一种复合微生物、菌剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种复合微生物、菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
烟草在中国作为一种特殊的农作物，所产烟叶可以作为制作香烟的原料，而烟草的根与茎不适用做香烟则被当作废物丢弃。我国作为烟草种植生产大国，在烟草的种植过程中不可避免的会产生大量废弃物，这样既造成了资源浪费，也可能造成环境污染。
近年来，国家逐渐加强环境保护和农业废物资源化利用力度，而烟草废弃物行业也不例外。而烟草秸秆中的有机质含量约占90％～95％；矿物质氮、磷和钾的含量约占5％～10％，与其他农作物秸秆相比，烟草秸秆具有独特的优势。同时，烟草秸秆含有大量的木质素和纤维素，一般的微生物很难进行分解，不能直接返回田间，所以现今的研究中，烟草秸秆的综合利用不仅有了良好的发展前景也伴随着巨大的困难和挑战，也是农业上可持续发展的重要任务。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种复合微生物、菌剂及其制备方法和应用，所述复合微生物能够降解纤维素，具有很强的烟草秸秆降解能力；利用复合微生物菌剂进行烟草秸秆堆肥，能够显著缩短堆肥时间，提高堆肥品质。
本发明提供了一种复合微生物，包括活菌数比为(1～2):(1～2)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SL-3A和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SL-7；所述枯草芽孢杆菌SL-3A的保藏编号为GDMCC NO.60629；所述解淀粉芽孢杆菌SL-7的保藏编号为GDMCC NO.60630。
本发明提供了一种降解纤维素的复合微生物菌剂，包括所述的复合微生物。
优选的，所述复合微生物菌剂的总活菌数为7.8×1010～9.0×1010CFU/mL。
本发明提供了所述的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述枯草芽孢杆菌SL-3A和所述解淀粉芽孢杆菌SL-7分别活化后、接种至发酵培养基进行混合发酵培养获得复合微生物菌剂。
优选的，所述混合发酵培养的培养基为CMC培养基.
优选的，所述混合发酵培养的温度为36～38℃，所述混合发酵培养的时间为65～75h。
本发明提供了所述的复合微生物、所述的复合微生物菌剂在制备烟草秸秆堆肥中的应用。
优选的，包括以下步骤：
1)将复合微生物菌剂与烟草秸秆混合，并调节含水量至55％～65％获得堆肥原料；
2)将所述堆肥原料制成堆肥堆体，进行堆肥，所述堆肥期间，当温度为48～52℃时，每两天进行一次翻堆，直至温度小于40℃并且不再升高停止翻堆；所述堆肥进行38～42d后结束。
优选的，步骤1)中复合微生物菌剂与烟草秸秆的质量比为1:(4～6)。
本发明提供了一种烟草秸秆堆肥，通过所述应用制备获得。
本发明的有益效果：本发明提供的复合微生物包括活菌数比为(1～2):(1～2)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SL-3A和解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)SL-7；本发明将所述枯草芽孢杆菌SL-3A和解淀粉芽孢杆菌SL-7复配获得的复合微生物具有较强的降解纤维素的能力，能够很好的降解烟草秸秆；利用复合微生物菌剂进行烟草秸秆堆肥，能够有效的缩短堆肥腐熟时间，提高堆肥品质。在本发明中，所述复合微生物菌剂在堆肥过程中不仅可以保持较长时间的高温，而且能明显缩短烟草秸秆生产有机肥的腐熟时间，在有机肥品质方面可以保持肥料中的有效氮并且能有效减少有机肥中的毒性物质，在有机肥生产中具有良好的应用前景。
