一种桉树组培外植体制备及无菌芽诱导方法
技术领域
本发明属于植物繁殖技术领域，涉及组织培养育苗技术，尤其是一种树组培外植体制备及无菌芽诱导方法。
背景技术
桉树是桃金娘科(Myrtaceae)杯果木属(Angophora)、伞房属(Corymbia)和桉属(Eucalyptus)3个属树种的统称，共有808个种和137个亚种或变种，共计945个分类群。天然分布华莱士线以东，北纬7°至南纬43°39′。除剥桉分布在巴布亚新几内亚、印度尼西亚和菲律宾，尾叶桉、山地尾叶桉和维塔尾叶桉分布于印度尼西亚帝汶岛及东部岛屿外，其余全部自然分布于澳大利亚。
大多数桉树易于无性繁殖，我国从1980年起，对重要桉树纯种、杂交种进行了扦插、组培试验，均取得成功，尤其在桉树组织培养方面更为突出，以尾巨桉芽器官为外植体进行组织培养，可不经愈伤组织直接繁殖成苗，并且年繁殖系数达3.512。桉树组培苗工厂化生产在我国南方发展较快，快繁技术日趋成熟，但外植体诱导阶段的污染率较高，无菌芽的获取效率较低，造成经济损失较大，因此如何克服污染问题是不可忽视的技术环节。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种能降低桉树组培外植体诱导污染率，无菌芽获取率高的桉树组培外植体制备及无菌芽诱导方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种桉树组培外植体制备及无菌芽诱导的方法，包括优树选择，环割促萌，水培促萌，外植体处理和诱导培养工序，选择桉树优树，在离地面20-25cm处进行环割促萌，待萌芽条生长至直径2-3cm时，剪取60cm长、完全木质化且带潜伏芽的枝条在培养室中进行水培，待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取茎段作为外植体并进行消毒后，接种于诱导培养基中，置于适宜的环境中进行诱导培养，最后获得生长健壮、活力旺盛的桉树无菌芽；主要的操作步骤如下：
（1）优树选择
选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的桉树个体为优树；
（2）环割促萌
铲除优树周围杂灌，环割前一天于优树周围喷晒75%酒精进行消毒，在优树离地面20-25cm处进行环割树周长的3/4，环割宽度2 cm，剥皮并刮尽形成层至韧皮部；
（3）水培促萌
待萌芽条生长至直径2-3cm时，剪取60cm长、完全木质化且带潜伏芽的枝条，去除叶片，带回培养室进行水培，每4天喷洒一次体积浓度2%的绿茶提取物抑菌；
（4）外植体处理
待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡15s，无菌水清洗2-3次，然后用2%次氯酸钠浸泡1min，最后用无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；
（5）诱导培养
将步骤（4）处理好的外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养，暗培养7d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度1500-2000lux条件下培养20-25d，获得生长健壮、活力旺盛的桉树无菌芽。
作为进一步技术改进，以上步骤（3）所述的水培的培养基包括以下组分：每1L培养基中含50mg绿茶提取物，2.5mg核黄素（VB2），其余为纯水。
作为进一步技术改进，以上步骤（5）所述的诱导培养基为：改良MS培养基+5-10mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+ 2.4mg/L D-泛酸钙（VB5）+0.24mg/L生物素（VH）+2.5mg/L L-半胱氨酸。
作为进一步技术改进，以上所述的改良MS培养基的组成为：1800mg/L KNO3、360mg/L NH4NO3、270mg/L KH2PO4、200mg/L CaCl2、360mg/L MgSO4、10mg/L H3BO3、25 mg/LMnSO4、10 mg/L ZnSO4、0.25 mg/L Na2MoO4、0.025 mg/L CuSO4、0.025 mg/L CoCl2、0.83mg/L KI、1000mg/L PVP、2.4mg/L D-泛酸钙（VB5）、0.24mg/L生物素（VH）、100mg/L L-半胱氨酸、2mg/L甘氨酸、5mg/L烟酸（VB3）、2mg/L硫胺素（VB1）、0.5mg/L吡哆素（VB6）、37.3mg/LNa2-EDTA、27.8mg/L FeSO4、100mg/L肌醇、0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，PH值5.8~6.2。
作为进一步技术改进，以上所述的绿茶提取物的制备方法是：将绿茶粉末加入乙醇—水溶液，于50-55℃恒温水浴条件下进行2-3次超声波提取，得到混合液，再将混合液进行微波提取，过滤，得到绿茶提取液；
