解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.17844及其应用
技术领域
本发明涉及微生物及肥料领域，尤其涉及解淀粉芽孢杆菌及其应用，具体涉及一株解 淀粉芽孢杆菌(保藏编号CGMCC No.17844)、微生物菌剂、复合菌剂、肥料及防治根腐病的方法。
背景技术
草莓易于栽培、当年结果、口感优良、产量高、经济效益好，在国内、国际市场上具有重要的经济地位。但是，随着草莓种植面积的扩大，栽培品种多，也出现了长年连作、 病害逐年加重现象，且长期施用不足或未经完全腐熟的畜禽粪便作为底肥，带入病原菌、 影响土壤养分平衡。同时，农户草莓苗来源多变，草莓苗仅采购部分无菌苗，大部为经脱 毒处理，无法科学预防种苗带病问题，使得重茬病害现象严重，尤其是根腐病易爆发，难 根治，叶片、根系受损，造成产量和品质受影响。连作导致土壤理化性质改变，其土壤盐 含量升高、板结严重，影响根系生长。草莓根腐病发病受连作年限、种植地域，草莓苗质 量的影响，目前应对草莓根腐病主要通过闷棚、翻地、控温、控湿等物理手段，使用苯并 咪哇类保护性杀菌剂等化学手段，以及使用具有抗重寄生、抗病、诱导产生抗病性功能的 生物制剂进行生物防治。但物理手段效果较差、化学手段容易造成二次污染，生物手段因 环境友好、抗病针对性强，是防治草莓根腐病病害的优良手段。
但是，针对根腐病的生物手段治疗还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个 目的在于提出一种解淀粉芽孢杆菌、微生物菌剂、复合菌剂、肥料及防治根腐病的方法。
解淀粉芽孢杆菌是一种广泛分布于大自然中的革兰氏阳性菌，具有很强应用潜力。将 解淀粉芽孢杆菌施入土壤或水体中，能够降解自然界中一些有毒物质，净化被污染的土壤 和河流湖泊。解淀粉芽孢杆菌又是典型的植物促生菌，能够分泌抗菌蛋白、抗生素、酶或 多肽等活性物质，促进植物生长，防治植物真菌病害。由于解淀粉芽孢杆菌能够分泌多种 抗菌活性物质，对果蔬表面的病菌有广泛的抗性，能够解决果蔬保鲜和长期储存问题。解 淀粉芽孢杆菌的这些优良特性在环境保护、农业生产方面都有很大应用潜力。本发明从草 莓根腐病株内分离到芽孢杆菌，通过形态学、生理生化特性及16S rRNA基因鉴定为解淀 粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)，经过实验室平皿拮抗实验、草莓盆栽试验、田间试验 验证，其表现出良好的促进草莓生长，预防草莓根腐病的效果，可以用于提升草莓产量和 品质。
具体而言，本发明提供了如下技术方案：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌，其保藏在中国普通微生物 菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.17844。本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌，从 连续多年种植草莓的大棚土壤中筛选获得。经过实验室平皿拮抗实验、草莓盆栽试验、田 间试验验证，通过形态学、生理生化特性及16S rRNA基因鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。其对拟盘多毛孢(P.clavispora)具有良好防治作用，对该病原菌的抑 制率均为80％以上。其能够抑制病原微生物拟盘多毛孢菌丝生长，减少孢子产生，可以将 其用于防治因拟盘多毛孢引发的根腐病，适应草莓种植过程中抗病需求。所提供的解淀粉 芽孢杆菌即可以作为微生物菌剂，也可以和其他菌剂复配制备复合菌剂，微生物菌剂或者 复合菌剂本身可以作为肥料或者加入肥料中使用，用来防治根腐病，使得作物的产量有了 显著增加，品质有了明显提升、口感更佳。以草莓为例，这种作物的产量和品质的提升可 以体现在单果重、亩产量和糖度等方面均有了很大提升。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括本发明第 一方面所述的解淀粉芽孢杆菌。
在本发明的一些实施例中，所述微生物菌剂为干粉状，每克所述微生物菌剂中含有所 述解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数至少为8×1010CFU，优选为1×1011CFU。将微生物菌剂 制备成干粉状，每克微生物菌剂中含有的有效活菌数在8×1010CFU以上，例如在1×1011CFU以上，优选为2×1011CFU以上，从而可以应用该微生物菌剂预防和治疗作物的根腐 病，快速高效治疗作物的根腐病，提高作物品质。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种制备微生物菌剂的方法，所述微生物菌剂为 本发明第二方面所述的微生物菌剂，所述方法包括：对所述解淀粉芽孢杆菌进行发酵处理； 基于所述发酵处理的产物，获得所述微生物制剂。通过对上述解淀粉芽孢杆菌进行发酵处 理，获得微生物菌剂，可以用于作物根腐病的防治，同时提高作物的品质和产量。
