一种用于有机废物堆肥的保氮复合菌剂及其应用方法
技术领域
本发明涉及环境生物技术领域，具体涉及一种用于有机废物堆肥的保氮复合菌剂及其应用方法。
背景技术
随着我国工农业的发展，产生大量的有机废物，若不对其进行有效处理，不仅造成环境污染、疾病传播等危害，也会阻碍有机废物的有效利用和工农业的持续发展。高温好氧堆肥是资源化利用有机废物、生产有机肥的经济可行的办法。堆肥中的氮是作物生产中最重要的肥料元素之一。但研究表明，在畜禽粪便和作物秸秆堆肥的高温阶段，铵态氮会转变为氨气挥发，造成超过65％的氮损失。堆肥过程中氮素损失既降低了有机肥的肥效，又污染了环境。因此，有机废物堆肥过程中如何减少氮素损失，提高肥料质量，减少环境污染一直是研究者们非常关注的问题，也是实现有机废物高效清洁处理和工农业发展的迫切需要。
目前，降低氮损失的主要方式包括添加物理吸附剂、化学结合剂、外源微生物或覆盖等。虽然各种方式均能一定程度上减少氮素的损失，但物理化学添加剂存在成本高、有二次污染的风险，同时也会影响堆体中微生物活性、导致堆肥产品电导率过高，影响堆肥产品品质，而添加外源微生物实现保氮作用是清洁高效的方式。研究发现通过在堆肥中接种单一的外源微生物可有效减少氮损失，但关于复杂微生物菌群对堆肥过程氮素转化的影响却鲜见报道。
为弥补现有技术中的空白，本发明提供一种研发具有保氮功能的复合菌剂及其应用方法，对减少堆肥过程中的氮损失，提高堆肥品质意义重大。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于有机废物堆肥的保氮复合菌剂及其应用方法，通过在理论与实验研究的基础上，利用传统微生物学技术，采用模拟实验的方法，从环境中优选亲近环境型的不同科、属的功能微生物，获得氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群、固氮菌群，共12种菌株；进一步对功能菌间的交互作用研究，从而构建出有机废物堆肥复合菌剂，具有降低有机废物堆肥过程中氮损失，以及加快有机废物降解腐熟的效果。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种用于有机废物堆肥的保氮复合菌剂，包括氨化菌群、硝化菌群和固氮菌群。
进一步地，所述氨化菌群、硝化菌群和固氮菌群有效活菌数比为1～3:2～7:1～5。
进一步地，所述硝化菌群包括亚硝化菌群和亚硝酸盐氧化菌群。
进一步地，所述氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群和固氮菌群的有效活菌数比为1～3:1～4:1～3:1～5。
进一步地，所述氨化菌群包括施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的至少一种；所述亚硝化菌群包括鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种；所述亚硝酸盐氧化菌群包括大洋芽胞杆菌(Oceanobacillus)、Luteivirga、马氏无色杆菌(Achromobacter marplatensis)和少盐芽胞杆菌(Paucisalibacillus)中的至少一种；所述固氮菌群包括农杆菌(Agrobacterium)、芽孢八叠球菌(Sporosarcina)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、长孢菌(Longispora)中的至少一种。
进一步地，所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN922934，
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN931201，
鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913562，
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911395，
大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911345，
Luteivirga QL3的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911748，
马氏无色杆菌(Achromobacter marplatensis)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913564，
少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN929132，
农杆菌(Agrobacterium)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911324，
芽孢八叠球菌(Sporosarcina)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913561，
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913563，
长孢菌(Longispora)的16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911396。
进一步地，所述氨化菌群包括活菌数比为2～4:1～3的施氏假单胞菌和荧光假单胞菌；所述亚硝化菌群包括活菌数比为1～5:1～5的鞘氨醇单胞菌和解淀粉芽孢杆菌；所述亚硝酸盐氧化菌群包括活菌数比为1～3:1～5:1～5:2～5的大洋芽胞杆菌、Luteivirga、马氏无色杆菌和少盐芽胞杆菌；所述的固氮菌群包括活菌数比为1～6:2～4:1～5:2～5的农杆菌、芽孢八叠球菌、贝莱斯芽孢杆菌、长孢菌。
进一步地，所述复合菌剂的有效活菌数不小于2.0×109CFU/mL。上述保氮复合菌剂的应用方法，其特征在于，用于有机废物的堆肥处理，具体为，将保氮复合菌剂按照接种量为0.1％～12.0％接种至堆肥物料中进行堆肥，堆体温度上升至50℃时进行翻堆，待堆体温度降温至室温时，堆肥完成。