其中，所述的绿茶粉末与乙醇—水溶液的料液比为：1:20-40g/mL；
所述乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为70％～90％；
所述的超声时间为10-60min；超声功率为200～500w；
所述的微波功率为160-480w；微波时间为30-60s。
相比于现有技术，本发明具有以下优点及技术效果：
1、本发明通过将优树进行环割促萌，待长出新的萌条后，采集再生萌条作为外植体材料可以有效的保持了优良母本的稳定性状，对萌芽条进行水培，可以培养出健壮且有活力的枝条，为后续外植体的获取提供了良好的基础。
2、本发明的外植体是通过在培养室内进行水培而获取的，随用随取，可避免部分材料因长途运输导致诱导培养易褐化、难诱导等情况；且水培的培养基中的绿茶提取物具有抑菌效果，能有效防止枝条生菌，核黄素具有抗氧化性，有效防止新芽褐化，提高了材料的利用率。
3、本发明采用较低的温度进行绿茶提取，能够显著保留绿茶的活性成分，获得的绿茶提取物具有有效的抑菌作用，防止枝条生菌；同时利用了超声波提取技术的振动作用和空化效应，微波提取技术的破壁和加热作用，提取工艺简便，提高了提取效率，所用的提取溶剂无污染。
4、本发明的外植体是通过对萌芽条水培获取的，水培环境可控，可用低毒的次氯酸钠即可进行有效消毒，可使诱导无菌芽的污染率降低至1.0-5.0%，且不受季节的影响。
5、本发明的诱导培养基在以改良MS培养基的基础上，添加酚类物质的专一性吸附剂PVP，迅速有效的抑制桉树无菌芽的褐死，同时加入促进芽生长且粗壮的氨基酸和维生素，使得培养基的营养更加全面，无菌芽的萌动率90-95%。
6、本发明改良MS培养基根据桉树生理特性，相应调整了K、N、等含量，明确了矿质元素、激素、维生素、有机氮等活性物质成分的配比以及培养条件，无菌芽诱导率高达95%，且生长迅速、继代维持增殖正常，可满足下一步的增殖培养的需要，能适应林业产业化发展对桉树良种种苗的需求。
附图说明
图1为经过本发明水培促萌后的桉树枝条。
图2为经过本发明最后获得的生长健壮、活力旺盛的桉树无菌芽。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
一种桉树组培外植体制备及无菌芽诱导的方法，主要的操作步骤如下：
（1）优树选择
选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的桉树个体为优树；
（2）环割促萌
铲除优树周围杂灌，环割前一天于优树周围喷晒75%酒精进行消毒，在优树离地面20-25cm处进行环割树周长的3/4，环割宽度2 cm，剥皮并刮尽形成层至韧皮部；
（3）水培促萌
待萌芽条生长至直径2-3cm时，剪取60cm长、完全木质化且带潜伏芽的枝条，去除叶片，带回培养室进行水培，每4天喷洒一次体积浓度2%的绿茶提取物抑菌；所述的水培的培养基包括以下组分：每1L培养基中含50mg绿茶提取物，2.5mg核黄素（VB2），其余为纯水；
（4）外植体处理
待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡15s，无菌水清洗2-3次，然后用2%次氯酸钠浸泡1min，最后用无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；
（5）诱导培养
将步骤（4）处理好的外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养，暗培养7d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度1500ux条件下培养20d。
步骤（5）所述的诱导培养基为：改良MS培养基+5mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+2.4mg/L D-泛酸钙（VB5）+0.24mg/L生物素（VH）+2.5mg/L L-半胱氨酸；
所述的改良MS培养基的组成为：1800mg/L KNO3、360mg/L NH4NO3、270mg/L KH2PO4、200mg/L CaCl2、360mg/L MgSO4、10mg/L H3BO3、25 mg/L MnSO4、10 mg/L ZnSO4、0.25 mg/LNa2MoO4、0.025 mg/L CuSO4、0.025 mg/L CoCl2、0.83 mg/L KI、1000mg/L PVP、2.4mg/L D-泛酸钙（VB5）、0.24mg/L生物素（VH）、100mg/L L-半胱氨酸、2mg/L甘氨酸、5mg/L烟酸（VB3）、2mg/L硫胺素（VB1）、0.5mg/L吡哆素（VB6）、37.3mg/L Na2-EDTA、27.8mg/L FeSO4、100mg/L肌醇、0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，PH值5.8~6.2。
以上步骤（4）所述的绿茶提取物的制备方法是：将绿茶粉末加入乙醇—水溶液，于50℃恒温水浴条件下进行2-3次超声波提取，得到混合液，再将混合液进行微波提取，过滤，得到绿茶提取液；
