枯草芽孢杆菌Pro6A5、其菌剂和制备方法及在甜瓜栽培中的应用
技术领域
本发明涉及生物防治技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Pro6A5、其菌剂和制备方法及在甜瓜栽培中的应用。
背景技术
甜瓜常见病害有枯萎病、白粉病、霜霉病、菌核病、角斑病、炭疽病等等，甜瓜重茬连作则更是加重了此类病害及连作障碍的发生，如不及时进行有效防治，将会严重影响甜瓜的产量和品质。
现有技术中可采取多种措施防治病害，如植物检疫、抗病品种利用、农业防治、化学防治、物理防治和生物防治等。
抗病品种是最简便、经济、有效的防治途径，加强种子检疫，做好种子带菌检测工作，应该从无病区引种，且在制种时应该杜绝带菌种子混入合格种子中。但受到种质资源遗传背景狭窄、抗病材料有限等因素限制；最常用的、最快速、最直接的防治途径是化学药物防治，化学药物防治在一定程度上减少了病害发生，但由过度、过频繁使用化学杀菌剂所带来的农药残留、食品安全、环境污染、生态平衡破坏和病原物产生抗药性等问题，限制着化学农药施用；农业防控和物理防控也只是一定程度上减轻病害的发生。
换茬轮作也是防治或减轻病虫害的有效途径，但在我国人均耕地面积极为有限且地理上分布不均的情况下，也难以推广实施。
随着社会文明的发展进步，人们对无污染、无公害绿色食品呼声日益提高，生物防治已经成为植物病害防治的研究热点，它在生产方式、食品安全、营养健康、生态平衡和生物多样性上都和人类未来的发展方向具有良好的相融性。
目前，生防菌作为生物防治的重要一环，植物病害生物防治研究的热点。因生防菌种类繁多，真菌、细菌、放线菌等类别生防菌均在生产上得到广泛的应用。亟待开发新的生防菌株，以期在人和自然和谐共存、维护生态平衡和促进农业可持续发展进程中发挥重要的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种枯草芽孢杆菌Pro6A5、其菌剂和制备方法，并将其在甜瓜栽培中应用，以期解决甜瓜栽培中病害防治效果不佳、盐碱逆境胁迫或/和连作障碍难以克服的技术问题
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
筛选得一种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis Pro6A5，并于2017年4月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国湖北省武汉市武汉大学，邮编430072），其保藏编号为CCTCC NO：M 2017196。
制备一种微生物菌剂，包含所述枯草芽孢杆菌Pro6A5和/或所述枯草芽孢杆菌Pro6A5的代谢产物。
提供一种微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：
（1）将所述枯草芽孢杆菌Pro6A5接种到固体培养基上，在28～35℃下培养24～36小时；
（2）取步骤（1）培养的菌种接入液体培养基内，在28～35℃下培养12～16小时，得种子液；
（3）取将种子液按3～5%的接种量接种于发酵培养基中，在28～35℃、转速180～200rpm、pH7.5～8.0条件下发酵培养36～48小时后，收集发酵液，即得微生物菌剂。
优选的，所述微生物菌剂的活菌浓度为2～3×109cfu/ml。
将所述枯草芽孢杆菌Pro6A5或所述微生物菌剂应用于防治甜瓜细菌性果斑病菌、番茄细菌性溃疡病菌、白菜软腐病菌、烟草青枯病菌或桃树细菌性穿孔病菌等的防治，还可用于抑制或克服盐碱逆境胁迫或/和甜瓜重茬连作障碍。
提供一种所述枯草芽孢杆菌Pro6A5或所述微生物菌剂的施用方法，包括：灌根、浸种、喷施植株中的至少一种方式施用；或
与杀菌剂或植物调节剂复配后，再灌根、浸种、喷施植株中至少一种方式施用。可以在甜瓜整个生长期施用，如播种前，采用发酵制剂与种子拌种；育苗时，该菌剂与基质按比例混合，配制成专一性基质，在病害始发期，通过灌根施入作物根际或通过叶面、花蕾和果实表面喷雾施用。
