一种大麦类作物专用的促生防病菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种大麦类作物专用的促生防病菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
大麦类作物是禾本科、大麦属一年生草本植物的统称。其是世界上最古老的种植作物之一，具有食用、饲用、酿造、药用等多种用途，且其适应性较强强，我国南北各地均有种植。我国古代人民很早就发现了大麦的药用价值，《唐本草》记载，“大麦面平胃，止渴，消食，疗胀”，《本草拾遗》记载，大麦有“调中止泄”之功效，《本草纲目》记载，大麦“宽胸下气，凉血，消积，进食”。现代营养学研究证实，大麦营养成分较为丰富，每100克大麦含蛋白质10.2克，脂肪1.4克，碳水化合物63.4克，膳食纤维9.9克，钙66毫克，磷381毫克，铁6.4毫克。此外，还含有维生素、硫胺素、核黄素、尼克酸、尿囊素等，大麦胚芽中，维生素B1的含量较小麦更多。随着研究工作的深入，大麦的价值得到了越来越多的认可。然而另一方面，大麦作为一种氮素需求量较高的作物，其种植过程中普遍存在化肥过量使用问题一直饱受诟病。此外，集中连片种植带来的病害频发问题也引起了广泛的关注和担忧。因此，如何更加绿色环保的种植大麦，如何安全有效的防控大麦类作物的病害成为了广大农业种植者关心的问题。
在此背景下，农用生物菌剂技术带来了新的希望，微生物菌剂是将目标微生物(促生菌、生防菌等)通过一定的技术手段制成的活菌制剂，其一般具有改良土壤、恢复地力、预防土传病害、维持根际微生物区系平衡和降解有毒害物质等作用。正确运用农用微生物菌剂，可以达到减少化肥用量、提高作物产量、改善农产品品质、改良土壤的目的，与传统的化学农药和化肥相比，其不仅更加绿色环保，成本也更低。
随着人民生活水平的不断提高，食品安全、生态安全问题日益受到关注，发展绿色农业成为了共识。绿色农业生产过程要求不用或尽量少用(或限量使用)化学肥料、化学农药和其它化学物质。它要求肥料必须首先保护和促进施用对象生长和提高品质；其次是不造成施用对象产生和积累有害物质；三是对生态环境无不良影响。而农用微生物菌剂正好契合了绿色农业的发展理念。
但是，农用微生物菌剂的发展也有限制性因素，微生物菌剂作用的发挥依赖于其含有的活性菌株，因此，其发挥作用的先决条件是其菌株要能在作物根系表面稳定存活和定殖，微生物结构简单、环境适应范围有限，且其对宿主植物具有选择性。这就决定了微生物菌剂的使用具有一定的作物专一性。目前市场上农用菌剂的种类虽然很多，但是其市场认可度普遍不高，主要原因就是没有充分考虑微生物的环境适应性和作物专用性。
大麦类作物是对国民经济有重要价值的一类作物，但是目前尚没有专门针对大麦类作物的微生物菌剂产品，这不利于大麦的绿色种植。因此，亟待一种以分离自大麦类作物根际环境中的优良功能菌株(具有促进大麦类作物生长，防治病害发生的功能微生物)为原材料，通过发酵技术制成的菌剂。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种大麦类作物专用的促生防病菌剂及其制备方法和应用；以达到促进大麦类作物生长、减少化肥和农药用量、防治大麦类作物的病害发目的。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，是由按照重量份计的以下原料制备得到的：假单孢菌Pseudomonas%20sp.Xp-2菌株发酵液5-10份、蜡样芽孢杆菌Bacillus%20cereus%20Xp-4菌株发酵液5-10份、蕈状芽孢杆菌Bacillus%20mycoides%20Gnyt1菌株发酵液5-10份、腐熟的秸秆25-35份、马铃薯渣15-20份、食用菌渣10-20份，泥炭5-10份，稀土凹凸棒粉5～10份、腐殖酸5～10份、黄腐酸钾2～5份、硫酸镁1-2份。
