纤维素)转变成植物能利用的碳源。

　　所述产几丁质酶是指木霉可通过分泌重要的真菌细胞壁降解酶-几丁质酶，降解细胞壁的组成(例如几丁质)，在重寄生过程中，进而杀死病原真菌。

　　所述促进植物生长体现在增加植物的株高和/或增加植物的茎粗和/或增加植物的叶长和/或增加植物的叶宽和/或增加植物的根长和/或提高植物的茎叶鲜重和/或提高植物的根系鲜重和/或增加植物的分支数和/或提高植物的根体积。

　　所述提高蔬菜和/或饲草品质体现在提高蔬菜和/或饲草的饲用营养成分含量；所述饲用营养成分含量具体为干物质和/或粗灰分和/或粗蛋白和/或粗脂肪和/或粗纤维和/或钙和/或磷。

　　所述改善土壤养分体现在提高土壤有效养分的含量；所述有效养分具体为有效氮和/或有效磷和/或有效钾。

　　所述植物或蔬菜或饲草可为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物包括茄科植物、豆科植物、葫芦科、菊科。所述茄科植物具体可为番茄，所述豆科植物具体可为拉巴豆，所述葫芦科植物具体可为黄瓜，所述菊科植物具体可为菊苣。

　　本发明提供了一种具有抑制植物病原菌、防治线虫、促进植物生长、溶磷、解钾、降解纤维素、产几丁质酶7种功能于一身的木霉菌株，使木霉易在土壤中成功定殖，分泌几丁质酶，对田间植物病原菌和线虫产生抑制作用，降解土壤中难溶的磷酸盐、钾矿石及纤维素供其植物生长，起到药肥两用的功效，获得最大的经济和生态效益。除此之外，本发明菌剂的制作工艺简单，且对环境友好，具有广阔的市场前景。

　　保藏说明

　　菌种名称：里氏木霉

　　拉丁名：Trichoderma reesei

　　菌株编号：H-LS

　　保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

　　保藏机构简称：CGMCC

　　地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

　　保藏日期：2019年7月15日

　　保藏中心登记入册编号：CGMCC No.18108

　　附图说明

　　图1为在PDA固体培养基上28℃培养3天后的菌落形态照片。

　　图2为实施例6的结果-立枯丝核菌引起的黄瓜病害。

　　图3为实施例6的结果-尖孢镰刀菌引起的黄瓜病害。

　　图4为实施例8的结果-里氏木霉菌剂在番茄工厂化育苗中的应用效果。

　　图5为实施例9的结果-里氏木霉菌剂在黄瓜工厂化育苗中的应用效果。

　　图6为实施例10的结果-里氏木霉H-LS菌剂在拉巴豆生产中的应用效果。

　　图7为实施例11的结果-里氏木霉H-LS菌剂在菊苣生产中的应用效果。

　　具体实施方式

　　以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

　　实施例1、里氏木霉H-LS的获得和鉴定

　　一、菌株H-LS的获得及命名

　　本发明菌株来源于北京海淀区土传病害(猝倒病)严重的地块中健康黄瓜根际土壤，通过拮抗植物病原菌和植物促生特性，筛选得到若干多功能菌株，根据抑菌、促生效果、生长速度、产孢量、抗逆性，植物根际定殖能力等特点，筛选到综合效果最好的菌株，并将其命名为菌株H-LS。

　　二、菌株H-LS的鉴定

　　1、菌株H-LS的形态学鉴定

　　PDA固体培养基：马铃薯200g(煮烂过滤取滤液)、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL，pH自然。

　　菌株H-LS在PDA固体培养基上28℃培养3d后的菌落形态照片见图1，菌落初为纯白色，培养2d中心老菌丝开始变为浅绿色；分生孢子浅绿色，卵圆形或椭圆形，光滑，(3.4-5.1)μm×(2.2-3.0)μm；产孢瓶梗中部膨大，基宽(1.7-2.6)μm；最大宽度(2.6-3.4)μm；长/最大宽度1.7-3.4。