根据本发明的实施例，以上所述制备微生物菌剂的方法可以进一步包括如下技术特征：
在本发明的一些实施例中，所述发酵处理包括：将所述解淀粉芽孢杆菌进行液体发酵 培养，以便获得种子培养液；将所述种子培养液进行扩大发酵培养，以便获得所述发酵处 理的产物。
在本发明的一些实施例中，利用液体发酵培养基或者固体发酵培养基进行所述扩大发 酵培养；所述液体发酵培养基包括：8～15重量份蛋白胨，1～5重量份硫酸铵，2～5重量份 牛肉浸出粉，3～8重量份氯化钠，1～5重量份磷酸氢二钾，3～8重量份聚乙烯醇和1000重 量份水，所述液体发酵培养基的pH值为7～7.5；所述固体发酵培养基包括：3～10重量份的 麦麸，0.5～5重量份的豆粕，0.05～0.5重量份的硫酸镁，0.05～0.5重量份的氯化钠以及水。 应用该液体发酵培养基或者固体发酵培养基可以快速发酵获得微生物菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：将所述发酵处理的产物进行烘干粉 碎处理，获得粉末状的微生物菌剂。通过烘干粉碎处理，可以获得粉末状的微生物菌剂， 方便保存和使用。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌 剂和不同于所述第一微生物菌剂的第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为本发明第二方 面所述的微生物菌剂。通过不同的微生物菌剂进行复配，不同的微生物菌剂可以具有发挥 不同或者相同或者相似的功能，通过复配可以使得复合菌剂发挥多种作物疾病的预防和治 疗目的，提高作物品质。
在本发明的一些实施例中，所述第二微生物菌剂包括选自胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木 霉菌剂、土曲霉菌剂、解淀粉芽孢杆菌菌剂中的至少一种。这些微生物菌剂对于植物生长 有很大的促进作用，对于病原菌有较好的防治效果，因此与所提供的第一微生物菌剂复配， 可以进一步提高作物品质。
在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂包括1～3重量份的所述第一微生物菌剂，以 及选自下列中的至少一种：1～3重量份的胶质芽孢杆菌菌剂；1～3重量份的绿色木霉菌剂； 1～3重量份土曲霉菌剂；1～3重量份的解淀粉芽孢杆菌菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述复合菌剂包括1～1.5重量份的所述第一微生物菌剂，以 及选自下列中的至少一种：1～1.5重量份的胶质芽孢杆菌菌剂；1～1.5重量份的绿色木霉菌 剂；1～1.5重量份土曲霉菌剂；1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌菌剂。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种肥料，所述肥料包括本发明第二方面所述的 微生物菌剂或者本发明第四方面所述的复合菌剂。
在本发明的一些实施例中，所述肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料包括选自生 物有机肥、有机复合肥、无机复合肥或者有机无机复混肥中的至少一种，所述微生物菌剂 或者所述复合菌剂含量为所述基础肥料含量的1‰～5‰。
在本发明的一些实施例中，所述生物有机肥包括30～50重量份的发酵牛粪、20～40重 量份的炭基肥、10～30重量份的小分子有机料，和5～15重量份的硅酸钙。
在本发明的一些实施例中，所述生物有机肥包括40重量份的发酵牛粪、30重量份的 炭基肥和20重量份的小分子有机料，和10重量份的硅酸钙。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌 剂或者肥料中的应用，所述解淀粉芽孢杆菌为本发明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种防治根腐病的方法，包括：对植物施用有效 量的解淀粉芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者肥料，其中所述解淀粉芽孢杆菌为本发 明第一方面所述的解淀粉芽孢杆菌，所述微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂， 所述复合菌剂为本发明第四方面所述的复合菌剂，所述肥料为本发明第五方面所述的肥料。
在本发明的一些实施例中所述植物为草莓，所述根腐病为拟盘多毛孢引起的根腐病。
菌种保藏信息
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.17844，保藏单位 为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2019年05月22日。