与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：
本发明首次筛选得到一株综合性能表现优异的枯草芽孢杆菌Pro6A5，并保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017196。枯草芽孢杆菌Pro6A5制备的微生物菌剂防治细菌病害效果较好，对甜瓜细菌性果斑病菌、桃细菌性穿孔病菌、烟草青枯病菌、白菜软腐病菌和番茄溃疡病菌等有较强的抑制作用；还能够调节和改善甜瓜根际土壤生态环境，以克服盐碱地胁迫障碍或/和甜瓜重茬连作障碍；防治高效、使用简单、环境友好。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌Pro6A5与参比模式菌株之间的系统进化树分析图。
图2为实施例7中试验的甜瓜出苗状况对比图。
图3为实施例7中试验的播种20d后的甜瓜根系对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1：枯草芽孢杆菌的分离和筛选
（1）土壤芽孢杆菌的分离与纯化
采集瓜类田地（于2016年9月20日由梁慎于兰考县葡萄架乡杜寨村采集）5～20cm土层湿润土壤 300g，粉碎后称取10g，置于盛有100ml无菌水的三角瓶中，摇动3～5min，在80℃水浴中加热10 min。量取上土壤悬浮液，用无菌水稀释以制备10-2、10-3、10-4和10-5土壤悬浮液；分别吸取上述10-3、10-4、10-5土壤悬浮液50μl涂布于NA培养基（牛肉浸膏3g，酵母粉1g，蛋白胨5g，葡萄糖10g，琼脂12g，水1L，pH6.8～7.0，121℃灭菌20min）平板上，在超净工作台上涂布平板并晾干。倒置于生化培养箱中，37 ℃培养48 h。待长出单孢菌落后，挑取单菌落，并采用连续划线的方法纯化，将纯化获得的单孢菌落菌株接种于NA斜面培养培养，保藏备用。
菌株保藏方法为：将上述斜面培养物4℃保藏；或制备成20%甘油菌悬液，-80℃保存。
（2）细菌病害拮抗菌筛选
取分离纯化到的芽孢杆菌接种LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，水1L，pH7.0，121℃灭菌20min）液体培养48h后，以供试甜瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli）为靶标，采用平板注菌法进行拮抗菌分离筛选。
具体方法为：取活化后的甜瓜果斑病菌，配制成108CFU悬液，取50 µL均匀涂布于LB平板上，随后，用无菌牛津杯在LB平板上均匀打孔，取出孔内培养基，然后注入100 µL 芽孢杆菌菌液，30 ℃培养36～48h后，观察其抑菌效果，并测量抑菌带大小，初步筛选得到拮抗性菌株芽孢杆菌29株。
（3）拮抗菌株复筛
1）无菌发酵滤液制备：将29株拮抗菌株接种LB培养液中，30℃下振荡培养48h，收集培养液于50ml离心管中，5000 rpm离心5 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后即得无菌发酵滤液。
2）用细菌病害的病原细菌制备LB平板，供试病原细菌为：甜瓜细菌性果斑病菌（Acidovorax citrulli），番茄细菌性溃疡病菌（Clavibater michiganensis），白菜软腐病菌（Erwinia carotovora pv.carotovora），烟草青枯病菌（Ralstonia solanacearum），桃树细菌性穿孔病菌（Xanthomonas campestris pv.pruni）。
3）制备好的LB平板倒置后，以皿底中央为圆心，用记号笔把LB平板均匀分割成若干扇形，然后，正放LB平板，用无菌牛津杯其中央打孔，取出孔内培养基，然后注入100 µL无菌发酵滤液，同时，在不同扇形区域滴加浓度为108CFU病原细菌悬液10µL，均匀涂布于扇形区域，30 ℃培养24h后，观察其抑菌效果，并测量抑菌宽度。
