一种多功能复合生物肥料的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物肥料领域，尤其涉及一种多功能复合生物肥料的制备方法及其应用。
背景技术
枯草芽孢杆菌(Bacillus%20subtilis)，是芽孢杆菌属的一种，革兰氏阳性菌，无荚膜，周生鞭毛，能运动，有芽孢，且芽孢椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。枯草芽孢杆菌耐热抗逆性强，当其施用于土壤中时，能够在土壤中或植物根际定殖，在培肥地力，提高化肥利用率，抑制农作物对硝态氮、重金属、农药的吸收，净化和修复土壤，降低农作物病害发生，促进农作物秸秆和城市垃圾的腐熟利用以及提高农作物产品品质和食品安全等方面表现出不可替代的作用。
然而，在枯草芽孢杆菌作为微生物肥料时，由于实际应用的自然环境条件苛刻，影响枯草芽孢杆菌的定殖能力，从而削弱其在土壤中的有益作用。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种多功能复合生物肥料的制备方法及其应用，该方法制备的多功能复合生物肥料大大提高了枯草芽孢杆菌在土壤中的存活能力，使之更长久地发挥它的功效。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种多功能复合生物肥料的制备方法，其包括以下步骤：
S1、将枯草芽孢杆菌接入液体活化培养基中，28℃-30℃培养，得到活化的枯草芽孢杆菌菌液；
S2、将灭菌的0.1-0.2mol/L的磷酸氢二钾溶液与所述活化的枯草芽孢杆菌菌液等体积混合，得混合液，然后一边搅拌一边将混合液缓慢滴加到0.5-2倍混合液体积的灭菌的0.1mol/L氯化钙溶液中，静置0.5-1h后，形成含枯草芽孢杆菌和磷酸氢钙的悬浊液，即液体多功能复合生物肥料。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述活化的枯草芽孢杆菌菌液中活菌浓度为5×108-8×109cfu/mL。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述多功能复合生物肥料的制备方法还包括步骤S3，将步骤S2制得的含枯草芽孢杆菌和磷酸氢钙的悬浊液进行干燥，得到粉状固体多功能复合生物肥料。
进一步，优选的，所述干燥是用喷雾干燥塔干燥，干燥塔各参数设置为进风温度120-180℃，出风温度60-90℃，雾化器转速30-50Hz，进料流量0.3-0.6m3/h，负压100-250Pa。
第二方面，本发明还提供了第一方面所述方法制备的液体多功能复合生物肥料或固体多功能复合生物肥料在改良土壤和促进作物生长中的应用。
本发明的多功能复合生物肥料的制备方法及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明制备方法制备的多功能复合生物肥料包含枯草芽孢杆菌和磷酸氢钙，施加到土壤中可提高枯草芽孢杆菌在土壤环境中的耐受性，使枯草芽孢杆菌存活能力得到提高，从而更持久更好地发挥枯草芽孢杆菌的功效；
(2)本发明制备的多功能复合生物肥料中的磷酸氢钙可改良酸性土壤，使之呈中性或接近中性，不仅适于枯草芽孢杆菌生长，也适于作物生长；
(3)本发明多功能复合生物肥料的制备方法将枯草芽孢杆菌菌液和磷酸氢二钾溶液的混合液逐渐滴加到氯化钙溶液中，在形成磷酸氢钙沉淀的过程中枯草芽孢杆菌被均匀包埋在磷酸氢钙里，可提高在干燥过程中枯草芽孢杆菌的耐热性，从而达到好的制备效果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实验用的枯草芽孢杆菌B168由华中农业大学生命科学技术学院惠赠。实验所用的pGFP4412质粒购买于上海钦诚生物科技有限公司。感受态细胞制备、转化、质粒提取详细步骤见分子克隆实验指南。
实施例1、液体多功能复合生物肥料的制备
S1、枯草芽孢杆菌的绿色荧光标记
将pGFP4412质粒干粉先5000rpm离心1min，再加入20μL无菌水溶解，室温放置1min备用。将2μL质粒DNA转化到100μL制备好的感受态枯草芽孢杆菌B168细胞中，涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB抗性平板。培养12h后，挑取平板上的单菌落，抽提质粒DNA跑胶验证，并置于荧光显微镜下验证枯草芽孢杆菌重组子发绿色荧光，得到带绿色荧光标记的枯草芽孢杆菌B168-gfp。
S2、制备液体多功能复合生物肥料
挑取一环荧光标记枯草芽孢杆菌B168-gfp接入100mL%20LB液体培养基中，28℃，180r/min，培养12h后，活化的枯草芽孢杆菌B168-gfp菌液浓度为5×108cfu/mL。