　　2、菌株H-LS的分子鉴定

　　提取菌株H-LS的基因组DNA，采用通用引物PCR扩增菌株H-LS的ITS区序列并进行测序。测序结果表明：菌株H-LS的ITS区的编码序列如序列表的序列1所示。

　　三、菌株H-LS的保藏

　　基于步骤二中的形态学鉴定以及ITS序列分析的结果，菌株H-LS属于里氏木霉(Trichoderma reesei)。里氏木霉(Trichoderma reesei)H-LS已于2019年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC NO.18108。里氏木霉(Trichoderma reesei)H-LS简称里氏木霉H-LS。

　　实施例2、里氏木霉H-LS的营养改善能力

　　一、溶磷能力(即将植物不能直接利用的磷转变成植物能利用的可溶性磷的能力)的测定

　　1、定性测定

　　蒙金娜有机磷固体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaC1 5.0g、Agar 15g、水1000mL，pH7.0，分装灭菌，临用时每50mL加入3mL蛋黄溶液(蛋黄溶液即新鲜蛋黄与0.9％生理盐水的等体积混合得到的混合液；蛋黄提供难利用的卵磷脂)。

　　将里氏木霉H-LS点接种于蒙金娜有机磷固体培养基上，28℃培养7d，观察其生长情况。

　　里氏木霉H-LS在蒙金娜有机培养基上生长良好，可产生大量绿色孢子，能形成明显的溶磷圈，说明其具有解有机磷能力。

　　2、定量测定

　　孟金娜有机磷液体培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏3.0g、NaC1 5.0g、水1000mL，pH7.0，分装灭菌，临用时每50mL加入3mL蛋黄溶液(蛋黄溶液即新鲜蛋黄与0.9％生理盐水的等体积混合得到的混合液；蛋黄提供难利用的卵磷脂)。

　　(1)用无菌水将里氏木霉H-LS制备成菌浓度为106cfu/mL的菌悬液。

　　(2)将步骤(1)得到的菌悬液121℃高温灭菌20分钟，得到灭活菌液。

　　(3)实验组：将1mL步骤(1)得到的菌悬液接种至50mL孟金娜有机磷液体培养基，28℃、180rpm振荡培养5d，然后将整个培养体系转移至无菌的50mL离心管，加入0.5g无磷活性碳，然后采用KQ-500DB型数控超声波清洗器进行超声波细胞破碎(处理时间为20min，释放出细胞内的有效磷)，然后4℃、10000rpm离心15min，取上清液。用1mL步骤(2)得到的灭活菌液代替步骤(1)得到的菌悬液，进行上述处理，作为对照组。

　　(4)取步骤(3)得到的上清液，采用钼酸铵比色法检测可溶性磷含量。

　　P＝K×V/V1；P:有效磷增量；K:从标准曲线查得显色液的磷含量(mg/L)；V:显色时溶液定容的体积(mL)；V1:显色时吸取上清液的体积(mL)。

　　溶磷量＝实验组的P值-对照组的P值。

　　每组设置6个重复处理，结果取平均值。

　　溶磷量为224.56±15.68mg/L。

　　二、解钾能力(即将植物不能利用的钾转变成植物能利用的可溶性钾的能力)的测定

　　1、定性测定

　　解钾固体培养基：蔗糖5g、MgS04·7H2O 0.5g、FeCl3 0.005g、Na2HPO4 2g、钾长石粉(提供难利用的钾)5g、CaCO3 0.1g、FeCl3 0.005g、蒸馏水1000mL、琼脂20g，pH7.1-7.4。

　　将里氏木霉H-LS划线接种于解钾固体培养基上，28℃培养5d。里氏木霉H-LS在解钾固体培养基平板上生长良好，说明其具有解钾能力。

　　2、定量测定

　　解钾液体培养基：蔗糖5g、MgS04·7H2O 0.5g、FeCl3 0.005g、Na2HPO4 2g、钾长石粉(提供难利用的钾)5g、CaCO3 0.1g、FeCl3 0.005g、蒸馏水1000mL，pH7.1-7.4。

