当前位置：首页 > 化学技术 > 肥料制造> 球形赖氨酸芽孢杆菌SY50及其应用独创技术19505字

球形赖氨酸芽孢杆菌SY50及其应用

2021-02-05 13:54:14

球形赖氨酸芽孢杆菌SY50及其应用

　　技术领域

　　本发明涉及农业微生物学，具体地说，涉及一株球形赖氨酸芽孢杆菌SY50及其应用。

　　背景技术

　　植物在生长发育过程中一直与土壤微生物保持共生的关系。共生的土壤微生物生存在许多不同的植物根际周围，对宿主植物有很多有益的影响，它们通过不同的作用机制竞争性的定殖在植物根系，促进植物生长包括解磷、固氮、产生吲哚-3-乙酸(IAA)、铁载体、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶和氰化氢；降解环境污染物，产生激素、抗生素和细胞溶解酶等。此外，一些PGPR还可以通过其他方式促进植物生长如钝化重金属、促进植物耐盐性、防治植物病原体和昆虫等。

　　球形赖氨酸芽孢杆菌在农业农村部菌种安全分级目录中，现有的一些在农业方面的报道主要有降解农药残留(滕春红等，2013；胡桂萍等，2014)，拮抗病原菌(陆铮铮等，2014)；还有一些其它方面的应用，如介导形成白云石的能力、控制白酒中的氨基甲酸乙酯等。未发现有在促进植物生长和溶解难溶性磷和产酶方面的研究报道，本发明对于球形赖氨酸芽孢杆菌在农业上的应用具有重要意义。

　　发明内容

　　本发明的目的是提供一株球形赖氨酸芽孢杆菌SY50及其应用。

　　为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供从河北省邢台市威县根力多生物科技股份有限公司试验示范基地采集的土壤中分离出的一株耐盐的球形赖氨酸芽孢杆菌SY50(Lysinibacillus sphaericus SY50)，菌株SY50不仅能大量溶解难溶性的无机磷和有机磷，还可以产生很多其它促生物质，包括生长素(IAA)、纤维素酶、蛋白酶、噬铁素等。该菌现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC NO：M 2019841，保藏日期2019年10月21日。

　　第二方面，本发明提供含有所述球形赖氨酸芽孢杆菌SY50的菌剂。

　　第三方面，本发明提供由所述球形赖氨酸芽孢杆菌SY50分泌产生的促生物质，如IAA等。

　　第四方面，本发明提供由所述球形赖氨酸芽孢杆菌SY50分泌产生的酶，所述酶包括但不限于纤维素酶、蛋白酶。

　　第五方面，本发明提供由所述球形赖氨酸芽孢杆菌SY50分泌产生的嗜铁素，

　　第六方面，本发明提供由所述球形赖氨酸芽孢杆菌SY50或其菌剂制备的农用肥料、磷素活化剂、植物促生长剂、重金属污染降解剂或铁螯合剂。

　　第七方面，本发明提供所述球形赖氨酸芽孢杆菌SY50或其菌剂的以下任一应用：

　　1)用于促进植物生长发育以及提高作物产量；

　　2)用于提高植物抗逆性；

　　3)用于溶磷；

　　4)用于重金属污染修复；

　　5)用于制备农用肥料；

　　6)用于制备磷素活化剂；

　　7)用于制备植物促生长剂；

　　8)用于制备重金属污染降解剂；

　　9)用于制备铁螯合剂。

　　本发明中所述植物包括但不限于玉米、小麦、大豆、黄瓜。

　　所述重金属包括铁。

　　所述提高植物抗逆性是指提高植物体抗病、抗旱、抗重金属毒害等抗逆性。

　　第八方面，本发明提供所述球形赖氨酸芽孢杆菌SY50或其菌剂在溶解难溶磷中的应用。

　　前述的应用，所述难溶磷包括难溶性无机磷(如磷酸钙)和难溶性有机磷(如植酸钙、卵磷脂)。

　　借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

　　本发明提供的耐盐球形赖氨酸芽孢杆菌SY50，该菌不仅能大量溶解难溶性的无机磷和有机磷，还可以产生IAA、蛋白酶、纤维素酶和嗜铁素等多种促生物质。以玉米(郑单958)为例，菌株SY50对植物的促生效果明显，可以使玉米苗茎高增加32.49％，茎鲜重增加39.43％，茎干重增加32.69％，根鲜重增加32.49％，根干重增加30.36％。菌株SY50应用在农作物种植中不仅能提高农作物产量，还能提高植物体抗病、抗旱等抗逆性，对我国粮食持续增产和保护农田生态环境具有重要意义。