进一步的，上述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，是由按照重量份计的以下原料制备得到的：假单孢菌Pseudomonas%20sp.Xp-2菌株发酵液5份、蜡样芽孢杆菌Bacillus%20cereus%20Xp-4菌株发酵液5份、蕈状芽孢杆菌Bacillus%20mycoides%20Gnyt1菌株发酵液10份、腐熟的秸秆30份、马铃薯渣15份、食用菌渣10份，泥炭10份，稀土凹凸棒粉5份、腐殖酸5份、黄腐酸钾3份、硫酸镁2份。
进一步的，上述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，所述假单孢菌Pseudomonas%20sp.Xp-2菌株，已于2018年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCC%20M%202018753；所述蜡样芽孢杆菌Bacillus%20cereus%20Xp-4菌株，已于2018年11月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCC%20M%202018751；所述蕈状芽孢杆菌Bacillus%20mycoides%20Gnyt1菌株，已于2017年4月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为：武汉市武昌珞珈山)，保藏编号为CCTCC%20M%202017177。
假单孢菌Pseudomonas%20sp.Xp-2菌株具有生物固氮、溶解土壤中难溶性磷，高效拮抗Fusarium、Bipolaris等属的植物病原真菌的作用；
蜡样芽孢杆菌Bacillus%20cereus%20Xp-4菌株具有高效拮抗Fusarium、Rhizoctonia、Bipolaris等属的植物病原真菌的作用，兼有溶磷和固氮功能，此外该菌株能产生内毒素，对病原线虫有一定的杀灭作用；
蕈状芽孢杆菌Bacillus%20mycoides%20Gnyt1菌株具有高效溶磷、固氮、分泌植物激素、拮抗植物病原菌的能力。
进一步的，上述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，所述腐熟的秸秆中，秸秆为玉米秸秆、麦类秸秆、水稻秸秆以及其它禾谷类作物秸秆中的一种或多种，使用前加水堆沤腐熟，腐熟过程中保持水分含量在40～65％之间，密闭发酵60天以上使其充分腐熟；腐熟后晒干，使其含水量小于等于10％，粉碎后过100～200目筛即可。
进一步的，上述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，所述马铃薯渣为马铃薯加工的废弃物，使用前除去杂质，充分晒干或烘干，使其含水量小于等于10％，粉碎后过100～200目筛即可；所述食用菌渣为香菇渣、平菇渣、金针菇渣、双孢菇渣中的一种或多种的混合物，使用前拣除有明显发霉的菌渣和石块、塑料杂物，充分晒干，使其含水量小于等于10％，粉碎后过100～200目筛即可。
进一步的，上述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，所述泥炭使用前除去杂质，充分晒干或烘干，使其含水量小于等于10％，粉碎后过100～200目筛即可；所述稀土凹凸棒粉、腐殖酸、黄腐酸钾使用前粉碎，过100～200目筛即可；所述硫酸镁为工业级及以上纯度。
本发明的第二个目的是提供了上述一种大麦类作物专用的促生防病菌剂的制备方法，包括以下步骤：
1)制备大麦类作物专用促生防病菌剂载体：
按照配比将腐熟的秸秆、马铃薯渣、食用菌渣、泥炭、稀土凹凸棒粉、腐殖酸、黄腐酸钾和硫酸镁混合均匀，在121℃，0.1MPa高温高压条件下灭菌2小时，冷却至室温后制备为已灭菌的载体，备用；