配制0.1mol/L磷酸氢二钾溶液和0.1mol/L氯化钙溶液，121℃灭菌20min。将上述枯草芽孢杆菌B168-gfp菌液与0.1mol/L磷酸氢二钾溶液等体积混合，得混合液，然后一边搅拌一边将混合液缓慢滴加到0.5倍混合液体积的0.1mol/L氯化钙溶液中，静置0.5h后，形成含枯草芽孢杆菌和磷酸氢钙的悬浊液，即液体多功能复合生物肥料。
实施例2、液体多功能复合生物肥料的制备
提取一环实施例1步骤S1中构建的枯草芽孢杆菌B168-gfp接入100mL%20LB液体培养基中，30℃，200r/min，培养16h后，活化的枯草芽孢杆菌B168-gfp菌液浓度为8×109cfu/mL。
配制0.2mol/L磷酸氢二钾溶液和0.1mol/L氯化钙溶液，121℃灭菌20min。将上述枯草芽孢杆菌B168-gfp菌液与0.2mol/L磷酸氢二钾溶液等体积混合，得混合液，然后一边搅拌一边将混合液缓慢滴加到2倍混合液体积的0.1mol/L氯化钙溶液中，静置1h后，形成含枯草芽孢杆菌和磷酸氢钙的悬浊液，即液体多功能复合生物肥料。
实施例3、固体多功能复合生物肥料的制备
将实施例1步骤S2制备的含枯草芽孢杆菌和磷酸氢钙的悬浊液用GL400型喷雾干燥塔进行干燥，干燥塔各参数设置为：进风温度120℃，出风温度60℃，雾化器转速30Hz，进料流量0.3m3/h，负压100Pa。喷雾干燥后得到枯草芽孢杆菌-磷酸氢钙复合体。
实施例4、固体多功能复合生物肥料的制备
将实施例2制备的含枯草芽孢杆菌和磷酸氢钙的悬浊液用GL400型喷雾干燥塔进行干燥，干燥塔各参数设置为：进风温度180℃，出风温度90℃，雾化器转速50Hz，进料流量0.6m3/h，负压250Pa。喷雾干燥后得到枯草芽孢杆菌-磷酸氢钙复合体。
实施例5、多功能复合生物肥料在土壤中施用效果研究
采集公司周边土样，分装在12个花盆里，每盆装10kg土，设置4组，分别为施加实施例1的液体多功能复合生物肥料试验组(200mL/盆)、施加实施例3的固体多功能复合生物肥料试验组(10g/盆)、施加枯草芽孢杆菌B168-gfp菌液试验组(100mL/盆)和不作任何处理的对照组，每组3个重复，将土搅拌均匀，施加多功能复合生物肥料后0d、5d、10d、15d、20d、25d、30d采集各组土样，检测土样pH值，并用LB抗性培养基对采集土样中的标记菌株稀释平板计数和荧光观察，试验结果见表1。
表1试验期间不同处理土样中pH及标记菌株B168-gfp菌数的变化
由表1可看出，单纯只施加枯草芽孢杆菌菌液的土壤里菌数在第15天达到峰值6.3×107cfu/mL，之后就呈下降趋势，到第30天菌数只有5×106cfu/mL，比投菌当天下降了将近10倍；而施加多功能复合生物肥料的两组土样中标记菌株含量在5天内有小幅下降，但其后一直到第20天都在不断增殖，再后来菌数才有缓慢下降，到第30天仍保持比较高的菌含量，施加液体多功能复合生物肥料的土壤中标记菌株含量达到5.9×107cfu/mL，施加固体多功能复合生物肥料的土壤中标记菌株含量为5.8×107cfu/mL。另一方面，施加多功能复合生物肥料的土壤从开始pH6左右，到第15-20天，pH可达到7左右，并维持在这个中性水平。由此可说明，本发明多功能复合生物肥料可改良酸性土壤，使之呈中性或接近中性，并提高了枯草芽孢杆菌在土壤环境中的耐受性，使枯草芽孢杆菌存活能力得到提高，从而能够更持久地发挥其功效。
实施例6、多功能复合生物肥料对作物产量影响研究
本发明将多功能复合生物肥料施于小白菜上进行盆栽试验，设置3组，分别为施加实施例2的液体多功能复合生物肥料试验组(200mL/盆)、施加实施例4的固体多功能复合生物肥料试验组(10g/盆)和不作任何处理的对照组，每组设置10盆，多功能复合生物肥料采用穴施，并与根周围土壤拌匀后覆盖土壤。60天后检测小白菜生长情况，多功能复合生物肥料对小白菜产量影响试验结果如表2。
表2试验期间不同处理土壤中小白菜的长势情况
由表2可看出，施加液体多功能复合生物肥料和固体多功能复合生物肥料60天后小白菜株高分别达到17.3cm和16.8cm，相比对照组分别增长了32.1％和28.2％；并且小白菜每株鲜重也分别增长了42.4％和44.0％。施加多功能复合生物肥料后，生物肥料中的磷酸氢钙可以调节土壤pH，更适宜小白菜生长，其释放的无机盐钙离子还能促进小白菜吸收利用；同时，枯草芽孢杆菌与小白菜根系相互作用，枯草芽孢杆菌合成并分泌活性物质促进小白菜生长，并且能抑制病原菌生长从而减少小白菜病虫害的发生，因此，多功能复合生物肥料促进了小白菜的生长，提高了产量。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