　　(1)用无菌水将里氏木霉H-LS制备成孢子浓度为106cfu/mL的孢子悬液。

　　(2)将步骤(1)得到的孢子悬液121℃高温灭菌20分钟，得到灭活菌液。

　　(3)实验组：将5mL步骤(2)得到的菌悬液接种至100mL解钾液体培养基，28℃、180rpm培养7d，然后4℃、10000rpm离心10min，取上清液。用1mL步骤(2)得到的灭活菌液代替步骤(1)得到的菌悬液，进行上述处理，作为对照组。

　　(4)取步骤(3)得到的上清液，利用火焰分光光度计法测钾含量。

　　解钾量＝实验组的钾含量-对照组的钾含量。

　　每组设置6个重复处理，结果取平均值。

　　解钾量为0.87±0.15mg/L。

　　三、降解纤维素能力的测定

　　降解纤维素培养基：(NH4)2SO4 5g、K2HPO4 1g、NaH2PO4 1g、MgS04·7H2O 0.5g、微晶纤维素5g、琼脂18g、蒸馏水1000mL，pH7.1-7.4。

　　将里氏木霉H-LS在PDA培养基上28℃培养5d，制备直径为5mm的菌饼，接种于预先倒有上述降解纤维素培养基的培养皿上，28℃培养7d。用0.1％刚果红染色0.5h，再用1mol/L的NaCl溶液脱色0.5h，观察其有无透明圈。

　　结果表明：里氏木霉H-LS可在上述降解纤维素培养基上生长，产生大量绿色孢子，菌落周围有透明圈产生，说明其具有降解纤维素能力。

　　实施例3、里氏木霉H-LS对植物病原真菌的拮抗能力

　　一、里氏木霉H-LS产几丁质酶能力测定

　　产几丁质酶培养基：(NH4)2SO4 3g、K2HPO4 1g、NaH2PO4 1g、MgS04·7H2O 0.5g、胶体几丁质10g、琼脂18g、蒸馏水1000mL，pH7.1-7.4。

　　将里氏木霉H-LS在PDA固体培养基上28℃培养5d，制备直径为5mm的菌饼，接种于产几丁质酶培养基平板中心，28℃避光倒置7d中，观察培养基上有无水解圈。

　　结果发现里氏木霉H-LS可在产几丁质酶培养基上生长，产生大量孢子，菌落周围有水解圈产生，说明其具有产几丁质酶的能力。

　　木霉菌可以寄生许多其他种类真菌，是木霉菌可以作为植物病原菌生防因子的重要原因之一，木霉菌在重寄生过程中能够产生多种真菌细胞壁降解酶，其中以几丁质酶最为重要。几丁质酶不仅是木霉菌完成重寄生病原细胞的重要功能因子，也是诱导宿主植物产生防御反应的重要激发子。

　　二、里氏木霉H-LS对植物病原真菌的拮抗能力

　　将表1中的病原真菌和里氏木霉H-LS活化后，分别制备直径为5mm的菌饼，采用对峙法将里氏木霉H-LS和病原真菌菌饼分别转接至PDA平板，相隔45mm。设单独接种植物病原菌菌饼为对照，28℃培养7d，测量植物病原菌菌落直径并计算抑菌率(％)，每处理4次重复。对峙培养抑制率＝[(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径]×100％。

　　结果见表1。结果表明：里氏木霉H-LS对供试的10株病原真菌均有明显的抑制作用，而且同时发现里氏木霉H-LS还可重寄生于这些病原菌菌落上。

　　表1、里氏木霉H-LS对植物病原真菌的抑制率

　　实施例4、里氏木霉H-LS的杀线虫能力测定

　　1、菌株发酵液的制备

　　PDB液体培养基：马铃薯200g(煮烂过滤取滤液)、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，pH自然。