　　附图说明

　　图1为本发明实施例2中菌株SY50的溶磷能力测定结果(无机磷溶解圈)。

　　图2为本发明实施例2中菌株SY50的溶磷能力测定结果(有机磷溶解圈)。

　　图3为本发明实施例3中菌株SY50产蛋白酶的能力测定结果。

　　图4为本发明实施例5中菌株SY50产纤维素酶能力的测定结果。

　　图5为本发明实施例6中菌株SY50产嗜铁素能力的测定结果。

　　图6为本发明实施例8中菌株SY50的植物促生效果。

　　图7为本发明实施例1中菌株SY50的16S rRNA基因的分子进化树。

　　具体实施方式

　　以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

　　实施例1菌株SY50的分离及鉴定

　　从河北省邢台市威县根力多生物科技股份有限公司试验示范基地采集土壤，取10g土样加入内装100ml无菌生理盐水的三角瓶中，静止20min后，28℃，200rpm摇床震荡30min，取1ml样本加入9ml无菌生理盐水中，再依次稀释102，103，104倍，分别取以上土壤悬浮液100μl在LB培养基(酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂15g/L)平板上均匀涂板，28℃培养箱内培养48h，用无菌牙签挑取细菌单菌落划线纯化后，保存备用。

　　综合菌株SY50的生理生化特性、分子生物学检测结果，将其鉴定为球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)。具体鉴定结果如下：

　　1、分子生物学鉴定

　　首先对菌株SY50进行分子生物学的鉴定，使用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′和1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3＇扩增其16S rRNA基因序列，并进行测序，测序结果如SEQ ID NO：1所示。

　　PCR反应体系为：2×Taq Mix 12.5μl，引物27F、1492R各1μl，DNA模板1μl，ddH2O9.5μl。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸5min。其中，Taq Mix购自TaKaRa公司。

　　PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，用OMEGA公司的纯化试剂盒GelExtraction Kit纯化回收后连接TaKaRa公司的T载体pMD18-T。用ABI 3730DNA测序仪进行测序，基因序列已提交至GenBank，收录号：MN559041。将序列用GEGA5进行分子进化树分析(图7)，根据进化树初步将SY50判定为球形赖氨酸芽孢杆菌。

　　2、生理生化特性鉴定

　　在分子生物学检测的基础上，对菌株SY50进行生理生化鉴定，首先对其进行革兰氏染色，结果显示菌株为革兰氏阳性；将菌活化后接种到NaCl浓度为7％的LB培养基中，28℃培养48h，结果未见菌株生长；在干净培养皿里放一张滤纸，滴加1％二甲基对苯撑二胺水溶液，仅使滤纸湿润。用白金丝接种环挑取一环菌苔，涂抹在湿润的滤纸上。在10秒内涂抹的菌苔出现红色，表明菌株SY50氧化酶阳性；将菌活化后接种于硝酸盐液体培养基中，30℃培养1、3、5天，在白色磁盘小孔中倒入少许培养液，然后在其中分别滴1滴试剂A(对氨基苯磺酸0.5g溶于10％醋酸150mL)和试剂B(α-萘乙酸0.1g，溶于蒸馏水20mL和10％醋酸150mL)，结果培养液未变色，表明菌株SY50硝酸盐还原阴性；将菌株接种于明胶培养中，20℃培养7天，培养基出现融化现象表明明胶水解阳性；用枪头挑取单菌落放在载玻片上，加一滴3％的H2O2溶液于菌落上，有气泡出现，表明菌株接触酶阳性；将菌株活化后接种于芽孢杆菌糖发酵培养基，试验结果显示菌株SY50不能利用蔗糖和D-木糖发酵产酸；将SY50接种于甲基红培养基(蛋白胨5g，葡萄糖5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.2)30℃培养1-2天。在培养基中加入几滴甲基红试剂，如培养液呈现红色，为甲基红阳性，黄色为阴性。试验结果显示菌株SY50为M.R.阴性；乙酰甲基甲醇(VP试验)培养基、接种和菌种培养同甲基红试验。做VP试验时，取培养液(约2ml)与等量的40％NaOH相混合，加少量肌酸，充分振荡2-5min后，如培养基出现红色，即为VP阳性。试验结果显示菌株SY50为VP阴性；活化后的菌株接种于添加0.1％的七叶灵和0.5％的柠檬酸铁的LB固体斜面培养基，适温培养3、7、14天观察，产黑褐色色素者为阳性，不产黑褐色素者为阴性。水解七叶灵试验结果显示菌株SY50为阴性；硫化氢产生试验：配制试管斜面培养基(蛋白胨10g，胱氨酸0.1g，硫酸钠0.1g，蒸馏水1000ml，pH7.0-7.4)，将普通滤纸剪成0.5-1cm宽的纸条，用5％-10％的醋酸铅将滤纸浸透，然后用烘箱烘干。将活化后的菌株接种于试管斜面，接种后，用无菌镊子夹取一条滤纸条用棉塞赛紧，使悬挂于试管中，下端接近培养基表面，不接触液面，适温培养，于接种后3、7、14天观察，纸条变黑者为阳性，不变者为阴性。硫化氢的产生试验结果显示菌株SY50为阴性；产生吲哚试验：将活化后的菌种接种于1％胰胨水液体培养基，取适温培养1、2、4、7的培养液，沿管壁缓缓加入3-5毫米高的对二甲基氨基苯甲醛试剂(对二甲基氨基苯甲醛溶液8g，95％酒精760ml，浓盐酸160ml)于培养液表面，在液层界面发生红色，即为阳性反应。产生吲哚试验结果显示菌株SY50为阴性。菌株SY50的生理生化检测结果如表1所示。根据进化树和生理生化结果可以将SY50判定为球形赖氨酸芽孢杆菌。