利用本发明提供的复合微生物菌剂进行烟草秸秆堆肥的效果明显由于商业的EM细菌液体菌剂和空白对照。
生物保藏说明
枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis SL-3A，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2019年4月11日，保藏编号为GDMCC 60629。
解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens SL-7，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2019年4月11日，保藏编号为GDMCC NO:60630。
附图说明
图1为三种不同处理堆肥随着时间的温度变化；
图2为三种不同处理堆肥随着时间的含水率变化；
图3为三种不同处理堆肥随着时间的pH值变化；
图4为三种不同处理堆肥随着时间的电导率变化；
图5为三种不同处理堆肥随着时间的粗纤维降解率变化；
图6为三种不同处理堆肥随着时间的全氮含量变化；
图7三种不同处理堆肥随着时间的总含碳量变化；
图8为三种不同处理堆肥随着时间的碳氮比变化；
图9为三种不同处理堆肥随着时间的粗灰分变化；
图10为三种不同处理堆肥随着时间的腐殖质含量变化；
图11为三种不同处理获得的堆肥对黄瓜种子发芽率的影响；
图12为施用三种不同处理获得的堆肥对田间玉米植株生长的影响；
图13为施用三种不同处理获得的堆肥对田间玉米植株生长的实景图；
图14为不同浓度的微生物复合菌剂获得的堆肥对田间玉米植株生长的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种复合微生物，包括活菌数比为(1～2):(1～2)的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SL-3A和解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SL-7；所述枯草芽孢杆菌SL-3A的保藏编号为GDMCC NO.60629；所述解淀粉芽孢杆菌SL-7的保藏编号为GDMCC NO.60630。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌SL-3A和解淀粉芽孢杆菌SL-7均分离自烟草秸秆废弃物；在本发明中，所述枯草芽孢杆菌SL-3A和解淀粉芽孢杆菌SL-7的活菌数比优选为1:1。
本发明还提供了一种降解纤维素的复合微生物菌剂，包括所述的复合微生物。在本发明中，所述复合微生物菌剂优选为液体菌剂，所述复合微生物菌剂的总活菌数优选为7.8×1010～9.0×1010CFU/mL。
本发明还提供了所述的复合微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：将所述枯草芽孢杆菌SL-3A和所述解淀粉芽孢杆菌SL-7分别活化后、接种至发酵培养基进行混合发酵培养获得复合微生物菌剂。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌SL-3A和所述解淀粉芽孢杆菌SL-7优选的分别在LB培养基中进行活化，在本发明中，所述活化的温度优选为36～38℃，更优选为37℃；所述活化的时间优选为10～14h，更优选为12h；所述活化的转速优选为150～200rpm，更优选为180rpm。本发明在所述获得后，分别获得枯草芽孢杆菌SL-3A种子液和解淀粉芽孢杆菌SL-7种子液。