　　将里氏木霉H-LS接种到250mL的三角瓶中，每瓶含有PDB液体培养基150mL，25-28℃、160rpm震荡7d，得到发酵液。用发酵液及其10倍稀释液分别处理番茄根结线虫(Meloidogyne spp.)，测定里氏木霉H-LS发酵液对根结线虫的杀虫能力。

　　2、杀线虫能力测定

　　在无菌的细胞培养板上，分别向孔中加入不同浓度的发酵液1mL，并以无菌水作为对照，然后分别向处理组和对照组中加入100ul线虫悬浮液(100条线虫)，放在室温下24h，观察根结线虫的死亡情况并计算矫正死亡率(即为杀线虫效果)。每个处理24次重复。矫正死亡率(％)＝(处理线虫死亡率-对照线虫死亡率)/(1-对照线虫死亡率)*100％。

　　通过上述实验测定里氏木霉H-LS发酵液处理24h对根结线虫的毒力效果，结果表明：里氏木霉H-LS发酵液对线虫有明显的防治效果，发酵液处理根结线虫的矫正死亡率为97％，发酵液稀释10倍后防治效果有所降低，矫正死亡率为74％。

　　实施例5、里氏木霉H-LS的固态发酵菌剂(里氏木霉H-LS菌肥)制备

　　本发明将河流湖泊秋冬时节亟待处理的枯萎芦苇制备草粉和廉价农副产品(麦麸和米糠)作为发酵基质进行发酵，生产多功能里氏木霉H-LS菌肥，具体制备方法如下：

　　1、孢子液的制备

　　将里氏木霉H-LS在PDA固体培养基上28℃培养5d，用灭菌蒸馏水冲洗孢子，制成菌浓度为1×106/mL的孢子液，备用。

　　2、发酵物料的制备及灭菌

　　将芦苇草粉(是在冬季将枯萎的芦苇收割、晒干后进行粉碎后得到的)、麦麸(是重庆市荣昌区西部饲料兽药市场的产品)和米糠(是重庆市荣昌区西部饲料兽药市场的产品)作为发酵基质按照质量比为3:2:1的比例混匀，然后添加葡萄糖1％、蛋白胨0.05％、磷酸氢二钾0.01％和自来水40％，得到发酵物料，121℃高压灭菌30min，冷却备用。

　　3、接种与发酵

　　将步骤1制备好的孢子液以7％(体积分数)的比率接种于步骤2制备好的发酵物料中，26-30℃静止培养10d，得到发酵产物，发酵产物产孢量高达6.3×109个/g。

　　4、将步骤3得到的发酵产物进行风干，直至含水量为15％以下(含水量具体可为10％)，即为里氏木霉H-LS菌肥。

　　实施例6、里氏木霉H-LS菌肥对立枯丝核菌引起的黄瓜病害和尖孢镰刀菌引起的黄瓜病害的防效

　　育苗基质：草炭:蛭石:珍珠岩＝3:1:1(体积比)；草炭是黑龙江桦美泥炭有限公司的产品，蛭石和珍珠岩均是河北省灵寿县京石矿产加工厂的产品。

　　黄瓜中农6号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。

　　立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)：ACCC 36124。

　　尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)：ACCC 43478。

　　一、里氏木霉H-LS菌肥对立枯丝核菌的防效

　　实验组：将每升育苗基质与10g实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥和0.5克立枯丝核菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：将每升育苗基质与0.5克立枯丝核菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。进行三次重复实验，每次重复实验每组72个植株。

　　播种15天后的照片见图2(圆圈内为发病植株的病症)。由立枯丝核菌引起的立枯病的发病症状为幼苗茎基部产生褐色病斑(初为水渍状，并很快扩展、溢缩变细如“线”样)，子叶尚未凋萎仍为绿色，从茎基部(或茎中部)突然倒伏而贴于床面，幼茎逐渐萎缩直至幼苗变褐枯死。