2)配制LB液体培养基，分别接种假单孢菌Pseudomonas%20sp.Xp-2菌株、蜡样芽孢杆菌Bacillus%20cereus%20Xp-4菌株、蕈状芽孢杆菌Bacillus%20mycoides%20Gnyt1菌株、接种量均为5％，在28～32℃、摇床转速180r/min条件下，培养36-48小时，实时监测培养液中活菌浓度，当假单孢菌Pseudomonas%20sp.Xp-2菌株、蜡样芽孢杆菌Bacillus%20cereus%20Xp-4菌株、蕈状芽孢杆菌Bacillus%20mycoides%20Gnyt1菌株在培养液中的活菌菌体浓度达到109cfu/mL时，终止培养，备用；
3)将步骤1)得到的已灭菌的载体和步骤2)得到的培养菌液，在无菌条件下按配比混合均匀，并保持无菌状态，置于28～32℃下培养5-9天，即得到所述大麦类作物专用的促生防病菌剂。
进一步的，上述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂的制备方法，所述大麦类作物专用促生防病菌剂载体的制备方法中，腐熟的秸秆、马铃薯渣、食用菌渣、泥炭、稀土凹凸棒粉、腐殖酸、黄腐酸钾和硫酸镁是按照以下操作处理的：腐熟的秸秆处理中，是将秸秆加水堆沤，使其腐熟，整个腐熟过程保持水分含量在40～65％之间，密闭发酵60天以上，腐熟后晒干，使其含水量小于等于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；马铃薯渣处理中，是将其除去杂质，充分晒干或烘干，使其含水量小于等于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；食用菌渣处理中，是拣除有明显发霉的食用菌渣和石块、塑料杂物，充分晒干，使其含水量小于等于10％，粉碎后过100～200目筛，备用；泥炭处理中，是拣除泥炭中的杂质，充分晒干，使其含水量小于等于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；稀土凹凸棒粉、腐殖酸、黄腐酸钾和硫酸镁的处理中，是将稀土凹凸棒粉、腐殖酸、黄腐酸钾、硫酸镁粉碎并过100～200目筛，备用。
本发明的第三个目的是提供了上述一种大麦类作物专用的促生防病菌剂在大麦种植过程中的应用，所述大麦类作物专用的促生防病菌剂是在大麦类作物种植时拌种使用，使用量及使用方法为：
A)预先将土地翻耕松软，整平；
B)准备好大麦类作物种子，置于干净的拌种器中，添加所述的大麦类作物专用的促生防病菌剂，添加量为每100千克种子使用菌剂3～6千克；
C)添加适量的无菌水或凉开水、充分拌匀，直至所述菌剂全部粘附在种子上为止；
D)将拌好的种子在阴凉避光条件下晾至松散；
E)按常规方法播种。
本发明的第四个目的是提供了上述一种大麦类作物专用的促生防病菌剂在大麦种植过程中的另一种应用，所述大麦类作物专用的促生防病菌剂是在大麦类作物苗期追肥或病害预防使用，使用量及使用方法为：
a)预先除去田间杂草；
b)条播的大麦类作物的行间开沟，施入所述的大麦类作物专用的促生防病菌剂，施用量为每亩10-20千克。
本发明所述一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，其有益效果在于：
(1)本发明所述大麦类作物专用促生防病菌剂具有提高土壤氮素以及有效磷的含量，抵抗病原真菌，降低病害发生率的作用，从而促进作物生长，提高作物产量；且该菌剂绿色、低碳、无污染，不会造成食品安全问题和生态环境问题。
(2)本发明所述的大麦类作物专用促生防病菌剂，其活性菌株与大麦类作物亲和力高，能很好的在大麦类作物根系表面存活和定殖，因此其效果稳定可靠。
(3)本发明所述的大麦类作物专用促生防病菌剂，其载体以秸秆、马铃薯渣、食用菌渣等农业废弃物为主，添加泥炭、稀土凹凸棒粉、腐殖酸、黄腐酸钾、硫酸镁等成分，不仅营养丰富、性能优良，为活性菌株和植物提供全面的养分，而且具有环保低碳、变废为宝的优点。
(4)本发明所述的大麦类作物专用促生防病菌剂，具有改良土壤质地、增加土壤养分、分解有害物质、防止土壤板结的作用。
(5)本发明所述的大麦类作物专用促生防病菌剂，具有成本低廉、效益突出的优点。
具体实施方式
本发明所用原料来源：
泥炭：致远泥炭土，生产厂家：清原满族自治县致远草炭土经销处。
稀土凹凸棒粉：宏久牌稀土凹凸棒粉(货号：0010)，生产厂家：明光宏久环保材料有限公司