上述实验，三次重复，以100 µL无菌水的LB平板为对照，统计后，计算无菌发酵滤液对各个病原细菌的抑制效果，结果如表1所示。复筛筛选出具有很好防治效果的Pro6A5菌株。
表1 Pro6A5菌株对各病原菌的抑菌效果
注：+++ 代表带大于10mm；++代表抑菌带5～10mm；+抑菌带小于5mm。
实施例2：枯草芽孢杆菌Pro6A5的鉴定
（1）理化性质分析
1）菌落特征和菌体形态观察
取芽孢杆菌Pro6A5接种于NA培养基上，30 ℃的生化培养箱中培养48 h。观察菌株在培养基上菌落形态、颜色及其生长情况。挑取培养48 h的芽孢杆菌菌落于载玻片上革兰氏染色，观察菌体的大小和形态。
2）菌株生理生化试验测定
Pro6A5菌株生理生化实验测定采用《常见细菌系统鉴定手册》和《芽孢杆菌属》推荐的培养基及实验方法。生理生化试验主要有：甲基红反应、接触酶试验、淀粉水解试验、过氧化氢试验、明胶液化试验、分解酪素试验、厌氧生长试验、吲哚反应、纤维素降解试验、生长温度试验、V-P试验和碳源利用试验。
理化性质分析结果如表2所示。
表2Pro6A5菌株的培养特性、形态和生理生化特征
注：＋为阳性；－为阴性。
（3）菌株分子生物学及其进化关系分析
Pro6A5菌株分子生物分析主要采用6SrDNA基因片段，16SrDNA序列PCR扩增上下游引物由南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司合成，分别为：
16SF：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，
16SR：5’-AGAGTTGATCATGGCTCAG-3’。
以Pro6A5菌株的LB液体培养物为模板，以16SR、16SF为PCR扩增引物。
PCR反应体系为：10×PCR Buffer（含有Mg2+）5 µL，模板0.5 µL，dNTP (10 mmol/L)2µL，引物16SR (10 µmol/L)2µL，16SF (10 µmol/L) 2µL，TagDNA聚合酶(5 U/µL)1 µL，去离子水37.5µL。
PCR扩增条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min；60℃ 45 s；72℃ 1.2 min；35个循环；72℃ 10 min。
PCR反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，获得1条长度为1.5 kb左右的预期片段。将目的条带采用琼脂糖DNA回收试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）纯化后，送至上海生物工程有限公司测序获得大小为1456 bp的序列，如SEQ NO.1所示。
测序结果进行BLAST分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast），运用DNAMAN软件进行序列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性，构建供试菌与参比模式菌株之间的系统进化树，如图1所示。
DNA序列经BLAST比较分析，与数据库中多个B. subtilis菌株高度同源，且一致性均达99%以上。由Pro6A5菌株的16SrDNA序列与已知多个芽孢杆菌16SrDNA序列比较并构建系统发育树，可见Pro6A5菌株与B.subtilis KF278709.1聚成一类，在同样长度的高同源性序列比较中，同源性达到99.45%。结合生理生化特征推断Pro6A5菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
实施例3：微生物菌剂的制备
Pro6A5菌剂的制备步骤如下：
（1）菌株培养与制备