　　播种30天后，统计存活率(三组的平均值)。结果表明：实验组的存活率为72％，对照组的存活率为23％。

　　二、里氏木霉H-LS菌肥对尖孢镰刀菌引起的黄瓜枯萎病的防效

　　实验组：将每升育苗基质与10g实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥和0.5克尖孢镰刀菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：将每升育苗基质与0.5克尖孢镰刀菌菌体混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。进行三次重复实验，每次重复实验每组72个植株。

　　播种15天后的照片见图3(圆圈内为发病植株)。由尖孢镰刀菌引起的枯萎病的发病症状为受害幼苗萎蔫死亡(尖孢镰刀菌会侵染寄主植物的维管束系统，破坏植物的输导组织，并在植物生长发育代谢过程中产生毒素来危害作物，造成植物萎蔫死亡)。

　　播种30天后，统计存活率(三组的平均值)。结果表明：实验组的存活率为68％，对照组的存活率为27％。

　　实施例7、里氏木霉H-LS菌肥对盆栽番茄根结线虫的防效

　　育苗基质：草炭:蛭石:珍珠岩＝3:1:1(体积比)；草炭是黑龙江桦美泥炭有限公司的产品，蛭石和珍珠岩均是河北省灵寿县京石矿产加工厂的产品。

　　番茄中杂9号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。

　　实验组：将每升育苗基质与10g实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥混合后作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种番茄中杂9号的种子并常规管理。

　　番茄苗生长20d后，在番茄根系周边穴施根结线虫液10mL(2000头左右幼虫)，设自来水为空白对照。接种45d后，统计根际土壤中和番茄根中的线虫数量，计算根际土壤和番茄根中线虫减退率。

　　根际土壤中线虫减退率(％)＝(对照土壤中线虫数量-木霉处理组根际土壤中线虫数量)/对照土壤中线虫数量*100％。

　　根肿的线虫减退率(％)＝(对照根中线虫数量-木霉处理组根中线虫数量)/对照根中线虫数量*100％。

　　结果表明：实验组每100g根际土壤中线虫数量192条，对照组493条，木霉处理后根际土壤中线虫减退率61.05％；实验组每100g番茄根中线虫数量143条，对照组为627条，木霉施用后番茄根中线虫减退率达到77.19％。

　　实施例8、里氏木霉H-LS菌肥在番茄工厂化育苗中的应用

　　育苗基质：草炭:蛭石:珍珠岩＝3:1:1(体积比)；草炭是黑龙江桦美泥炭有限公司的产品，蛭石和珍珠岩均是河北省灵寿县京石矿产加工厂的产品。

　　番茄中杂9号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。

　　播种28天后的照片见图4。播种30天后，测量植株生长的各个参数(株高、茎粗、茎叶鲜重、根系鲜重、根体积)。进行三次重复实验，每次重复实验每组测量20株植株，结果取平均值。

　　结果见表2。结果表明：与对照组相比，实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥可明显提高番茄植株的株高、茎粗、茎叶鲜重、根系鲜重和根体积。

　　表2、播种30天后实验组和对照组植株的各个参数的测量结果

　　播种30天后，将各组的栽培基质风干，检测其中有效氮的含量、有效磷的含量和有效钾的含量。检测有效氮的含量的方法为碱解扩散法，检测有效磷的含量的方法为0.5mol/L碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法，检测有效钾的含量的方法为1mol/L醋酸铵浸提-火焰光度计法。具体测定步骤参照文献“杨剑虹，王成林，代亨林.土壤农化分析与环境监测[M].中国大地出版社，2008.182－184，282－290”中的方法。

　　结果见表3。结果表明：与对照组相比，实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥可明显提高栽培基质中有效氮、有效磷和有效钾的含量。

　　表3、里氏木霉H-LS菌肥对栽培基质中矿质元素含量的影响

　　实施例9、里氏木霉H-LS菌肥在黄瓜工厂化育苗中的应用

　　育苗基质：草炭:蛭石:珍珠岩＝3:1:1(体积比)；草炭是黑龙江桦美泥炭有限公司的产品，蛭石和珍珠岩均是河北省灵寿县京石矿产加工厂的产品。

　　黄瓜中农6号：中国农业科学院蔬菜花卉研究所。

　　实验组：将每升育苗基质与10g实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥混合后作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。对照组：采用育苗基质作为栽培基质，按照常规方法播种黄瓜中农6号的种子并常规管理。

