油脂降解复合菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物降解技术领域，具体涉及一种油脂降解复合菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来生态环境质量越来越受到人们的普遍关注，其中水体污染的更是环境污染治理的重中之重。2017年我国生活污水处理量达462.6亿吨，其中餐饮废水是生活污水的重要组成部分，虽然餐饮废水只占城市生活污水排放总量的3％左右，但其所贡献的BOD和COD却占了废水中总污染物含量的1/3以上。由于餐饮业废水中有毒物质含量相对较少，往往不被人们所重视，一般都未经任何处理或经过简单处理后就直接排放入水体或市政污水管网，容易造成排放水体的富营养化与接收污水处理厂的处理负担，同时，其中高含量的油脂为很大程度增加了废水的处理难度。
油脂废水排放造成的一系列环境问题已被广泛关注，目前，关于油脂废水的治理方法主要包括生物法、物理法和化学法。其中，物理、化学法的运用工艺一般较为复杂，且往往较难达到国家要求的排放标准，相比生物法投资成本一般较高。而生物法能有效地解决目前我国存在的油脂废水问题，且具有处理效果明显、成本较低、无二次污染等优势，应用前景广阔。
生物法是处理油脂污染物的一种最彻底、最安全和最有效的方法。随着国内外水处理专家对于处理含油脂污水的研究不断深入，众多的微生物被证明具有代谢油脂的能力。但目前的研究一般仅限于对单株菌种除油降脂的探索，如利用芽孢杆菌、假单胞菌等对油脂的降解，但单株菌株的油脂降解能力有限，是无法满足目前所需要求。
上述研究都使得利用微生物处理油脂废水成为一种经济有效的方式。但高效低耗的油脂生物处理工艺显得尤为迫切，而研发高效油脂降解菌剂并将其引入处理环境问题是解决这一难题的关键。所以研发高效油脂降解菌剂，提高油脂降解的处理效率，对油脂的无害化处理意义重大。
发明内容
本发明要解决的技术问题为：针对油脂污染物对环境的污染严重的问题，提高油脂降解的处理效率。
本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供一种油脂降解复合菌剂。本发明所述的油脂降解复合菌剂，组成包括：芽孢杆菌(Bacillus)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和枸橼酸杆菌(Citrobacter)。
其中，上述油脂降解复合菌剂中，所述芽孢杆菌、克雷伯氏菌和枸橼酸杆菌的有效活菌数比为2～10﹕3～9﹕1～6。
进一步的，上述油脂降解复合菌剂中，所述芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)和/或其他相似菌种；所述克雷伯氏菌包括变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和/或其他相似菌种；所述枸橼酸杆菌包括柠檬酸杆菌(Citrobacter Werkman and Gillen)和/或其他相似菌种。
更进一步的，上述油脂降解复合菌剂中，所述芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌的有效活菌数比为1～6﹕1～4；所述克雷伯氏菌中变栖克雷伯氏菌、克雷伯氏菌的有效活菌数为1～5﹕2～4；所述枸橼酸杆菌为柠檬酸杆菌。
其中，上述油脂降解复合菌剂中，所述复合菌剂有效活菌总数大于2×109CFU/mL。
其中，上述油脂降解复合菌剂中，还包括假单胞菌(Pseudomonas)、乳杆菌(Lactobacillus)
和酵母菌(Saccharomyces)。
其中，上述油脂降解复合菌剂中，所述复合菌剂中芽孢杆菌、克雷伯氏菌、枸橼酸杆菌、假单胞菌、乳杆菌、酵母菌的有效活菌数比为2～10﹕3～9﹕1～6﹕2～8﹕2～4﹕1～4。
进一步的，上述油脂降解复合菌剂中，所述假单胞菌包括施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和/或其他相似菌种；乳杆菌包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)和/或其他相似菌种；所述酵母菌包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和/或其他相似菌种。