本发明在获得所述枯草芽孢杆菌SL-3A种子液和解淀粉芽孢杆菌SL-7种子液后，将所述枯草芽孢杆菌SL-3A种子液和解淀粉芽孢杆菌SL-7种子液依次接入发酵培养基中进行混合发酵培养。本发明对所述枯草芽孢杆菌SL-3A种子液和解淀粉芽孢杆菌SL-7种子液的接种顺序没有特殊限定，两种种子液先后接种或同时接种均可。在本发明中，所述枯草芽孢杆菌SL-3A种子液和解淀粉芽孢杆菌SL-7种子液的接种量独立优选为6％～10％，更优选为8％。在本发明中，所述混合发酵培养的培养基优选为CMC培养基；所述混合发酵培养的温度优选为36～38℃，更优选为37℃，所述混合发酵培养的时间优选为65～75h，更优选为72℃；所述混合发酵培养的转速优选为180～220rpm，更优选为200rpm。
本发明提供了所述的复合微生物、所述的复合微生物菌剂在制备烟草秸秆堆肥中的应用。
在本发明中，所述应用包括以下步骤：1)将复合微生物菌剂与烟草秸秆混合，并调节含水量至55％～65％获得堆肥原料；2)将所述堆肥原料制成堆肥堆体，进行堆肥，所述堆肥期间，当温度为48～52℃时，每两天进行一次翻堆，直至温度小于40℃并且不再升高停止翻堆；所述堆肥进行38～42d后结束。
在本发明中，将复合微生物菌剂与烟草秸秆混合，并调节含水量至55％～65％获得堆肥原料。在本发明中，所述复合微生物菌剂与烟草秸秆的质量比优选为1:(4～6)，更优选为1:5。在本发明具体实施过程中，优选的将烟草秸秆摊平，并将所述复合微生物菌剂均匀喷洒至所述烟草秸秆的表面，然后进行混匀。在本发明中，含水量优选的调节至58％～65％，更优选为65.00％。
本发明在获得所述堆肥原料后，将所述堆肥原料制成堆肥堆体，进行堆肥。在本发明中，所述堆肥优选的在堆肥容器中进行；所述堆肥容器优选为带盖塑料桶，在本发明中，所述堆肥堆体优选为锥形；所述堆肥堆体的高度优选为0.45～0.55m，更优选为0.5m。在本发明中，堆肥的第一天优选的记为0天，当所述堆肥的温度升至48～52℃时进行翻堆，所述翻堆每两天进行一次，直至温度小于40℃并且不再升高停止翻堆。在本发明中，所述堆肥进行38～42d后结束，优选的进行41d后结束。
本发明提供了一种烟草秸秆堆肥，通过所述应用制备获得。本发明提供的烟草秸秆堆肥中不含有毒物质，对种子发芽不产生负面效应；并且所述堆肥能够促进玉米植株生长，效果优于用商业菌剂进行烟草秸秆获得的堆肥。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
实验材料
堆肥原料：所需堆肥原料取自于安徽省阜阳市阜阳师范大学久置的烟草秸秆废墟。
堆肥装置：选取100L带盖的塑料桶(上口径50cm，下口径40cm，高度62cm)，外加厚5mm珍珠棉的简易堆肥装置。
堆肥菌剂：2株高效纤维素降解细菌；枯草芽孢杆菌SL-3A(菌种保藏号：GDMCCNO.606292019.04.11)、解淀粉芽孢杆菌SL-7(菌种保藏号：GDMCC NO.606302019.04.11)
复合微生物菌剂(以下称为菌剂ZZ)；接种企业(EM菌液)原有有机肥作为菌种(以下简称WG)；并以不添加菌剂的菌糠直接堆肥作为参照(以下简称KB)。
制备菌剂所需培养基