进一步地，所述有机废物包括畜禽废物、餐厨垃圾、秸秆、园林垃圾、城市污泥。
进一步地，所述堆肥为大型规模堆肥、中型规模堆肥、小型规模堆肥中的任一种。
本发明保氮复合菌剂的工作机理：堆肥过程中氮素转化包括氮素排放和固定两方面，其转化过程包括了自然界氮素循环的所有步骤，包括铵同化作用、氨化作用、亚硝化作用、硝化作用、反硝化作用等，各种作用的发挥相互促进、相辅相成；而堆肥中氮素存在形态主要包括铵态氮、硝态氮、有机氮等，各形态氮素转化由氨化菌、硝化菌、反硝化菌、固氮菌等相互协同完成，是一个完整的体系；堆肥过程中氮损失主要包括3个途径，即含氮有机物分解产生的氨气挥发、硝态氮反硝化细菌的作用下转化为N2和NOx、无机氮和小分子有机氮随堆肥渗滤液的流失而损失；氨化细菌通过分泌蛋白水解酶促进堆体中复杂的含氮有机化合物(如蛋白质)分解为氨基酸等简单含氮化合物，可加快堆肥腐熟进程；硝化作用主要通过硝化细菌的氧化作用(亚硝化和硝化)完成的，硝化过程中发挥作用的功能微生物主要包括亚硝化菌和亚硝酸盐氧化细菌，在硝化过程中铵态氮会被逐步氧化为硝态氮，进而降低铵态氮向氨气的转化，硝化作用的进行有益于减少堆体NH3排放，从而降低堆体中氮损失；固氮菌是生物菌肥中的重要功能微生物，能通过固氮作用固定空气中的氮素，进而提高堆体中氮含量的升高。
本发明的有益效果是：
(1)清洁高效，配制合理；本发明主要利用生物法保氮，较物理法和化学法相比物成本低、二次污染等优势；菌剂所含氮素转化微生物是基于堆肥过程中的氮素转化途径添加的，并通过适当配比，使其在堆肥不同阶段协同保氮，充分发挥各自优势，减少氮损失；
(2)菌群丰富，性能稳定；本发明菌剂含氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群、固氮菌群4类氮素转化功能微生物，能快速成为堆体中的优势菌种，菌种间协同效应明显，有效避免了单一菌种的性能不稳定的缺陷；
(3)快速更替，强效保氮；本发明菌剂应用于有机废物堆肥时，并发挥保氮作用，有效减少堆肥中氮素转化过程中氨化作用产生的NH3的排放、减少反硝化过程中的NOx、N2等随堆肥溢出堆体而造成氮素损失的问题，可在有机废物高效清洁处理与高品质有机肥生产中推广应用。
附图说明
图1为本发明试验例1堆肥过程中氨气变化的对照图；
图2为本发明试验例1堆肥过程中硝态氮含量变化的对照图；
图3为本发明试验例1堆肥过程中总氮变化的对照图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图进一步详细描述本发明的技术方案，但本发明的保护范围不局限于以下所述。
实施例1
一种用于有机废物堆肥的保氮复合菌剂，所述复合菌剂的有效活菌数为2.1×109CFU/mL，包括氨化菌群、硝化菌群和固氮菌群；所述氨化菌群、硝化菌群和固氮菌群有效活菌数比为1～3:2～7:1～5。即在使用时，可以选用有效活菌数比为1:2:1的氨化菌群、硝化菌群和固氮菌群复配，也可以选用有效活菌数比为3:7:5的氨化菌群、硝化菌群和固氮菌群复配，或者选用有效活菌数比为2:5:3的氨化菌群、硝化菌群和固氮菌群复配，均能得到保氮复合菌剂。
实施例2
一种用于有机废物堆肥的保氮复合菌剂，所述复合菌剂的有效活菌数为2.0×109CFU/mL，包括有效活菌数比为1～3:1～4:1～3:1～5的氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群和固氮菌群。即在使用时，可以选用有效活菌数比为1:1:1:1的氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群和固氮菌群复配，也可以选用有效活菌数比为3:4:3:5的氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群和固氮菌群复配，还可以选用有效活菌数比为2:2:1:4的氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群和固氮菌群复配，或者选用有效活菌数比为1:3:2:2的氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群和固氮菌群复配，均能得到保氮复合菌剂。
实施例3
基于实施例2，所述氨化菌群包括施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的至少一种；所述亚硝化菌群包括鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的至少一种；所述亚硝酸盐氧化菌群包括大洋芽胞杆菌(Oceanobacillus)、Luteivirga、马氏无色杆菌(Achromobacter marplatensis)和少盐芽胞杆菌(Paucisalibacillus)中的至少一种；所述固氮菌群包括农杆菌(Agrobacterium)、芽孢八叠球菌(Sporosarcina)、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)、长孢菌(Longispora)中的至少一种。
实施例4
基于实施例2，所述氨化菌群包括活菌数比为2～4:1～3的施氏假单胞菌和荧光假单胞菌；所述亚硝化菌群包括活菌数比为1～5:1～5的鞘氨醇单胞菌和解淀粉芽孢杆菌；所述亚硝酸盐氧化菌群包括活菌数比为1～3:1～5:1～5:2～5的大洋芽胞杆菌、Luteivirga、马氏无色杆菌和少盐芽胞杆菌；所述的固氮菌群包括活菌数比为1～6:2～4:1～5:2～5的农杆菌、芽孢八叠球菌、贝莱斯芽孢杆菌、长孢菌。
实施例5
基于实施例3或实施例4，所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN922934的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，
荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN931201的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，
鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913562的鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)，
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911395的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，
大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911345的大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)，
Luteivirga选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911748的Luteivirga，
马氏无色杆菌(Achromobacter marplatensis)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913564的马氏无色杆菌(Achromobacter marplatensis)，
少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN929132的少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus)，
农杆菌(Agrobacterium)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911324的农杆菌(Agrobacterium)，
芽孢八叠球菌(Sporosarcina)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913561芽孢八叠球菌(Sporosarcina)，
贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913563的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，
长孢菌(Longispora QL8)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911396的长孢菌(Longispora QL8)。
试验例1
将本发明的保氮复合菌剂应用于畜禽粪便堆肥，具体包括以下步骤：
1.有机废物堆肥保氮复合菌剂的制备：
将氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群、固氮菌群分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中培养2～3d，得到4类种子液，按照上述种子液(体积分数V/V)1:1:2:2的比例，进一步接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子扩大培养，最终调节菌悬液的OD600为0.8±0.1，获得有机废物堆肥保氮复合菌剂；所述氨化菌群包括活菌数比为2:1的施氏假单胞菌和荧光假单胞菌；所述亚硝化菌群包括活菌数比为1:1的鞘氨醇单胞菌和解淀粉芽孢杆菌；所述亚硝酸盐氧化菌群包括活菌数比为3:6:6:7的大洋芽胞杆菌、Luteivirga、马氏无色杆菌和少盐芽胞杆菌；所述的固氮菌群包括活菌数比为7:6:6:7的农杆菌、芽孢八叠球菌、贝莱斯芽孢杆菌、长孢菌；所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN922934的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN931201的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913562的鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911395的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911345的大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)，Luteivirga选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911748的Luteivirga，马氏无色杆菌(Achromobactermarplatensis)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913564的马氏无色杆菌(Achromobacter marplatensis)，少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN929132的少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus)，农杆菌(Agrobacterium)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911324的农杆菌(Agrobacterium)，芽孢八叠球菌(Sporosarcina)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913561芽孢八叠球菌(Sporosarcina)，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913563的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，长孢菌(Longispora)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911396的长孢菌(Longispora)。