附图说明
图1是根据本发明的实施例提供的棒状拟盘多毛孢菌落形态图片。
图2为根据本发明的实施例提供的棒状拟盘多毛孢(ZH-G01)ITS序列的系统发育树。
图3是根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844菌落形态图片。
图4为根据本发明的实施例提供的CGMCC No.17844拮抗病原菌的效果图片。
图5为根据本发明的实施例提供的解淀粉芽孢杆菌(CGMCC No.17844)16S rRNA序列的系统发育树。
具体实施方式
下面参考附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，所描述的实施例是示例性的， 旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本文中，如无特殊说明，当表述某种物质的含量时，是指的该物质的质量占总物质含 量的百分比。
本发明通过大量筛选工作得到一株能够防治草莓根腐病多种植物病害的解淀粉芽孢杆 菌菌株CGMCC NO.17844。实验证明，该解淀粉芽抱杆菌在防治草莓根腐病中显示出非常 高效的防治效果，而且该解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.17844菌株还具有一定的促生作用， 使得草莓产量显著增产。例如，可以将本发明的解淀粉芽抱杆菌菌株用于制备防治多种植 物病害的微生物肥料中。因而，本发明的解淀粉芽抱杆菌CGMCC NO.17844是具有广泛应用前景。
所提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844可以制备成微生物菌剂，作为单一菌剂使 用。为此，在本发明的一个方面，本发明提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844。所提供的微生物菌剂可以作为肥料或者治病药物应用于根腐病的防治中，能够防治病虫害，提高作物产量。
所提供的微生物菌剂可以通过发酵获得。为此，在本发明的另一个方面，本发明提供 了一种制备上述微生物菌剂的方法，包括：对解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844进行发酵处理；基于所述发酵处理的产物，获得所述微生物菌剂。
在本发明的至少一些实施方式中，所述发酵处理包括：将所述解淀粉芽孢杆菌进行液 体发酵培养，以便获得种子培养液；将所述种子培养液接种在固体发酵培养基中进行扩大 发酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。在至少一些实施方式中，可以利用LB培养液 进行所述液体发酵培养，所述液体发酵培养的时间为10小时以上，优选为10～16小时。在 本发明至少一些实施方式中，将所述发酵培养液按照接种量(发酵培养液占所述固体发酵 培养基的质量百分比)为5％～10％接种在固体发酵培养基中进行发酵培养。所用到的固体 发酵培养基包括3～10重量份的麦麸，0.5～5重量份的豆粕，0.05～0.5重量份的硫酸镁， 0.05～0.5重量份的氯化钠和水，其中所述固体发酵培养基中水的含量为50％～60％。在一些 优选实施方式中，所述固体发酵培养基包括4重量份的麦麸，1重量份的豆粕，0.1重量份 的硫酸镁，0.1重量份的氯化钠和水，其中固体发酵培养基中水的含量为55％。
在本发明的另一些实施方式中，所述发酵处理包括：将所述解淀粉芽孢杆菌进行液体 发酵培养，以便获得种子培养液；将所述种子培养液接种在液体发酵培养基中进行扩大发 酵培养，以便获得所述发酵处理的产物。在至少一些实施方式中，可以利用LB培养液进 行所述液体发酵培养，所述液体发酵培养的时间为10小时以上，优选为10～16小时。在本 发明至少一些实施方式中，将所述种子培养液按照接种量为5％～10％接种在液体发酵培养 基中进行扩大发酵培养。所用到的液体发酵培养基包括8～15重量份蛋白胨，1～5重量份硫 酸铵，2～5重量份牛肉浸出粉，3～8重量份氯化钠，1～5重量份磷酸氢二钾，3～8重量份聚 乙烯醇和1000重量份水，所述液体发酵培养基的pH值为7～7.5。在一些优选实施方式中， 所述液体发酵培养基包括10重量份蛋白胨，2.5重量份硫酸铵，3重量份牛肉浸出粉，5重 量份氯化钠，2重量份磷酸氢二钾，5重量份聚乙烯醇和1000重量份水，所述液体发酵培养基的pH值为7.2。
将获得的发酵产物烘干粉碎，所获得的每克微生物菌剂中含有的解淀粉芽孢杆菌活菌 数至少为8×1010CFU，优选为1×1011CFU以上，例如可以为1.5×1011CFU，2×1011CFU。