其中，所述的绿茶粉末与乙醇—水溶液的料液比为：1:20g/mL；
所述乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为70％；
所述的超声时间为10min；超声功率为500w；
所述的微波功率为160w；微波时间为60s。
实施例2：
一种桉树组培外植体制备及无菌芽诱导的方法，主要的操作步骤如下：
（1）优树选择
选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的桉树个体为优树；
（2）环割促萌
铲除优树周围杂灌，环割前一天于优树周围喷晒75%酒精进行消毒，在优树离地面20-25cm处进行环割树周长的3/4，环割宽度2 cm，剥皮并刮尽形成层至韧皮部；
（3）水培促萌
待萌芽条生长至直径2-3cm时，剪取60cm长、完全木质化且带潜伏芽的枝条，去除叶片，带回培养室进行水培，每4天喷洒一次体积浓度2%的绿茶提取物抑菌；所述的水培的培养基包括以下组分：每1L培养基中含50mg绿茶提取物，2.5mg核黄素（VB2），其余为纯水；
（4）外植体处理
待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡15s，无菌水清洗2-3次，然后用2%次氯酸钠浸泡1min，最后用无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；
（5）诱导培养
将步骤（4）处理好的外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养，暗培养7d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度2000lux条件下培养22d。
步骤（5）所述的诱导培养基为：改良MS培养基+8mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+2.4mg/L D-泛酸钙（VB5）+0.24mg/L生物素（VH）+2.5mg/L L-半胱氨酸；
所述的改良MS培养基的组成为：1800mg/L KNO3、360mg/L NH4NO3、270mg/L KH2PO4、200mg/L CaCl2、360mg/L MgSO4、10mg/L H3BO3、25 mg/L MnSO4、10 mg/L ZnSO4、0.25 mg/LNa2MoO4、0.025 mg/L CuSO4、0.025 mg/L CoCl2、0.83 mg/L KI、1000mg/L PVP、2.4mg/L D-泛酸钙（VB5）、0.24mg/L生物素（VH）、100mg/L L-半胱氨酸、2mg/L甘氨酸、5mg/L烟酸（VB3）、2mg/L硫胺素（VB1）、0.5mg/L吡哆素（VB6）、37.3mg/L Na2-EDTA、27.8mg/L FeSO4、100mg/L肌醇、0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，PH值5.8~6.2。
以上步骤（4）所述的绿茶提取物的制备方法是：将绿茶粉末加入乙醇—水溶液，于53℃恒温水浴条件下进行2-3次超声波提取，得到混合液，再将混合液进行微波提取，过滤，得到绿茶提取液；
其中，所述的绿茶粉末与乙醇—水溶液的料液比为：1:25g/mL；
所述乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为80％；
所述的超声时间为30min；超声功率为300w；
所述的微波功率为240w；微波时间为45s。
实施例3：
一种桉树组培外植体制备及无菌芽诱导的方法，主要的操作步骤如下：
（1）优树选择
选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的桉树个体为优树；
（2）环割促萌
铲除优树周围杂灌，环割前一天于优树周围喷晒75%酒精进行消毒，在优树离地面20-25cm处进行环割树周长的3/4，环割宽度2 cm，剥皮并刮尽形成层至韧皮部；
（3）水培促萌
待萌芽条生长至直径2-3cm时，剪取60cm长、完全木质化且带潜伏芽的枝条，去除叶片，带回培养室进行水培，每4天喷洒一次体积浓度2%的绿茶提取物抑菌；所述的水培的培养基包括以下组分：每1L培养基中含50mg绿茶提取物，2.5mg核黄素（VB2），其余为纯水；
（4）外植体处理
待潜伏芽萌发并生长至3-4cm时，剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡15s，无菌水清洗2-3次，然后用2%次氯酸钠浸泡1min，最后用无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；
（5）诱导培养
将步骤（4）处理好的外植体接种到诱导培养基上进行诱导培养，暗培养7d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度2000lux条件下培养25d。