更进一步的，上述油脂降解复合菌剂中，所述乳杆菌为干酪乳酸菌，所述酵母菌为酿酒酵母，所述假单胞菌中施氏假单胞菌、荧光假单胞菌的有效活菌数比为1～6﹕1～5。
其中，上述油脂降解复合菌剂中，所述复合菌剂有效活菌总数大于2×109CFU/mL。
本发明还提供了一种油脂降解复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
a、种子制备
将待用的菌种分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子制备，30～35℃摇床培养
1～2d；
b、QMM培养基配制
培养基组成包括：糖蜜10g、葡萄糖2g、尿素2g、牛肉膏1g、蛋白胨2g、氯化钠5g，,用水补充至1L，调整pH为5.5～8.0；
c、选取步骤a培养得到的菌种，按比例接种于步骤b配制的培养基中进行培养，培养1～3d，待OD600达到0.8±0.1时得到复合菌剂。
本发明还提供了一种上述油脂降解复合菌剂专用培养基，组成包括：糖蜜10g、葡萄糖2g、尿素2g、牛肉膏1g、蛋白胨2g、氯化钠5g，,用水补充至1L，调整pH为5.5～8.0。
本发明还提供了一种上述油脂降解复合菌剂的用途：用于含油污染物中油脂的降解。
进一步的，所述用途中，使用方法为按1.0～15.0％的接种量进行接种。
本发明所述的复合菌剂可直接接种于油脂废水，或者作为生物强化制剂接种于活性污泥中进行应用，改菌剂适用于多种油脂废水，并适用于低浓度至高浓度油脂废水的处理，同时适用于好氧、兼氧和厌氧等多种污水处理技术。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)清洁高效，配方合理。本发明主要利用生物法，较物理和化学法相比物成本低、无二次污染等优势；
(2)多种菌群，性能稳定。本发明的油脂降解菌剂由多种微生物复配而成，微生物间协同作用明显，进入反应体系后能成为其中的优势微生物而发挥降解作用。
(3)处理效率高，应用范围广。油脂降解菌剂能应用于油脂废水处理和餐厨垃圾堆肥处理以及其他含油脂污染物。本发明菌剂应用于油脂废水处理，可有效提高废水中油脂和非油脂类还原性有机物降解效率，在好氧和厌氧条件下均能稳定发挥效果；应用于餐厨垃圾堆肥时，与堆肥中微生物协同作用，可发挥油脂快速降解与转化的作用，可在餐厨垃圾制备有机肥生产中推广应用。
(4)总体而言，本发明能够在工业上进行规模化应用，具有投入小、效率高等优点。
附图说明
图1为油脂降解菌剂对不同浓度的油脂废水的油脂去除率；
图2为油脂降解菌剂对不同pH的油脂废水的油脂去除效果图；
图3为油脂降解菌剂对温度的适应范围；
图4为油脂降解菌剂的不同接种量研究；
图5为油脂降解菌剂对调料厂油脂废水的油脂去除效果；
图6为油脂降解菌剂对调料厂油脂废水的COD去除效果；
图7为利用本本发明的复合菌剂和不利用菌剂进行油脂去除的对比图。
具体实施方式
为加强含油废物的油脂降解，本发明通过在理论与实验研究的基础上，利用传统微生物学技术，采用模拟实验的方法，从环境中优选亲近环境型的不同科、属的功能微生物，获得油脂降解菌；进一步对功能菌间的交互作用研究，构建出油脂降解复合菌系；对复合菌剂不同配比的应用效果进行了研究。
下面结合具体实施方式进行详细描述，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
实施例中，所述枯草芽孢杆菌购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，编号为CGMCC No.112939；所述解淀粉芽孢杆菌购自CGMCC，编号为CGMCCNo.110901；所述柠檬酸杆菌购自CGMCC，编号为CGMCC No112847；所述施氏假单胞菌购自CGMCC，编号为CGMCC No1.15316；所述荧光假单胞菌购自CGMCC，编号为CGMCC No.17375、所述铜绿假单胞菌购自CGMCC，编号为CGMCC No.110712；所述青霉购自CGMCC，编号为CGMCCNo.11527；所述肠杆菌包括阴沟肠杆菌，购自CGMCC，编号为CGMCC No.18726；所述粘质沙雷氏菌购自CGMCC，编号为CGMCC No.12794；所述变栖克雷伯氏菌购自CGMCC，编号为CGMCCNo.1859；