　　表1球形赖氨酸芽孢杆菌SY50的生理生化特性

　　实施例2菌株SY50的溶磷能力测定

　　首先将菌株SY50在LB培养基上活化。将活化后的菌株接种到NY/T 1847-2010中附录A所示溶磷培养基中(葡萄糖10.00g，(NH4)2SO4 0.50g，MnSO4·7H2O 0.3g，NaCl 0.3g，KCl0.30g，FeSO4·4H2O 0.036g，MnSO4·4H2O 0.03g，蒸馏水1000mL，pH 7.0。无机磷源选用磷酸钙，添加量10g；有机磷源选用植酸钙，添加量2g。固体培养基：按比例添加1.5％的琼脂粉)。检测是否具有溶磷功能，经检测，菌株SY50同时具有溶解无机磷和有机磷的能力，其中溶解无机磷的溶解圈直径达到1.21cm(图1)，溶解有机磷的溶解圈直径达到1.52cm(图2)。分离到的其它解磷菌如枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等解磷能力均不如球形赖氨酸芽孢杆菌SY50。

　　在确定了菌株具有溶磷功能之后，再定量测定菌株的溶磷能力大小，将菌株在LB液体培养基上活化后，接种到液体的溶磷培养基上，28℃摇培7天，用钼锑抗比色法测定发酵上清液中的有效磷含量，取100μl上清液，放入50ml容量瓶中，用水稀释至约30ml，加入二硝基酚指示剂2滴，滴加4mol/L NaOH溶液直至溶液刚转为黄色，再加入1mol/L H2SO4 1滴，使溶液的黄色刚刚退去。加入5.00ml钼锑抗显色剂，用水定容，充分摇匀。在室温高于15℃处放置30min后，取200μl加至96孔板，用酶标仪在882nm波长处测量吸光度。

　　结果显示，菌株SY50溶解无机磷的能力达到386.51mg/L，溶解有机磷的能力达到101.42mg/L。

　　实施例3菌株SY50产蛋白酶的能力测定

　　首先将菌株SY50在LB培养基上活化，将活化后的菌株接种到蛋白酶检测用培养基上(胰蛋白胨5.00g，酵母提取物3.00g，葡萄糖1.00g，琼脂15.00g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压灭菌30min。将灭菌的检测培养基冷却至约50℃时，将脱脂牛奶按10％的比例加入培养基混匀后倒入培养皿，待其冷却后备用)，28℃培养48h，观察有无溶解圈出现，结果显示SY50具有很好的溶解蛋白的能力，高产蛋白酶，其溶解圈直径达到4.10cm(图3)。利用菌株SY50高产蛋白酶的特性，可将提取的蛋白酶应用于食品工业或者洗涤工业等蛋白酶领域，同时也可以用于农业上微生物肥料中对病原菌细胞膜降解以控制病害，以及堆肥中农业废弃物中蛋白质的降解。

　　实施例4菌株SY50产IAA能力的测定

　　首先将菌株SY50在LB液体培养基上进行活化，将活化后的菌株按照1％的量接种于DF+培养基中(蛋白胨5.00g，酵母提取物1.50g，牛肉膏1.50g，NaCl 5.00g，色氨酸0.50g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min)。28℃摇培7天，7天后，将发酵液取出，12000rpm离心5min，用Salkowkin比色法测定发酵液中IAA的含量。结果显示菌株SY50产IAA的量为9.72mg/L。通过HPLC检测，进一步分析确认菌株合成的为IAA，菌株培养7天后，12000rpm离心5min，取上清30mL，用两倍体积乙酸乙酯在恒温振荡器中充分萃取3次，合并萃取液用乙酸乙酯减压蒸馏器蒸馏，然后用5mL甲醇溶解、定容，经过0.22um滤膜过滤。参考文献(连翠飞，蒋继志，李社增，鹿秀云，晁春燕，马平.利用高效液相色谱筛选产植物激素细菌[J].华北农学报，2006(02)：66-69；高桂枝，徐爱军，虞梅，苑姗姗.高效液相色谱切变波长法测定艾蒿中内源激素[J].现代农业科技，2007(03)：9-11)中的方法进行样品检测。检测仪器：waters2998高效液相色谱，色谱柱：Agilert Zorbax SB-C18 250mm×4.6mm，5um。流动相，甲醇∶乙腈∶0.6％冰乙酸水溶液(体积比50∶5∶45)。进样量：20μl。流速0.8mL/min。柱温：室温。检测波长：255nm。检测结果为9.90mg/L，略高于比色法检测结果。