所提供的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844不仅可以制备成微生物菌剂，作为单一菌 剂使用，还可以同其他微生物菌剂进行复配，制备成复合菌剂。为此，在本发明的另一方面，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，其中第一微生物菌剂为上述微生物菌剂(即包含有解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844的微生物菌剂)，第二微生物菌剂不同于第一微生物菌剂。可用的第二微生物菌剂可以是其他的解淀粉芽孢杆菌菌剂，也可以是胶质芽孢杆菌菌剂，绿色木霉菌剂，土曲霉菌剂等等，只 要能够起到防治病虫害或者疾病的目的即可。这里的胶质芽孢杆菌菌剂是指包含有第一芽孢杆菌的微生物菌剂，绿色木霉菌剂是指包含有绿色木霉的微生物菌剂，相似地，其他菌剂也做类似理解。
在制备这些复合菌剂的过程中，可以将各微生物在适合条件下制备成相应微生物菌剂， 然后再进行复配。例如，胶质芽孢杆菌可以按照与解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844相似 的条件进行发酵，制备胶质芽孢杆菌菌剂。在至少一些实施方式中，胶质芽孢杆菌菌剂通 过下述方法发酵获得：将胶质芽孢杆菌进行液体发酵培养，获得种子培养液，将种子培养 液进行扩大发酵培养，以便获得发酵处理后的产物。可以利用解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo. 17844所用到的固体发酵培养基或者液体发酵培养基进行所述扩大发酵培养。
绿色木霉和土曲霉菌剂的制备条件相似。在本发明的至少一些实施方式中，可以将绿 色木霉和土曲霉分别在PDA液体培养液中发酵，然后将发酵培养液接种到第二固体发酵培 养基上，分别得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物。其中，可用的第二固体发酵培养基包括： 2～5重量份的麦麸，1～5重量份的玉米淀粉，0.5～3重量份的大米碎渣，0.5～3重量份的小米， 0.3～1.5重量份的秸秆渣和水，其中该固体发酵培养基中水的含量为55％～65％。在一些优 选实施方式中，第二固体发酵培养基包括：2重量份的麦麸，1.5重量份的玉米淀粉，1重 量份的大米碎渣，1重量份的小米，0.5重量份的秸秆渣和水，其中该固体发酵培养基中水 的含量为60％。将得到土曲霉和绿色木霉的发酵产物分别进行烘干粉碎，获得粉末状的土 曲霉菌剂和绿色木霉菌剂，其中每克土曲霉菌剂含有土曲霉的有效活菌数为3×1010以上， 优选为5×1010；每克绿色木霉菌剂含有绿色木霉的有效活菌数为2×1010，优选为4×1010。
在本发明的至少一些实施方式中，本发明提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括上 述第一微生物菌剂以及上述胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂中至少一种。 在一些实施例中，上述第一微生物菌剂在与胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌 剂中的任意一种或者任意几种复配时，可以按照1～3:1～3的比例进行掺混。所得到的复合 菌剂每克含有活菌数为1000亿以上，优选为2000亿以上，例如为3000亿。
在本发明的至少一些实施方式中，所提供的复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢 杆菌CGMCC No.17844菌剂、1～1.5重量份的胶质芽孢杆菌菌剂、1～1.5重量份的绿色木霉 菌剂和1～1.5重量份的土曲霉菌剂。在本发明的另一些实施方式中，所提供的复合菌剂包 括1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844菌剂和1～1.5重量份的胶质芽孢杆菌 菌剂。在本发明的再一些实施方式中，所提供的复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢 杆菌CGMCC No.17844菌剂、1～1.5重量份的绿色木霉菌剂和1～1.5重量份的土曲霉菌剂。 在本发明的又一些实施方式中，所提供的复合菌剂包括1～1.5重量份的解淀粉芽孢杆菌 CGMCC No.17844菌剂和1～1.5重量份的绿色木霉菌剂。
上述提供的微生物菌剂或者复合菌剂可以单独作为肥料或者治病药物使用，也可以添 加到肥料中使用。例如可以将上述微生物菌剂或者复合菌剂添加到有机复合肥、有机无机 复混肥、无机复合肥、生物有机肥中，添加量可以为1‰～5‰，所获得微生物肥料，可以 用作植物促生或者根腐病防治。为此，在本发明的又一方面，本发明提供了一种肥料，所述肥料包括上述微生物菌剂或者复合菌剂。在至少一些实施方式中，所制备的每克肥料中含有的有效活菌数为1亿以上，例如为1.2亿。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施 例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的， 按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注 明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)的分离与筛选