LB液体培养基(种子液)：蛋白胨10.0g，酵母膏5.0g，NaCl 10.0g，去离子水lL，自然pH；
CMC发酵产酶培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，NaCl 1.5g，CMC-Na10.0g，KH2PO41.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，去离子水lL，自然pH；
秸秆高效降解菌剂-复合微生物菌剂的构建
对SL-3A和SL-7两株功能菌进行单独培养，然后按1：1的配比将其接种至CMC发酵产酶培养基中进行组合培养，来构建高效降解菌剂。
将枯草芽孢杆菌SL-3A和解淀粉芽孢杆菌SL-7分别接种于LB液体培养基中，于37℃，转速为180rpm恒温培养箱中过夜培养获得种子液，种子液的OD600为0.6-0.8时。然后按照接种量8％将种子液接种于CMC发酵培养基中，置于恒温培养箱中37℃，200rpm发酵72h；获得复合微生物菌剂。
堆制菌糠堆肥
菌剂投加
将菌剂添加到喷壶中，然后把烟草秸秆堆肥原料摊开，再用喷壶把菌剂按照与烟草秸秆堆肥原料1:5的质量配比均匀喷洒在摊开的烟草秸秆堆肥原料表面。喷洒完毕后.再搅拌均匀，并调节混合物含水率为65.00％。
堆肥堆体堆制
将调节含水率和施加完菌剂的烟草秸秆原料加到堆肥装置(100L带盖的塑料桶)中，堆制成高约0.5m的锥形堆体。每隔三日同一时间测量堆肥的温度，测量温度的点位于堆体中下部。堆肥的第一天记为第0天，起初盖上塑料桶的盖子，待堆肥的温度升至50℃时，同时对三个不同处理的堆肥进行翻堆，隔两天翻堆一次。待堆肥的温度降至40℃以下并不再上升的时候，停止进行翻堆。
堆肥理化特性测定
气味与色度
堆肥的颜色变化会随着堆肥进程发展而逐渐的加深，腐熟的堆肥颜色会呈深褐色或者黑褐色，气味会随着堆肥的进行呈现由原来的腐臭味变为香味。在本实施例堆肥过程中，通过嗅觉和拍照方式来记下气味与色度变化。
温度
温度是堆肥堆置过程中的最重要检测指标之一。测量时，用温度计测量堆体中下温度，用以记录整个堆肥过程中温度变化，并记录此时的环境温度。
含水率
具体步奏参照食品安全国家标准GB 5009.3—2010中的有关水分测定。
酸碱度(pH)与电导率(Ec)
采用三点取样法，取出的堆肥样品充分混匀后，准确称取10.0g样品于烧杯中，加入100mL的蒸馏水，搅拌并恒温摇床振荡30min(150rpm)。将pH计与电导率仪放入混浊液中，稳定后读数并记录。
粗纤维素
参照Van Soest法有关粗纤维素的测定。
总氮与总碳
采用元素分析仪测定总氮与总碳。
腐殖质
参照的是生物有机肥执行标准NY 884—2012中的有关腐殖质测定。
种子发芽指数(GI)
参照ZucconiF等(ZucconiF,PeraA,Forte M,et al.Evaluating toxicity ofimmature compost[J].Biocycle,1981a,22:54-57.)中有关种子发芽指数的测定，在本实施例中选用黄瓜种子。
种子发芽指数计算公式：
GI＝[(Gc×Lc)/(Gt×Lt)]×100％
式中：
GI：种子发芽指数；
Gc：发芽种子平均数：
Lc：发芽种子根系平均长度，单位为毫米(mm)；
Gt：空白对照发芽种子平均数；
Lt：空白对照发芽种子根系平均长度，单位为毫米(mm)。
堆肥田间试验