将枯草芽孢杆菌Pro6A5接种到试管斜面大豆酪蛋白固体培养基（胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，NaCl 5g，KH2PO42.5g，葡萄糖 2.5g，琼脂粉12g，加水定容1000ml，pH7.0，121℃灭菌20min）上，28～35℃下培养24～36小时获得菌体；
（2）种子液制备
将步骤（1）制备的试管菌种接入大豆酪蛋白液体培养基（胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3g，NaCl 5g，KH2PO42.5g，葡萄糖 2.5g，加水定容1000ml，pH7.0，121℃灭菌20min）内，在28～35℃下震荡培养12～16小时制成种子液；
（3）发酵培养基制备
分别取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加水配制成含葡萄糖1.2%、玉米粉1.8%、黄豆饼粉3%、磷酸氢二钾0.2%的培养液；
（4）液体发酵生产
发酵设备及发酵培养基灭菌后，将种子液按5%的接种量接种于步骤（3）配好的培养液，在28～35℃，转速180rpm，pH8.0条件下发酵培养至少36～48小时后，收集发酵液，即得液体菌剂，菌浓度为2.4×109cfu/ml。
实施例4：Pro6A5菌剂对不同病原细菌的颉颃性研究
（1）无菌发酵滤液制备
取实施例3中的液体菌剂置于50ml离心管中，5000 rpm离心5 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后即得无菌发酵滤液。
（2）无菌发酵滤液对不同病原细菌的颉颃性
取无菌发酵滤液加入到50 ℃融化LB培养基中，滤液按照5倍、10倍、20倍和50倍比例稀释，制备成总体积25ml不同浓度的抑菌平板，待平板冷凝后，分别接种不同靶标病原细菌，以无菌水LB平板为对照，30 ℃下培养24h后观察病原生长情况，统计抑制效果。
实验结果如表3所示。
表3 发酵滤液对不同病原细菌的颉颃性效果
注：+代表病原细菌能够生长；—代表病原细菌不能生长。
发酵滤液稀释5倍时，5种病原细菌都不能生长，完全收到抑制；稀释10倍情况下，仅桃细菌性穿孔病病原可以生长，其它病原生长都收到抑制；稀释20倍时白菜软腐病菌和桃树细菌性穿孔病菌能够生长；稀释50倍时，仅甜瓜果斑病菌不能够生长，其它病原均可以生长。
由上可知， Pro6A5菌剂对甜瓜细菌性果斑病菌抑制效果最好。
实施例5：Pro6A5菌剂对大棚甜瓜果斑病的防病作用研究
于2019年3～6月在河南省兰考县三义寨丁圪垱村甜瓜多年连作大棚内进行试验。大棚土壤为砂质壤土，土壤肥料较差，地膜覆盖栽培。
供试甜瓜品种为众云20（河南省农业科学院园艺研究所西瓜甜瓜研究室提供）；供试药剂为20%二氯异氰尿酸钠可湿性粉剂（山东济南燕山三丰事业有限公司生产）。供试病原甜瓜细菌性果斑病（河南省农业科学院园艺研究所西甜瓜研究室保存）以20%二氯异氰尿酸钠可湿性粉剂750倍液处理和清水作对照。
每组实验分5个处理，处理分别为：清水处理、氯异氰尿酸钠可湿性粉剂750倍液处理、实施例3的液体菌剂稀释10倍处理、实施例3的液体菌剂稀释20倍处理、实施例3的液体菌剂稀释50倍处理、实施例3的液体菌剂稀释100倍处理，每处理30株，处理随机排列，3次重复。
具体操作步骤如下：在甜瓜细菌性果斑病发病初期进行施药，每隔5d施药1次，施药时间选择天气晴朗的傍晚进行，进行茎叶喷雾处理，喷雾程度以植株叶片正面和背面布满药滴，叶尖开始稍微滴水为止。调查为每个处理随机挑选5株，调查全株叶片，以每片叶病斑面积占整张叶片面积的百分率分级，第一次喷药前调查发病基数,于最后一次施药后7d调查防治效果。计算病情指数以及病情指数增长率和校正防效。
计算公式如下：
病情指数=100×[∑(各级病叶数×相对级数值)]/(调查总叶数×9)；
防治效果（%）= [1-(CK0病指×PT1病指)/(CK1病指×PT0病指)]×100%
CK0为对照区施药前病情指数， CK1为对照区施药后病情指数，PT0为处理区施药前病情指数，PT1为处理区施药后病情指数。