(1)通过分离草莓根腐病病株，分离得到草莓根腐病的致病菌-棒状拟盘多毛孢，其菌 落形态图如图1所示，经ITS序列测定，并MEGA7.0做系统发育树分析如图2所示(该 棒状拟盘多毛孢简写为ZH-G01)，结果表明分离得到的菌株是棒状拟盘多毛孢。
棒状拟盘多毛孢ZH-G01的ITS序列：
TACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCA TTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAA CAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATG TGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTAT TCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGG AATCTACTTCTTTTATTAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTC TGAGCGTAGTAATTTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAAC CCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAA(SEQ ID NO:1)
(2)在分离病原菌的同时，在病株内通过平板涂布法和平板划线法分离获得分离筛选 到多株对棒状拟盘多毛孢(ZH-G01)有拮抗效果的菌株，包括：
在山东莒南草莓大棚根腐病病株中选取发病部位组织，用清水冲洗干净，并表面消毒 后，经研钵研磨，取1ml研磨组织样本放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min， 然后进行梯度稀释，至104，选取3个梯度进行涂布，每个梯度3个平行，在30℃培养箱 中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在NA培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存。
初筛：采用平板对峙法，制备PDA培养基，用打孔器在棒状拟盘多毛孢菌株平皿边缘 打取直径为5mm的菌饼，将其移植在平板中央，同时将菌株用牙签接种在平板四周，25℃恒温培养，逐日观察菌株对病原菌的抑制作用。
复筛：通过再次比对筛选，获得对拟盘多毛孢病原菌具有拮抗效果，且拮抗效果最好 的微生物菌株。
该菌株的菌落形态图如图3所示，该菌株具有强的耐温、耐盐特性。而且该菌株对棒 状拟盘多毛孢的平板拮抗率达到80％，拮抗效果显著，如图4所示。
实施例2解淀粉芽孢杆菌的鉴定
实施例2对实施例1所获得的微生物菌株进一步鉴定，经鉴定该微生物菌株为解淀粉 芽孢杆菌。包括：通过16S rRNA序列测定，获得该微生物菌株的序列，并用MEGA7.0 做系统发育树分析，如图5所示(在图5中将该菌株简写为J4)。结果表明分离得到的菌株 是解淀粉芽孢杆菌。
该菌株编码16S rRNA的DNA序列为：
ACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCT TGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGC CTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTG TTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACA GATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGG CGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAG ACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATG GACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT CGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGC ACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGC CGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAG GGCTCGCAGG(SEQ ID NO:2)
经鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，将该菌株进行保藏，保藏编号为CGMCCNo.17844， 保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例3解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)的抗病和促生效果
1、平皿拮抗效果
采用平皿对峙法，制备PDA培养基，用打孔器在草莓根腐病病原菌拟盘多毛孢边缘打 取直径为5mm的菌饼，将其移植在平板中央，同时将解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.17844 菌株用牙签接种在平板四周，将其与外购解淀粉芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌 进行拮抗效果对比，接种后将培养皿在25摄氏度恒温培养，测定拮抗率。
其中拮抗率通过下述方法计算获得：
根据公式：拮抗率＝(对照菌落直径–处理菌落直径)/对照菌落直径*100
测定结果如下表1所示：
表1 平皿拮抗效果
实验结果表明，本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌相较外购的解淀粉芽孢杆菌或者枯草 芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌，针对拟盘多毛孢的平皿拮抗率，具有20％～28％的提升。
2、盆栽试验抗病效果
通过下述方法对不同微生物菌株的防病效果进行验证，包括：
(1)病原菌孢子悬液的制备。将两种病原菌分别接种在PDA平板上，在25℃恒温培养箱中培养5-7d，待菌株长满整个平板后，用无菌水将平板上的孢子冲洗掉，然后离心， 收集病原菌孢子，用血球计数板在显微镜下计数，将孢子悬液稀释至106个/ml，备用。
(2)拮抗菌悬液制备。将解淀粉芽孢杆菌从平皿上接种至100ml LB液体摇瓶中，进行发酵，温度为30℃，pH 6.8，转速140rpm，培养24h。24h后将其菌悬液浓度调整至 108cfu/ml，备用。
(3)抗病试验。试验于山东省临沂市中化农业(临沂)研发中心有限公司试验大棚内 进行，试验分组，分别为对照组1、对照组2、实验组1～实验组7，每组20盆，每盆种植 一株长势一致、无叶斑的健康草莓植株，盆为30cm×20cm×30cm(盆口直径×盆底直径 ×盆高)，盆中装3.5kg灭菌土壤。
其中，在缓苗后15天后分别将实验组1～实验组7的不同的菌悬液接入到各盆植株根 部土壤中，48小时后接入病原菌孢子悬液(拟盘多毛孢，其浓度为106cfu/ml)试验期为30 天(以缓苗15天后开始计算)，各处理每天浇水量相同，统一管理。其中实验组1为解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)组、外采解淀粉菌剂组1、组2、组3，胶质芽孢杆 菌组W4，枯草芽孢杆菌组W5、W6，对照组1不做任何处理；对照组2接两种病原菌孢 子悬液，浓度为106cfu/ml；实验组1施用步骤(2)的拮抗菌悬液；实验组2～实验组7施 用的为上述制备的接抗菌菌悬液。分别参照下述方法计算发病率。
其中草莓根腐病发病率通过下述方法计算获得，以下实施例中发病率也采用相同的方 法计算获得：
将草莓根腐病发病程度分为6级：0级为根系未发病；1级为根系发病率≤30％，叶片 正常；2级为30％<根系发病率≤60％，叶片正常；3级为60％<根系发病率≤80％，叶片变黄；4级为根系发病率80％以上，叶片枯萎；5级为整株死亡，叶片干枯。
发病率(％)＝∑(病害级别×该级别植株数)/(总株数×病害最高级值)×100
其中鲜重(g/株)代表草莓植株的重量；结果数(个/株)代表每株植株上所结的草莓 的个数；产量(g/株)代表草莓果实的重量；甜度(％)通过糖度仪检测获得。
需要说明的是，以下各实施例中鲜重、结果数、产量、甜度等均与该实施例具有相同 的含义以及相同的计算方式。
结果见表2。
表2 草莓盆栽促生试验结果
从表2给出的结果可以看出，应用本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌处理所获得的草莓 无论是鲜重，还是结果数，以及产量、甜度相较于市场长的解淀粉芽孢杆菌，或者枯草芽 孢杆菌、胶质芽孢杆菌等，均有了提升，尤其是鲜重以及结果数。而且相较于其他处理组， 应用本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌处理后的草莓的发病率明显减低。
实施例4制备解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)菌剂
实施例4提供了制备微生物菌剂的方法，其制备方法可以采用以下两种方法，第一种 方法是借助于液体发酵培养基进行发酵，第二种方法是借助于固体发酵培养基进行发酵获 得，分别如下：