三种堆肥对植物生长促进的评价。使用的玉米植物在温室条件下于2019年9月在阜阳市中国“阜阳师范学院”(32.890290°E和115.785298°N)进行。接种前，将接种物(花盆中含有土壤3000g+蛭石60g)保持在室温下。处理包括对照(仅包含土壤和蛭石)，KB，外包细菌(EM细菌液体)和ZZ菌剂处理三种不同的100g堆肥，然后每盆种植两个玉米，每天自动灌溉3次，没有添加营养液。播种后第22天和第32天(DAS)，收获植物。分离根和芽，并用流水洗涤。测量茎，植物和叶的高度。然后，根据Huang等人的方法测定干梢和根的鲜重(Huang,P.,de-Bashan,L.,Crocker,T.,Kloepper,J.W.,Bashan,Y.,2017.Evidence that freshweight measurement is imprecise for reporting the effect of plant growth-pro-moting(rhizo)bacteria on growth promotion of crop plants.Biol.Fertil.Soils53,199–208.)。对于每种农作物，使用每种处理总共重复30次的随机分组实验设计，以评估处理对植物生长的影响。
设置不同浓度ZZ菌剂处理的堆肥(50g、100g、150g和200g)，按照上述接种物(花盆中含有土壤3000g+蛭石60g)，然后每盆种植两个玉米，每天自动灌溉3次。没有添加营养液。播种后第22天和第32天，收获植物。按照上述步骤测量玉米指标。
堆肥理化特性分析
气味与色度
在堆肥发酵0～16d的时间里，堆肥中散发出腐酸味并不断地加重，同时伴随着刺鼻的氨味，ZZ菌剂处理的堆肥的表现更为强烈。这由于堆肥前期含氮有机物比较的多，经过微生物降解导致大量氨气释放。堆肥的腐臭味气味会逐渐减轻并逐渐有清香味随着堆肥时间的进行。
表1三种处理堆肥的气味随时间变化情况
表2三种处理堆肥的颜色随时间变化情况
温度
结果如图1所示，三种不同处理的堆肥都经历了升温、高温保持、降温和腐熟后期四个阶段，堆肥温度变化大致趋势均为先上升至一定温度，保持后下降，堆肥温度最终接近于环境的温度。整个堆肥腐熟过程持续41天，在此过程中翻堆6次，每次翻堆过后堆肥温度会迅速下降，然后会很快上升。KB处理的堆肥中，温度上升较慢，且最高温度才达到56.3℃；WG菌剂处理的堆肥中，温度上升较快，且最高温度才达到60.5℃；而本发明提供的复合微生物菌剂ZZ，升温较KB与WG快，且达到最高温度为62.5℃。这说明接种的ZZ茵剂可明显促进秸秆堆肥发酵，缩短腐熟时间并提高堆肥质量。
含水率
在秸秆堆肥过程中，合适的堆肥含水率是堆肥能否正常进行的要素之一，含水率的高低都会影响细菌的生长。大量研究表明，堆肥的初始含水率在60％以上更适合细菌在堆肥中的生长。结果如图2所示，三种不同处理的堆肥，堆肥初始的含水率为65.00％，之后在堆肥过程中未对堆肥的含水率进行人为干预。
三种不同处理的堆肥含水率都逐渐降低，由开始的65.00％降低至40％左右。由于堆肥温度逐渐升高，导致堆肥水分蒸发并且在堆肥翻堆时也带走了一部分水；再者是由于细菌在生长过程中也消耗了水。三种处理都在相同的时间进行翻堆通风，但ZZ处理的堆肥含水率较KB处理和WG处理的低，说明ZZ处理中的微生物生命活动强，更适合烟草秸秆堆肥。
酸碱度(pH)
pH的变化趋势是反映堆肥腐熟进程的重要参数之一。三种不同处理的堆肥pH值均呈现出先升高后再略有下降并最终趋于稳定的趋势。在堆肥刚开始pH值升高并逐渐达到最大值可能是由于堆肥初期由于小分子量有机酸(如乙酸、丁酸)挥发和有机物降解所产生氨气共同作用结果，而在后期pH值逐渐降低，这可能与后期的氨气挥发有关。结果如图3所示，三种不同处理的堆肥，初始pH值呈弱酸性，经堆肥腐熟后最终堆肥产品均呈弱碱性。其中，菌剂ZZ和菌剂WG的处理的堆肥pH升高的最快，菌剂KB升高的较慢。这表明，ZZ菌剂处理的秸秆堆肥腐熟的更快，微生物能够快速的降解有机物。最后三种不同处理的堆肥最终都达到了腐熟堆肥呈弱碱性的标准，且表明ZZ菌剂腐熟的更完全。