2.畜禽粪便堆肥：
以鸡粪为主要原料，利用米糠和水稻秸秆调节碳氮比至30，充分混合均匀，调节堆体含水率至55％左右，置于长、宽、高均为0.5米的反应器中，实验组按照菌剂与堆肥质量比为1.0％的比例接种上述微生物菌剂，并以相同体积的无菌液体培养基作为对照组；当堆体平均温度上升至50℃时进行翻堆，翻堆频率为前2周每2天翻堆一次，此后每5天翻堆一次；温度需高于50℃并持续10d以上，当堆体温度逐渐降至室温时堆肥基本完成。
堆肥进行了50d，期间对实验组与对照组的氨气排放量、硝态氮和总氮含量的变化进行监测，结果分别如图1～3所示。
图1结果表明，堆肥过程中实验组氨气最大排放量(第8d)仅为对照组的45.5％；堆肥结束时实验组氨气排放总量仅为对照组的59.4％；图2显示堆肥期间实验组硝态氮含量均高于对照组，堆肥结束时实验组和对照组的硝态氮含量分别为4.5g/kg、4.1g/kg；图3结果表明，堆肥过程中两组总氮含量差异显著，堆肥、初期两组初始总氮量均为18.9g/kg，堆肥结束时实验组和对照组总氮含量分别为23.3g/kg、19.0g/kg，实验组堆体总氮含量较对照组高23.3％。表明该菌剂应用于畜禽粪便堆肥能有效减少堆肥过程中氨气排放，加速铵态氮向硝态氮的转化避免氮素损失，同时固氮菌的固氮作用也对堆肥保氮的效果明显。
试验例2
将本发明的保氮复合菌剂应用于厨余垃圾堆肥，具体包括以下步骤：
1.有机废物堆肥保氮复合菌剂的制备：
将氨化菌群、亚硝化菌群、亚硝酸盐氧化菌群、固氮菌群分别接种至牛肉膏蛋白胨培养基中培养2～3d，得到4类种子液，按照上述种子液(体积分数V/V)1:2:2:3的比例，进一步接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子扩大培养，最终调节菌悬液的OD600为0.8±0.1，获得有机废物堆肥保氮复合菌剂。所述氨化菌群包括活菌数比为2:1的施氏假单胞菌和荧光假单胞菌；亚硝化菌群包括活菌数比为1:1的鞘氨醇单胞菌和解淀粉芽孢杆菌；所述亚硝酸盐氧化菌群包括活菌数比为3:6:6:7的大洋芽胞杆菌、Luteivirga、马氏无色杆菌和少盐芽胞杆菌；所述的固氮菌群包括活菌数比为7:6:6:7的农杆菌、芽孢八叠球菌、贝莱斯芽孢杆菌、长孢菌；所述施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN922934的施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN931201的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913562的鞘氨醇单胞菌(Sphingobacterium)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911395的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911345的大洋芽孢杆菌(Oceanobacillus)，Luteivirga选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911748的Luteivirga，马氏无色杆菌(Achromobactermarplatensis)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913564的马氏无色杆菌(Achromobacter marplatensis)，少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN929132的少盐芽孢杆菌(Paucisalibacillus)，农杆菌(Agrobacterium)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911324的农杆菌(Agrobacterium)，芽孢八叠球菌(Sporosarcina)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913561芽孢八叠球菌(Sporosarcina)，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN913563的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，长孢菌(Longispora)选用16SrDNA在Genbank的登陆号为MN911396的长孢菌(Longispora)。
2.厨余垃圾堆肥：
以厨余垃圾为主要原料，利用粉碎的秸秆调节碳氮比至30左右，充分混合均匀，调节堆体含水率至60％，按照菌剂与堆肥质量比为1.5％的比例添加上述微生物菌剂，对照组加入等量无菌液体培养基，在堆肥反应器中进行堆肥；后续操作同试验例1。
厨余垃圾堆肥进行了50d，期间对实验组与对照组的氨气排放量、硝态氮、总氮的变化进行监测。结果显示，与对照组相比，实验组硝态氮含量高16.9％，总氮含量高20.4％，氨气减排50.2％。表明保氮复合菌剂应用于厨余垃圾堆肥能实现氮素快速转化、减少堆肥过程中氨气排放，保氮的效果明显。
试验例3
以试验例2制得的保氮复合菌剂继续应用于厨余垃圾堆肥试验，试验中，按照菌剂与堆肥质量比修改为0.1％进行堆肥试验，堆肥结果表明，与对照组相比，接种量为0.1％的保氮复合菌剂也能实现氮素快速转化、减少堆肥过程中氨气排放。
试验例4
以试验例2制得的保氮复合菌剂继续应用于厨余垃圾堆肥试验，试验中，按照菌剂与堆肥质量比修改为12％进行堆肥试验，堆肥结果表明，与对照组相比，接种量为12％的保氮复合菌剂同样能实现氮素快速转化、减少堆肥过程中氨气排放。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