1、借助于液体发酵培养基进行发酵
将解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.17844接种至1000mL LB液体摇瓶中培养，制备种子液，之后将种子液转移至10L的含有液体发酵培养基A的液体发酵罐中，接种量为9％，pH7.0，转速160rpm，30℃发酵2天，将发酵产物进行喷雾干燥，获得呈干粉状的相应菌 剂。每克该菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数为8×1011。
其中液体发酵培养基A的配方为：蛋白胨10g，硫酸铵2.5g，牛肉浸出粉3g，氯化 钠5g，磷酸氢二钾2g，聚乙烯醇5g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。
2、借助于固体发酵培养基进行发酵
将解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.17844接种至100ml LB液体摇瓶中单独发酵，温度为30℃，pH7.0，转速160rpm，培养20小时。随后转接到固体发酵培养基B上，接种量为 8％，30℃发酵4天，获得固体发酵产物。
其中，固体发酵培养基B的配方按重量组分计，麦麸：豆粕：硫酸镁：氯化钠的重量比为4:1:0.1:0.1，含水量55％。
将固体发酵产物烘干粉碎，获得呈干粉状的相应菌剂。每克该菌剂中含有解淀粉芽孢 杆菌的有效活菌数为9×1011。
实施例5解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)在制备复合菌剂中的应用
该实施例提供了复合菌剂，所提供的复合菌剂通过将不同的菌剂按照一定的比例混合 获得的。可将解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉按照1～3：1-3：1～3：1～3 至少其一进行掺混，优选地，可将解淀粉芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌、绿色木霉、土曲霉按 照1～1.5：1～1.5：1～1.5：1～1.5至少其一进行掺混。其通过下述方法制备不同的菌剂，然后 将不同的菌剂进行复配获得，包括如下步骤：
1、制备解淀粉芽孢杆菌CGMCC NO.17844菌剂。参照实施例4中第一种方法即借助于液体发酵培养基进行发酵，每克该菌剂中含有解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数均为8×1011。
2、制备胶质芽孢杆菌菌剂。胶质芽孢杆菌参照与实施例4中第一种方法相似的方法进 行发酵，区别仅在于利用胶质芽孢杆菌进行。所获得的每克菌剂中含有胶质芽孢杆菌的有 效活菌数均为8×1010。
3、制备土曲霉菌剂、绿色木霉菌剂。将土曲霉、绿色木霉分别在接种到固体发酵培养 基，接种量为8％，30℃发酵，光照24小时后黑暗培养24小时，连续发酵9天，分别得到 土曲霉和绿色木霉的发酵产物，烘干并粉碎，获得呈干粉状的土曲霉菌剂以及绿色木霉菌剂，其中每克土曲霉菌剂中含有土曲霉的有效活菌数为5×1010，每克绿色木霉菌剂中含有绿色木霉的有效活菌数为4×1010。
4、将制备好的解淀粉芽孢杆菌菌剂、胶质芽孢杆菌菌剂、绿色木霉菌剂、土曲霉菌剂 分别按照表3中所列出的质量比例进行复配，即得到复合菌剂。
表3 复合菌剂实例
对所制备的复合菌剂的田间促生及抗病效果进行验证，试验于山东省临沂市莒南县道 口镇进行，具体如下：
选取1个草莓大棚，共2亩，分别设置空白对照组和对照组，其中空白对照仅进行常规施肥，不添加菌剂，对照组使用市场采购菌剂，其他处理组使用上述表3中制备的复合 菌剂，其他田间管理相同。其实验结果如下表4所示：
表4 草莓大棚试验结果
从表4给出的结果可以看出，使用本发明所提供的复合菌剂，与空白对照组或者对照 组相比，草莓植株生理指标均有提升，果实饱满，畸形果少，味甜、口感好，且草莓根腐病的田间发病率显著降低。
实施例6解淀粉芽孢杆菌(编号CGMCC No.17844)在制备微生物肥料中的应用
实施例6提供了一种肥料，该肥料包括生物有机肥和复合菌剂，其制备方法可以采用 以下步骤：
1、按照实施例5的方法制备复合菌剂，包括复合菌剂1～复合菌剂22。
2、按照发酵牛粪含量40％，炭基肥30％，小分子有机料20％，硅酸钙10％称取不同物料，掺混后获得相应的生物有机肥。然后均匀加入占生物有机肥含量1-1.5‰由步骤1得到的菌剂，即得到相应的肥料。下表5中列出了应用不同的生物有机肥制备的肥料示例， 为了同下面实施例7和实施例8中所制备的肥料区分，该实施例所制备的肥料以生物有机 肥编号命名。
由于用到的复合菌剂分别为复合菌剂1～复合菌剂21，所制备得到的肥料相应地分别命 为生物有机肥1～生物有机肥21。
表5 生物有机肥实例
对所制备的肥料进行田间促生及抗病效果的验证，试验于山东省临沂市莒南县道口镇 进行，包括如下步骤：