电导率(Ec)
电导率(Ec)可以作为评价堆肥腐熟度的一项指标，电导率(Ec)反映了堆肥浸提液中离子总浓度(主要包括K+、NH4+、Cl-、Na+、SO22-和NO3-等离子的含量)。如图4所示，三种不同处理的堆肥的电导率变化均呈现先降低后增大并且最终趋于稳定趋势。CK处理中，EC从起初的5.50mS/cm开始，随着堆肥时间进行电导率快速降低，于第10天达到了整个堆肥阶段最小值4.67mS/cm，接着又开始上升，直到堆肥结束时保持在6.68mS/cm。ZZ菌剂和WG菌剂电导率EC变化比较接近，都由起初5.50mS/cm左右开始，随着堆肥时间的进行电导率EC迅速降低，都于第7天达到了最小值4.54mS/cm和4.35mS/cm，接着电导率直线上升，一直到堆肥结束时保持在6.98mS/cm和6.75mS/cm。
粗纤维素
秸秆堆肥是依据内部微生物分解消耗有机物，从水溶性有机物分解开始，逐渐到利用难分解的秸秆纤维素，并转化为腐殖质的生物合成过程。秸秆纤维素被降解多少直接影响堆肥的腐熟程度，加快纤维素的降解是缩短堆肥周期的关键所在。从图5中可以看出，三种不同处理的堆肥粗纤维素降解率均呈现出先升高后再趋于稳定的趋势，ZZ菌剂处理的堆肥粗纤维素降解率较KB菌剂和WG菌剂处理的堆肥快。在KB处理的堆肥，其粗纤维素降解率在41天达到22.13％；WG菌剂处理的堆肥粗纤维素降解率达到28.46％；而ZZ菌剂处理的堆肥粗纤维素降解率达到34.86％。可见，ZZ菌剂处理的堆肥粗纤维素降解的最快，ZZ菌剂更适合烟草秸秆堆肥。
总含氮量
如图6所示，三种不同处理的堆肥总含氮量均呈现出先下降后再升高的趋势。在堆肥初期三种处理的堆肥全氮含量都有所下降，然后再开始上升，这可能是由于微生物合成氨气挥发损失造成的。而在后期三种处理的堆肥总含氮量都有所增加，且ZZ菌剂处理的堆肥全氮含量最高在第41天。在第19天，KB菌剂处理的堆肥全氮含量初始值2.66g/Kg降至1.75g/Kg；WG菌剂处理的堆肥全氮含量初始值2.66g/Kg降至1.70g/Kg；ZZ菌剂处理的堆肥全氮含量初始值2.66g/Kg降至1.61g/Kg。可见，ZZ菌剂处理的堆肥挥发出的氨气最多，表明其腐熟的更完全。而在第41天，KB菌剂处理的堆肥全氮含量初始值1.75g/Kg升高至2.10g/Kg；WG菌剂处理的堆肥全氮含量初始值1.70g/Kg升高至2.15g/Kg；ZZ菌剂处理的堆肥全氮含量初始值1.61g/Kg降至2.25g/Kg。这个结果表明，ZZ菌剂处理的堆肥可以利用秸秆中的有机物合成出含氮化合物，从而使全氮含量升高。相比于KB处理堆肥和WG菌剂处理的堆肥，ZZ菌剂处理秸秆堆肥的效果最好。
总含碳量
从图7中可以看出，在堆肥前7天全碳含量都有所上升，KB处理的堆肥初始值41.11％升高至43.69％；WG处理的堆肥初始值41.11％升高至44.24％；ZZ处理的堆肥初始值41.11％升高至44.40％，这可能与微生物在初期大量增殖，有机物合成速率大于其分解速率。在堆肥后期全碳含量都有所下降，KB处理的堆肥初始值43.69％降至34.02％；WG处理的堆肥初始值44.24％降至33.11％；ZZ处理的堆肥初始值44.40％升高至31.78％，这可能是在后期有机物分解速率增加，是一部分的碳以二氧化碳的形式释放导致全碳含量降低。这也能够说明ZZ菌剂处理的堆肥有机物降解的更完全，腐熟的更完全。