　　实施例5菌株SY50产纤维素酶能力的测定

　　首先将菌株SY50在LB培养基上进行活化，将活化后的菌株接种到纤维素检测用培养基上(MgSO4·7H2O 0.25g，K2HPO4 0.50g，羧甲基纤维素1.88g，琼脂15.0g，蒸馏水1000mL，pH 7.0，121℃高压灭菌30min)。28℃培养7天，7天后每个平板中加入0.2mg/mL刚果红染液5mL，染色1h，弃去刚果红染液后，加入1M NaCl洗涤1h，弃去洗涤液，观察菌落周围水解圈的产生，出现水解圈表明纤维素酶的产生。结果显示SY50具有很好的溶解纤维素的能力，其溶解圈直径达到5.82cm(图4)。SY50高产纤维素，可以降解病原真菌细胞壁，控制病害，也可以用于堆肥中纤维素的分解。

　　实施例6菌株SY50产嗜铁素能力的测定

　　首先将菌株SY50在LB培养基上进行活化，将活化后的菌株接种于含CAS蓝色检测液的培养基中培养(将一定量的CAS蓝色检测液加入到酸水解酪蛋白和其它的无机盐组成的缺铁复杂培养基中，制成蓝色的检测平板)。若细菌产生嗜铁素，螯合培养基中的铁(三价铁)，则菌落周围产生黄色晕圈。结果显示SY50具有很好地螯合铁的能力。晕圈直径达到1.85cm(图5)。SY50会富集一部分铁离子到植物根部，促进植物对铁的吸收吸收。

　　实施例7菌剂制备

　　1、菌种活化

　　首先将菌株SY50在LB培养基上进行活化。将菌株SY50接种于LB液体培养基中，28℃培养12h。

　　2、种子液的培养

　　种子培养基组成为：蛋白胨15g/L，酵母膏8g/L，葡萄糖12g/L，NaCl 10g/L，pH值为7.2。将活化好的菌株SY50以1.2％的接种量接种于种子液体培养基中，28℃摇床震荡培养，转速为200rpm，培养时间为12h。

　　3、发酵罐发酵

　　发酵培养基组成为：玉米浆12g/L，玉米粉8.5g/L，酵母膏1.8g/L，蛋白胨2.0g/L，葡萄糖2.0g/L，KH2PO4 0.6g/L，MgSO4·7H2O 0.06g/L，MnSO4·7H2O 0.018/L，CaCO3 4g/L，聚醚消泡剂1.2g/L，pH值为7.2。将培养好的种子液OD600达到4.00时按5％的接种量接入发酵罐中，28℃，搅拌速度为180rpm，调节通风量保证在溶氧60％以上、罐压0.05MPa。发酵36h菌量可以达到1010cfu/ml，待芽孢量达到95％以上时停止发酵，降温放罐，通过对发酵培养基配方进行优化，得到球形赖氨酸芽孢杆菌SY50的1010cfu/mL菌液，IAA的产量由9.9mg/L提高到16.3mg/L，可以根据需求制成固体或者液体菌剂。

　　实施例8菌株SY50的植物促生试验

　　选取饱满、健康玉米(郑单958)种子消毒、清洗、浸泡后放入28℃生化培养箱培养催芽24h左右。将供试菌株从平板挑取单菌落于LB液体培养基中进行活化，将活化后的菌液按1％的接菌量接种于LB培养基中，28℃，150rpm摇培72h并将菌液稀释106cfu/mL。每个花盆中添加100ml稀释后的菌液，每个花盆使用低磷土，并按照0.5％添加磷酸钙。同时用LB培养基做空白对照(CK)，生长30天后测定玉米幼苗茎高、茎鲜重、茎干重、根干重。

　　结果显示菌株SY50具有很好地促生效果(图6)。可以使玉米苗茎高增加32.49％，茎鲜重增加39.43％，茎干重增加32.69％，根鲜重增加32.49％，根干重增加30.36％(表2)。

　　表2菌株SY50对玉米的促生效果