腐殖酸：盛大生物腐殖酸原粉1型，生产厂家：吕梁市盛大生物发展有限公司。
黄腐酸钾：盛大生物黄腐酸钾粉，生产厂家：吕梁市盛大生物发展有限公司。
实施例1：
大麦类作物专用促生防病菌剂，按照重量计，组分主要由假单孢菌Pseudomonassp.Xp-2菌株(CCTCC%20M%202018753)发酵液10kg、蜡样芽孢杆菌Bacillus%20cereus%20Xp-4菌株(CCTCC%20M%202018751)发酵液10kg、蕈状芽孢杆菌Bacillus%20mycoides%20Gnyt1菌株(CCTCC%20M2017177)发酵液10kg、腐熟的秸秆25kg、马铃薯渣15kg、食用菌渣10kg，泥炭5kg，稀土凹凸棒粉5kg、腐殖酸5kg、黄腐酸钾4kg、硫酸镁1kg组成。
其制备方法如下：
(1)载体的制备：
①将秸秆加水堆沤，使其腐熟，整个腐熟过程保持水分含量在40～65％之间，密闭发酵60d以上；腐熟后晒干，使其含水量低于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；
②将马铃薯渣除去杂质，充分晒干或烘干，使其含水量低于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；
③拣除食用菌渣中的石块、塑料等杂物和有明显发霉的菌渣，充分晒干，使其含水量低于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；
④拣除泥炭中的杂质，充分晒干，使其含水量低于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；
⑤将有稀土凹凸棒粉、腐殖酸、黄腐酸钾、硫酸镁等原料粉碎并过100～200目筛，备用；
⑥将①～⑤中准备好的原料按照比例混合均匀；
⑦将上述混匀的载体在121℃，0.1MPa高温高压条件下灭菌2小时冷却至室温后制备为已灭菌的载体，备用。
(2)菌剂的制备：
①配制LB液体培养基，分别接种假单孢菌Pseudomonas%20sp.Xp-2菌株、蜡样芽孢杆菌Bacillus%20cereus%20Xp-4菌株、蕈状芽孢杆菌Bacillus%20mycoides%20Gnyt1菌株，接种量均为5％，在28～32℃、摇床转速180r/min条件下，培养36-48小时，实时监测培养液中活菌浓度，当培养液中的活菌浓度达到109cfu/mL时，终止培养，备用；
②将准备好的菌液和已灭菌的载体，在无菌条件下按比例混合均匀，并保持无菌状态，置于28～32℃下培养5-9天备用，即成一种大麦类作物专用的促生防病菌剂。
田间实验
(1)实验材料：实验用菌剂为根据上述配方及方法配制的菌剂，对照为不施任何菌剂或化肥。实验用植物选择青稞(裸大麦)。选择饱满、纯净的种子备用。
(2)实验地点：实验地点位于甘肃省武威市天祝藏族县打柴沟镇。
(3)实验方法：
①预先将土地翻耕松软，整平；
②准备好青稞种子，置于干净的拌种器中，添加所述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，添加量为每100千克种子使用菌剂3～6千克；
③添加适量的无菌水或凉开水、充分拌匀，直至所述菌剂全部粘附在种子上为止；
④将拌好的种子在阴凉避光条件下晾至松散；
⑤按常规方法播种。
(4)指标的测定
青稞灌浆期统计根部病害发病率、株高；籽粒成熟后统计青稞的产量、千粒重等指标。表1显示为按照实施例1配比的大麦类作物专用促生防病菌剂的使用效果。
表1
由表1可以看出，施用上述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，可以明显促进青稞的生长，使得青稞的株高提高30.88％，产量提高33.13％，青稞籽粒的千粒重增加16.90％，还有效降低青稞根部病害的发生率85.83％。
上述一种大麦类作物专用的促生防病菌剂储存于室温下，6个月后检测其活菌数，达9.27×108cfu/g。符合《中华人民共和国农业行业标准(NY/T 1113-2006)》之规定。