碳氮比
碳氮比是被大众普遍认可的最基本的有机肥腐熟指标之一，一般情况下堆肥的碳氮比下降到20以下堆肥已经腐熟。如图8所示，三种不同处理的堆肥碳氮比均呈现出先上升后再下降的趋势。ZZ菌剂处理的堆肥碳氮比上升的比较快，且较KB处理的堆肥和WG菌剂处理的堆肥降到20以下快，说明外源菌剂的添加能够加快堆肥的腐熟的进程，缩短堆肥的腐熟的时间，而ZZ菌剂处理的堆肥效果更好。
粗灰分
在农作物秸秆堆肥的过程中，游离型有机物被降解，而粗灰分在堆肥中的绝对含量值不变，因此粗灰分含量在生物发酵过程中相对上升。所以粗灰分含量的增加能够反应堆肥中有机物降解程度。从图9中可以看出，三种不同处理的堆肥粗灰分均呈现出先上升的趋势，KB处理的堆肥在41天达到18.00％，WG菌剂处理的堆肥在41天达到21.43％，而ZZ菌剂处理的堆肥粗灰分较KB处理的堆肥和WG菌剂处理的堆肥高，达到22.97％，结果表明ZZ菌剂对有机物的利用速率快，堆肥腐熟更完全。
腐殖质
腐殖质也是被大众普遍认可的最基本的有机肥腐熟指标之一，一般堆肥腐殖质含量越高，堆肥质量越好。从图10中可以看出，，三种不同处理的堆肥腐殖质均呈现出先上升的趋势，KB处理的堆肥在41天达到15.54g/Kg，WG菌剂处理的堆肥在41天达到17.89g/Kg，而ZZ菌剂处理的堆肥腐殖质较KB处理的堆肥和WG菌剂处理的堆肥高，达到18.96g/Kg，由图10可见，ZZ菌剂对堆肥腐殖质增加率的贡献效果明显优于KB与WG菌剂处理的堆肥。
发芽率
未完全腐熟的秸秆堆肥产生有毒物质，会对植物的生长产生负面作用，因此种子发芽率试验是评价秸秆堆肥腐熟程度的最具说服力的试验方法。在本实施例中，种子发芽率的测定选用黄瓜种子。从图11中可以看出，三种不同处理的堆肥腐殖质均呈现出先上升后趋于平衡的趋势，KB处理的堆肥在41天达到106.49％，WG菌剂处理的堆肥在41天达到140.62％，而ZZ菌剂处理的堆肥发芽率较KB处理的堆肥和WG菌剂处理的堆肥高，达到157.89％，堆肥结束时，ZZ菌剂处理的堆肥种子发芽率要高于KB与WG菌剂处理的堆肥，这结果说明ZZ菌剂的添加可有效的提高堆肥品质。
通过对气味与色度、温度、含水率、pH、电导率、粗纤维素、总氮、总碳、腐殖质、粗灰分和种子发芽指数等堆肥腐熟度指标的测定，对不同菌剂在堆肥中的应用进行了对比研究。在本实施例的三种不同的处理中，主要的堆肥理化特性详见表3。
表3三种不同处理的堆肥理化特性参数
由表3可知，ZZ菌剂最高温度为为62.5℃、含水率为30.45％；WG菌剂最高温度为为60.5℃、含水率为35.78％；而CK处理中的最高温度为为56.3℃、含水率为40.25％，由此可见，ZZ菌剂的添加可以有效的促进堆肥升温，提高烟草秸秆堆体温度，能显著的促进堆肥发酵。
pH对微生物的新陈代谢产生重要的影响，也是能够反映堆肥腐熟程度的指标之一。一相对来说，pH在7.5-8.5时，微生物会获得很高分解速率。菌剂ZZ和菌剂WG的处理的堆肥pH升高的最快，菌剂KB升高的较慢。由此可知菌剂ZZ能够快速的降解烟草秸秆，使堆肥pH快速的上升。而堆肥结束后，所有堆体的pH都在7.5～8.0之间，符合堆肥的腐熟程度对堆体pH要求。
秸秆纤维素在降解过程中的总量是影响堆肥的腐熟程度重要影响因素，堆肥菌剂添加能够有效的促进烟草秸秆粗纤维素的降解，其自制菌剂的降解纤维素的效果最好，粗纤维素的降解率分别比WG菌剂和KB提高了6.40％和12.73％。王伟东等研究表明，接种质纤维素降解菌可使纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别比对照提高了12.8％、3.5％和4.8％，也得出了类似结论。