步骤（5）所述的诱导培养基为：改良MS培养基+10mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）+2.4mg/L D-泛酸钙（VB5）+0.24mg/L生物素（VH）+2.5mg/L L-半胱氨酸；
所述的改良MS培养基的组成为：1800mg/L KNO3、360mg/L NH4NO3、270mg/L KH2PO4、200mg/L CaCl2、360mg/L MgSO4、10mg/L H3BO3、25 mg/L MnSO4、10 mg/L ZnSO4、0.25 mg/LNa2MoO4、0.025 mg/L CuSO4、0.025 mg/L CoCl2、0.83 mg/L KI、1000mg/L PVP、2.4mg/L D-泛酸钙（VB5）、0.24mg/L生物素（VH）、100mg/L L-半胱氨酸、2mg/L甘氨酸、5mg/L烟酸（VB3）、2mg/L硫胺素（VB1）、0.5mg/L吡哆素（VB6）、37.3mg/L Na2-EDTA、27.8mg/L FeSO4、100mg/L肌醇、0.4mg/L 6-BA、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂粉，PH值5.8~6.2。
以上步骤（4）所述的绿茶提取物的制备方法是：将绿茶粉末加入乙醇—水溶液，于55℃恒温水浴条件下进行2-3次超声波提取，得到混合液，再将混合液进行微波提取，过滤，得到绿茶提取液；
其中，所述的绿茶粉末与乙醇—水溶液的料液比为：1:40g/mL；
所述乙醇-水溶液中乙醇的体积分数为90％；
所述的超声时间为60min；超声功率为200w；
所述的微波功率为480w；微波时间为30s。
对比例1：
选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的桉树；选取完全木质化的枝条，去除叶片，剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡15s，无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；将外植体接种到MS培养基上进行诱导培养，暗培养7d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度2000lux条件下培养20-25d。
对比例2：
选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的桉树；铲除桉树周围杂灌，环割前一天于优树周围喷晒75%酒精进行消毒，在桉树离地面20-25cm处进行环割树周长的3/4，环割宽度2 cm，剥皮并刮尽形成层至韧皮部；选取完全木质化且带潜伏芽的枝条，去除叶片，选取完全木质化且带潜伏芽的枝条，去除叶片，带回培养室用纯水进行水培，剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡15s，无菌水清洗2-3次，然后用2%HgCl2溶液浸泡1min，最后用无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；将外植体接种到MS培养基上进行诱导培养，暗培养7d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度2000lux条件下培养20-25d。
对比例3：
选择样地内树高、胸径、单株材积等生长指标前5%，且无病虫害、干形通直、分枝小的桉树；铲除桉树周围杂灌，环割前一天于优树周围喷晒75%酒精进行消毒，在桉树离地面20-25cm处进行环割树周长的3/4，环割宽度2 cm，剥皮并刮尽形成层至韧皮部；选取完全木质化且带潜伏芽的枝条，去除叶片，带回培养室用纯水进行水培，待潜伏芽萌发长出后剪取2-3cm茎段作为外植体，将外植体用75%酒精浸泡15s，无菌水清洗2-3次，然后用2%次氯酸钠浸泡1min，最后用无菌水清洗2-3次，用滤纸吸干，备用；将外植体接种到MS培养基上进行诱导培养，暗培养7d后，在温度25±2℃，光照12h/d，光照强度1500-2000lux条件下培养20-25d。
经检测，结果如下：
具体地，实施例1-3所得的外植体组织无褐化现象，外植体杀菌消毒较为彻底，无菌芽萌动发生率高，诱导率高，可获得生长健壮、活力旺盛的桉树无菌芽；
对比例1外植体组织褐化坏死现象严重，外植体消毒不彻底现象严重，无菌芽萌动发生率低，诱导率低，出现僵苗；
对比例2出现外植体组织褐化坏死现象，外植体消毒不彻底现象严重，无菌芽萌动发生率低，诱导率低，出现僵苗；
对比例3出现外植体组织褐化坏死现象，出现明显的外植体消毒不彻底现象，无菌芽萌动发生率低，诱导率低，出现僵苗。
以上内容是结合具体的/优选的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，其还可以对这些已描述的实施例做出若干替代或变型，而这些替代或变型方式都应视为属于本发明的保护范围。