病叶分级标准如下：
0级：无病斑；
1级：病斑面积占整个叶面积的5%以下；
3级：病斑面积占整个叶面积的6%～15%；
5级：病斑面积占整个叶面积的16%～25%；
7级：病斑面积占整个叶面积的26%～50%；
9级：病斑面积占整个面积的50%以上。
实施结果如表4所示。
表4：Pro6A5菌剂对大棚甜瓜细菌性果斑病防治实验结果
Pro6A5菌剂处理结果表明：实施例3的液体菌剂稀释从10倍到100倍对细菌性果斑病均有防治效果，经过2次喷药，稀释10倍和20倍对大棚甜瓜细菌性果斑病防治效果较好。
实施例6：Pro6A5菌剂防治甜瓜果斑病的效应试验
于2019年3月在河南省农业科学院温室内进行，供试带菌种子（含有细菌性果斑病菌）和健康种子甜瓜品种均为众云20（河南省农业科学院园艺研究所西瓜甜瓜研究室提供）；供试药剂为加瑞农（北兴化学工业株式会社生产）。以加瑞农600倍液处理和清水作对照。
每组实验包含不同药剂对健康种子和带菌种子浸种处理6h，每组实验分6个处理：CK1（健康种子）；CK2（带菌种子）+CK3（带菌种子600倍加瑞农）；带菌种子+实施例3的液体菌剂稀释10倍；带菌种子+实施例3的液体菌剂稀释20倍；带菌种子+实施例3的液体菌剂稀释50倍；带菌种子+实施例3的液体菌剂稀释100倍。
获得不同药剂处理后的种子，每个处理取30粒种子，每粒种子种在同一小花盆的四角上，每个处理种6个小盆。种子种植后正常培养2周，待出苗后2周调查子叶发病率，重复3次，计算防治效果。
种子处理后防治效果=[1-处理子叶发病率/带菌种子对照发病率]×100%
Pro6A5菌剂处理结果如表5所示。
表5 Pro6A5菌剂对带菌种子的防治效果
相比于健康种子、带菌种子及其药剂处理，实施例3的液体菌剂稀释液处理后，稀释10倍、20倍、50倍和100倍都具有防治效果，且能够提高成苗率，稀释10倍菌剂防治效果更好一些，稀释20倍提高成苗率幅度更大些。这表明实施例3的液体菌剂对细菌性果斑病具有防治能力，对甜瓜种子有促生能力。
实施例7：Pro6A5菌剂克服盐碱地连作障碍的效应试验
于2019年9～11月在河南省兰考县葡萄架乡贺村甜瓜多年连作大棚内进行，大棚土壤为砂质壤土，土壤肥料较差，重度盐碱地，土壤EC值达4836us/cm，2019年春季30余个大棚甜瓜全生长期黄化，生长迟缓，最终植株衰败死亡无法收获；秋季7月份移栽甜瓜生长高度仅仅60cm左右，开始早衰死亡。
实验处理：供试甜瓜品种为众云20（河南省农业科学院园艺研究所西瓜甜瓜研究室提供），采用种子直播种植；对照：底肥1500kg腐熟牛粪+50kg复合肥（N:P:K=15:15:15）；处理：底肥1500kg腐熟牛粪+50kg复合肥，实施例3的液体菌剂稀释20倍土壤灌根，每穴100ml。7d后调查出苗率，20d调查甜瓜幼苗生长情况。
实验结果如下：
如图2所示，播种7d，试验组集中出土，出苗率为89.5%，幼苗绿色，对照组少部分出土，出苗率为45%，幼苗出土后芽心黄化；播种15d，试验组抽出第一片真叶，对照组真叶没有完全展开；如图3所示，播种20d，处理组根系深达27cm到达耕底层，侧根多而且长；对照组根系最大17cm且根尖褐变腐烂，侧根稀少且出现根尖褐变腐烂，部分植株渐渐黄化死亡。
上述结果表明：实施例3的液体菌剂能够达到壮根壮苗的效果，有效解决了盐碱地重茬连作障碍对甜瓜幼苗生长影响。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院园艺研究所
<120> 枯草芽孢杆菌Pro6A5、其菌剂和制备方法及在甜瓜栽培中的应用
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.2
<210> 1
<211> 1456
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 1
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