而随着烟草秸秆堆肥的继续，堆肥里的氮元素有大量损失，且主要发生在高温期。由表可知，菌剂组的总氮损失率要低于对照组，这说明菌剂的添加在一定程度上减少了氮素的损失。这是因为在整个堆肥过程中，伴随着含氮有机物降解为氨气而挥发，总氮量应该是逐渐减少的，但相对于含碳有机物降解过程中CO2的释放和水分的蒸发，氮素所占比重则是相对增加的。堆肥过程中有机物在微生物的作周下分解为CO2、水等小分子物质，并释放能量，促进堆肥升温，与此同时形成新的物质一腐殖质。由表可知，菌剂组的腐殖质增加率要高于对照组，尤以ZZ菌剂的效果最好，这说明菌剂的添加可促进堆肥中有机物的分解和腐殖质的形成。孙干等以牛粪和小麦秸秆为原料，添加自行研制的复合微生物菌剂，采用高温好氧堆肥方法研究了不同堆肥处理条件下堆肥腐熟度指标的变化，也证实了这一点。种子发芽指数(GI)是衡量好氧堆肥植物毒性和腐熟度的重要参数，被认为是最敏感、最可靠的堆肥腐熟度评价指标。若GI>80％，则可认定堆肥对植物无毒害作用。
综合以上各项检测指标发现，由高效纤维素降解菌株构建而成的ZZ菌剂在堆肥过程中不仅可以保持较长时间的高温，而且能明显缩短烟草秸秆生产有机肥的腐熟时间，在有机肥品质方面可以保持肥料中的有效氮并且能有效减少有机肥中的毒性物质，在有机肥生产中具有良好的应用前景。
堆肥田间试验
三种不同处理的堆肥
添加的菌剂烟草秸秆堆肥比没有添加的菌剂的堆肥包含更多稳定的有机化合物，由于养分释放较慢而具有延长的肥料作用，并且含有较高浓度的植物生长调节剂，对植物生长产生积极影响。但是，添加不同细菌的堆肥只有在使用相同材料混合物生产的情况下才能正确比较。堆肥对玉米植物的影响的重要评估涉及植物、根和叶的高度。结果如图12所示，其中(a)株高，(b)根长，(c)叶长，(d)叶宽，(e)全重，(f)茎重，(g)根重和(h)根冠比的变化，可见使用ZZ菌剂的烟草秸秆堆肥栽培的植物获得最高高度(图12a，b，c)。最大的叶宽、全重和茎重(图12d，e，f。)，这表明最大的重量(图12a，b，c)是用ZZ菌剂堆肥栽培的植物获得的，没有肥料堆肥或KB处理堆肥的植物显示出最低的高度和重量。这些结果进一步表明，接种了ZZ菌剂后烟草秸秆强烈降解导致肥料效率的提高和堆肥的高稳定性。
表4三种不同处理堆肥对玉米植株生长的影响
四种不同浓度ZZ菌剂处理的堆肥
施用生物有机肥料不仅能为农作物提供全面营养，而且肥效长，可增加和更新土壤有机质，促进微生物繁殖，改善土壤的理化性质和生物活性。正常的施量是不会伤植物的根部的。但是，有机肥施多了会烧根。有机肥已经发酵了很长时间了，其中的无机盐类含量已经不低了，所以施肥多了，肯定会使得根部离子浓度过高，出现烧根现象。本实施例通过设定不同质量的堆肥施加对玉米生长的影响，来探究本发明所提供的堆肥的最佳施用量。结果如图14显示，其中(a)株高，(b)根长，(c)叶长，(d)叶宽，(e)全重，(f)茎重，(g)根重和(h)根冠比的变化。可见在大棚花盆实验中，土壤3000g+ver石60g+100g堆肥效果最好。
由上述实施例可知，本发明将所述枯草芽孢杆菌SL-3A和解淀粉芽孢杆菌SL-7复配获得的复合微生物具有较强的降解纤维素的能力，能够很好的降解烟草秸秆；利用复合微生物菌剂进行烟草秸秆堆肥，能够有效的缩短堆肥腐熟时间，提高堆肥品质。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