实施例2：
大麦类作物专用促生防病菌剂，按照重量计，组分主要由假单孢菌Pseudomonassp.Xp-2菌株(CCTCC M 2018753)发酵液8kg、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus Xp-4菌株(CCTCC M 2018751)发酵液7kg、蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoides Gnyt1菌株(CCTCC M2017177)发酵液10kg、腐熟的秸秆30kg、马铃薯渣15kg、食用菌渣10kg，泥炭5kg，稀土凹凸棒粉5kg、腐殖酸5kg、黄腐酸钾3kg、硫酸镁2kg组成。
其制备方法如下：
(1)载体的制备：
①将秸秆加水堆沤，使其腐熟，整个腐熟过程保持水分含量在40～65％之间，密闭发酵60d以上；腐熟后晒干，使其含水量低于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；
②将马铃薯渣除去杂质，充分晒干或烘干，使其含水量低于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；
③拣除食用菌渣中的石块、塑料等杂物和有明显发霉的菌渣，充分晒干，使其含水量低于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；
④拣除泥炭中的杂质，充分晒干，使其含水量低于10％，粉碎并过100～200目筛，备用；
⑤将有稀土凹凸棒粉、腐殖酸、黄腐酸钾、硫酸镁等原料粉碎并过100～200目筛，备用；
⑥将①～⑤中准备好的原料按照比例混合均匀；
⑦将上述混匀的载体在121℃，0.1MPa高温高压条件下灭菌2小时冷却至室温后制备为已灭菌的载体，备用。
(2)菌剂的制备：
①配制LB液体培养基，分别接种假单孢菌Pseudomonas sp.Xp-2菌株、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus Xp-4菌株、蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoides Gnyt1菌株，接种量均为5％，在28～32℃、摇床转速180r/min条件下，培养36-48小时，实时监测培养液中活菌浓度，当培养液中的活菌浓度达到109cfu/mL时，终止培养，备用；
②将准备好的菌液和已灭菌的载体，在无菌条件下按比例混合均匀，并保持无菌状态，置于28～32℃下培养5-9天备用，即成一种大麦类作物专用的促生防病菌剂。
田间实验
(1)实验材料：实验用菌剂为根据上述配方及方法配制的菌剂，对照为不施任何菌剂或化肥。实验用植物选择大麦。选用饱满、纯净的种子备用。
(2)实验地点：实验地点位于甘肃省定西市岷县寺沟镇
(3)实验方法：
①预先除去田间杂草；
②条播的大麦类作物的行间开沟，施入所述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂，施用量为每亩10-20千克。
(4)指标的测定
青稞灌浆期统计根部病害发病率、株高；籽粒成熟后统计青稞的产量、千粒重等指标。表2显示为按照实施例2配比的大麦类作物专用促生防病菌剂的使用效果。
表2
根据表2，使用本发明所述的一种大麦类作物专用的促生防病菌剂后，青稞灌浆期根部病害的发生率降低了35.40％，灌浆期株高增加6.06％，成熟期千粒重和产量分别提高了10.32％和41.31％，表明使用本发明菌剂可以促进大麦生长，提高大麦产量，并能降低根部病害的发生率。
上述一种大麦类作物专用的促生防病菌剂储存于室温下，6个月后检测其活菌数，达7.84×108cfu/g。符合《中华人民共和国农业行业标准(NY/T 1113-2006)》之规定。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