所述肺炎克雷伯氏菌购自CGMCC，编号为CGMCC No.1839；所述干酪乳杆菌购自CGMCC，编号为CGMCC No.18727；所述酿酒酵母购自CGMCC，编号为CGMCC No.23973；其余产品为普通市售产品。
实施例1本发明油脂降解菌剂应用于不同浓度的油脂废水
按照以下步骤进行：
1.油脂降解菌剂的制备
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、变栖克雷伯氏菌分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子制备，培养2～3d，待菌种生长稳定后，按枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、变栖克雷伯氏菌种子液(体积分数，V/V)为5﹕2﹕3比例，进一步接种于QMM培养基进行种子扩大培养，使得有效活菌总数为2.5×109CFU/mL，获得油脂降解复合菌剂。
2.不同油浓度的模拟废水实验
以大豆油为主要原料，油脂降解复合菌剂按照1.0％的比例(V/V，体积分数)接种至含2g/L、6g/L、10g/L、14g/L、18g/L、22g/L的含油脂废水中，在摇床震荡培养5d，对油脂去除率进行检测，结果见附图1。附图1结果表明，6个实验组油脂去除率分别达到98.65％、93.27％、88.97％、86.46％、85.7％、83.41％，表明油脂降解菌剂对油脂的降解效率高。
实施例2油脂降解菌剂应用于不同pH的油脂废水
按照以下步骤进行：
1.油脂降解复合菌剂的制备：
2.将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、变栖克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子制备，培养2～3d，待菌种生长稳定后，按上述菌株种子液(V/V)比例为6﹕1﹕4﹕3﹕6﹕8﹕2﹕4，进一步接种于QMM培养基进行种子扩大培养，经过2级种子扩大培养获得稳定的培养液，使得有效活菌总数为5×109CFU/mL，获得油脂降解复合菌剂。
3.油脂降解菌剂处理不同pH的油脂废水：
以大豆油为主要原料，油脂降解复合菌剂按照2％的比例(V/V，体积分数)接种至含2g/L油脂废水中，调节pH分别为3、4、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、9，震荡培养7天。实验结束后，对油脂去除率进行了检测，结果见附图2。第7天，各组油脂去除率分别为23.3％、75.4％、88.9％、92.8％、94.7％、93.2％、94.1％、90.6％、81.4％、78.3％，表明油脂降解复合菌剂对于pH的适用范围广，在pH 4～9对油脂的去除率均在75.4％以上，但pH低于3时油脂的去除率大幅度降低，仅23.3％。
实施例3油脂降解菌剂对温度的适应范围
按照以下步骤进行：
1.油脂降解复合菌剂的制备：
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、变栖克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子制备，培养2～3d，待菌种生长稳定后，按上述菌株种子液(V/V)比例为1﹕4﹕3﹕1﹕6﹕8﹕2﹕1，进一步接种于QMM培养基进行种子扩大培养，经过2级种子扩大培养获得稳定的培养液，调节菌悬液的OD600为0.8±0.1，获得油脂降解复合菌剂。
2.油脂降解菌剂在不同温度下对油脂的去除率：
以大豆油为主要原料，油脂降解复合菌剂2按照1％的比例(V/V，体积分数)接种至含2g/L油脂废水中，在温度分别为15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃中震荡培养7天。实验结束时油脂去除率见附图3。结果表明，各组油脂去除率分别为38.70％、64.30％、83.90％、91.10％、93.50％、90.60％、84.80％、75.20％，温度达到25℃时油脂去除率达到80％以上，在20℃～55℃的油脂去除率在64.3％以上，温度在25℃到50℃之间，油脂去除率大于83.9％，表明油脂降解菌剂的温度适应范围较广，对于温度范围20℃～55℃均具有较好的去除效率，温度在25℃到50℃去除效果最佳。