选取1个草莓大棚，共2亩，分别设置空白对照组和对照组，其中空白对照组中所使用的肥料中与各实验组相比不含有菌剂，对照组使用市场采购菌剂替代上述复合菌剂制备微生物肥料使用。各实验组使用上述制备的各肥料，其他田间管理相同。
表6 草莓大棚试验结果
从以上表6列出的结果可以看出，使用本发明所提供的生物有机肥，与对照相比，草 莓植株鲜重提升46％，结果数提升50％，产量提升42％；果实饱满，畸形果少，糖度提升17％，口感更好；同时草莓根腐病发病率降低37％，显著提高植物抗病性。
实施例7
实施例7提供了一种肥料，该肥料是通过将复合菌剂添加到有机无机复混肥15-40(16-12-12/S)(其中15-40指的是有机肥和无机肥的比例，16-12-12/S指的是氮磷钾的比例) 中制备得到。可以在有机无机肥造粒后，将复合菌剂与防结粉混合均匀在包膜工段以外包 裹方式添加，获得颗粒状的肥料。
其中所用到的复合菌剂为实施例5所制备的复合菌剂1～复合菌剂22，复合菌剂的添加 量占有机无机复混肥的量的比例分别如下表7所示，由此获得相应的肥料。同时，为了便 于区分，所制备的肥料以相应的基础肥料命名。
表7 有机无机复混肥实例
对所制备的肥料进行田间抗促生及抗病效果的验证，实验在山东莒南县道口镇草莓棚 试验区域进行，包括：
实验设置空白对照组和对照组，空白对照组与实验组相比，用到的肥料为不添加复合 菌剂的有机无机复混肥，对照组1用到的肥料为添加有市场购买菌剂的有机无机复混肥。 其他试验组为施用上述制备的有机无机复混肥。棚内设3个处理，每个处理3小区，每个小区66.6平方米，有机肥施用量为120Kg/亩。实验结果如下表8所示：
表8 草莓大棚试验结果
从表8给出的结果可以看出，使用本发明所提供的肥料，与对照组相比，草莓植株生 理指标均有显著提升，且草莓根腐病的田间发病率显著降低。
实施例8
实施例8提供了一种肥料，该肥料是通过将复合菌剂添加到无机复合肥15-15-15(指 氮磷钾的含量分别为15％，15％，15％)中制备得到。可以在无机复合肥造粒后，将复合菌剂与防结粉混合均匀在包膜工段以外包裹方式添加，获得颗粒状的肥料。
其中所用到的复合菌剂为实施例5所制备的复合菌剂1～复合菌剂22，复合菌剂在无机 复合肥中的占比分别如下表9所示，由此获得相应的肥料。同时为了便于区分，所制备的 肥料以相应的基础肥料命名。
表9 肥料实例
对所制备的肥料进行田间抗促生及抗病效果的验证，实验在山东莒南县道口镇草莓棚 试验区域进行，包括：
实验设置空白对照组和对照组，空白对照组与实验组相比，用到的肥料为不添加复合 菌剂的无机复合肥，对照组用到的肥料为添加有市场购买菌剂的无机复合肥。其他试验组 为施用上述制备的无机肥。棚内设3个处理，每个处理3小区，每个小区66.6平方米，有机肥施用量为120Kg/亩。
表10 草莓大棚实验结果
使用本发明所述的肥料，与对照相比，草莓植株生理指标均有显著提升，且草莓根腐 病的田间发病率显著降低。
本文中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、 或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包 含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针 对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个 或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术 人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和 组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的， 不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例 进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 中化农业（临沂）研发中心有限公司
<120> 解淀粉芽孢杆菌CGMCC No. 17844及其应用
<130> PIDC3194246
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 468
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 棒状拟盘多毛孢
<400> 1
taccttttgt tgcctcggca gaagttatag gtcttcttat agctgctgcc ggtggaccat 60
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<223> 解淀粉芽孢杆菌
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