　　播种28天后的照片见图5。播种30天后，测量植株生长的各个参数(株高、茎粗、茎叶鲜重、根系鲜重、根体积)。进行三次重复实验，每次重复实验每组测量20株植株，结果取平均值。

　　结果见表4。结果表明：与对照组相比，实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥可明显提高黄瓜植株的株高、茎粗、茎叶鲜重、根系鲜重和根体积。

　　表4、播种30天后实验组和对照组黄瓜植株的各个参数的测量结果

　　实施例10、里氏木霉H-LS菌肥在拉巴豆生产中的应用

　　拉巴豆品种为润高，是成都绿草园种业有限公司的产品。

　　供试土壤为采集于重庆市荣昌区田间的中性灰棕紫泥(质地沙壤)。

　　实验组：盆栽试验，每钵装土3.5kg，拌入实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥10g。对照组：每钵装土3.5kg，未拌入任何菌肥。按照常规方法播种拉巴豆种子并常规管理。

　　播种60天后的照片见图6。播种60天后测量植株生长指标(株高、叶长、叶宽、根长、根鲜重、茎叶鲜重)、饲用营养成分(干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、钙、磷)含量及土壤有效养分的含量(mg/kg)。检测干物质(DM)的方法为烘箱干燥法，105℃烘干至恒重。检测粗蛋白(CP)的方法为半微量凯氏定氮法。检测粗脂肪(EE)的方法为索氏提取法。检测粗纤维(CF)的方法为酸碱消煮法。检测钙(Ca)的方法为高锰酸钾滴定法。检测磷(P)的方法为钼锑抗比色法。具体测定步骤参照文献“张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术.第3版.北京：中国农大出版社，2007:1-435.”中的方法。

　　结果见表5和表6。结果表明：与对照组相比，实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥可以显著促进拉巴豆的生长，提高其饲用营养成分含量，并且有助于土壤中难降解养分的转化，改善土壤养分状况。

　　表5、实验组和对照组拉巴豆植株生长和饲用营养成分的测量结果

　　表6、播种60天后实验组和对照组土壤有效养分的含量(mg/kg)

　　实施例11、里氏木霉H-LS菌肥在菊苣生产中的应用

　　菊苣品种为将军，是百绿草业有限公司的产品。

　　供试土壤为采集于重庆市荣昌区田间的中性灰棕紫泥(质地沙壤)。

　　实验组：盆栽试验，每钵装土3.5kg，拌入实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥10g。对照组：每钵装土3.5kg，未拌入任何菌肥。按照常规方法播种菊苣种子并常规管理。

　　播种60天后的照片见图7。播种60天后测量植株生长指标(株高、叶长、叶宽、分枝数、根鲜重、草鲜重)和饲用营养成分(干物质、粗灰分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、钙)含量。检测干物质(DM)的方法为烘箱干燥法，105℃烘干至恒重。检测粗灰分的方法为550℃灼烧法。检测粗蛋白(CP)的方法为半微量凯氏定氮法。检测粗脂肪(EE)的方法为索氏提取法。检测粗纤维的方法为酸碱消煮法。检测钙(Ca)的方法为高锰酸钾滴定法。具体测定步骤参照文献“张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术.第3版.北京：中国农大出版社，2007:1-435.”中的方法。

　　结果见表7。结果表明：与对照组相比，实施例5制备的里氏木霉H-LS菌肥可以显著促进菊苣的生长，提高其饲用营养成分含量。

　　表7、木霉菌剂对菊苣生长指标和饲用品质的影响

　　以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

　　序列表

　　<110>西南大学

　　<120>一株多功能里氏木霉及其应用

　　<160>1

　　<170>PatentIn version 3.5

　　<210>1

　　<211>605

　　<212>DNA

　　<213>Artificial Sequence