实施例4油脂降解菌剂的接种量研究
按照以下步骤进行：
1.油脂降解复合菌剂的制备：
将枯草芽孢杆菌、变栖克雷伯氏菌、施氏假单胞菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子制备，培养2～3d，待菌种生长稳定后，按上述菌株种子液(V/V)比例为2﹕9﹕8﹕3﹕3，进一步接种于QMM培养基进行种子扩大培养，经过2级种子扩大培养获得稳定的培养液，最终调节菌悬液的OD600为0.8±0.1，获得油脂降解复合菌剂。
2.不同接种量油脂降解菌剂的处理效果的影响：
以大豆油为主要原料，油脂降解复合菌剂2按照1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％的比例(V/V)接种至含2g/L油脂废水中，震荡培养7天。实验结束后，对油脂去除率进行了检测，结果见附图4。结果表明，8个实验组油脂去除率分别为75.26％、89.59％、90.31％、92.37％、92.44％、92.56％、92.76％、93.01％，接种量越大对油脂去除率越高。趋势线结果表明接种量在3％时油脂降解速率最快，对于2g/L油脂废水，从经济性考虑，3％可作为最佳接种量，表明油脂降解菌剂能在较低接种量下也能有效降解油脂。但针对不同的进水中油脂浓度可以选择不同的接种量。
实施例5油脂降解菌剂应用于调料厂油脂废水的好氧生物处理
按照以下步骤进行：
1.油脂降解复合菌剂的制备：
将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、变栖克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子制备，培养2～3d，待菌种生长稳定后，按上述菌株种子液(V/V)比例为5﹕2﹕5﹕9﹕1﹕8﹕2﹕1，进一步接种于QMM培养基进行种子扩大培养，经过3级种子扩大培养获得稳定的培养液，最终调节菌悬液的OD600为0.8±0.1，获得油脂降解复合菌剂。
2.油脂降解菌剂应用于调料厂含油废水的好氧生物处理：
实验用调料厂油脂废水取自成都市双流区某调料厂调节池的含油污水。在该调料厂污水处理系统的好氧生化池采集活性污泥，将活性污泥采用间歇曝气2d，按照油脂降解菌剂10％的接种量接种至活性污泥中(对照组不接种油脂降解菌剂)，采用不断增加油脂废水浓度的方式对含油脂降解菌污泥进行驯化，至出水COD稳定后驯化结束。在油脂废液处理装置中，采用好氧生物处理的方式处理上述油脂废水，油脂废水进水含油量在6.3g/L～13.3g/L波动，反应器运行了30d，在此期间，每2天监测相关数据(见附图5和附图6)，在此期间，实验组油脂去除率达79.9～86.7％，COD去除率达88.2～94.4％，而对照组油脂去除率为52.3～62.3％，COD去除率为58.8～65.6％，表明油脂降解菌剂能有效降解油脂废水中的油脂，可去除废水中的油脂和非油脂还原性有机物。
实施例6油脂降解菌剂应用于餐厨垃圾油脂废水的厌氧生物处理
按照以下步骤进行：
1.油脂降解菌剂的制备
2.将枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、变栖克雷伯氏菌、柠檬酸杆菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子制备，培养2～3d，待菌种生长稳定后，按上述菌株种子液(V/V)比例为4﹕2﹕3﹕6﹕4﹕4﹕4﹕3，进一步接种于QMM培养基进行种子扩大培养，经过3级种子扩大培养获得稳定的培养液，最终调节菌悬液的OD600为0.8±0.1，获得油脂降解复合菌剂。
3.油脂降解菌剂应用于餐厨垃圾油脂废水的处理
实验用餐厨垃圾油脂废水取自西南交通大学食堂，通过沥干挤压过滤后，去除滤除液上面的浮油得到餐厨垃圾油脂废水，油脂降解菌剂按照15％(V/V)的比例添加至油脂废水(原废水油脂含量为50g/L)，以不添加油脂降解菌剂的油脂废水为对照，厌氧发酵10天，油脂和COD去除率见附图7。结果表明，对于油脂含量为50g/L的餐厨垃圾油脂废水，油脂降解菌剂厌氧处理10d时，油脂去除率达67.35％，对照组油脂去除率仅仅为12.51％；实验组COD去除率为77.15％，对照组COD去除率仅仅为11.19％。表明油脂降解复合菌剂应用于高浓度油脂废水的厌氧处理，能有效去除其中的油脂和非油脂类的还原性有机物。
