一种降低畜禽粪便堆肥中抗性基因和I型整合子丰度的方法
技术领域
本发明涉及一种利用褐煤降低畜禽粪便堆肥中抗性基因和I型整合子(intI1)丰度的方法，属于养殖场固体废弃物无害化处理技术领域。
背景技术
目前抗生素在全球范围内大量应用于人类疾病治疗和集约化畜禽养殖业，由于兽用抗生素具有防治动物疫病和促进生长的双重功效，使用和消耗量较高。据统计，2013年我国52％的抗生素应用于畜禽养殖业动物的催促生长与疾病治疗中。但畜禽对抗生素的吸收较差，30～90％会以药物原形或代谢物的形式经粪和尿液排出体外，进入土壤或地下水中抗生素有5.38万吨，对环境造成严重污染，也增加了生态毒性。抗生素的滥用不仅造成畜禽粪便中高浓度的抗生素残留，极大地增加了耐药性的发生频率，还会诱导环境中抗性基因(Antibiotic resistance genes， ARGs)的富集。根据美国CDC的研究，自20世纪80年代以来，越来越多的菌株对主要临床用抗生素产生耐药性，并且由单一耐药性发展到多重耐药性，导致感染死亡率有一个明显的升高趋势。
微生物除了通过自身突变获得耐药性外，还可以整合到可移动基因元件上，通过基因水平转移在不同微生物间传播，ARGs主要是以水、土壤、空气等介质作为储库和传播扩散的媒介，并且会通过食物链直接进入人体。ARGs一旦转移到人类致病菌中，导致抗生素治疗失效，严重威胁人类健康。因此，ARGs作为一种新型环境污染物日益引起人们的广泛关注，世界卫生组织将其列为人类21世纪面临的重大挑战之一。
近年来研究发现了一种携带有多种ARGs的新型重组表达系统——整合子(Integron)，它是一种可移动的DNA分子，具有特殊结构，可捕获和整合外源性基因，特别是抗生素抗性基因、重金属抗性基因等，使之转变为功能性基因的表达单位，之后可通过转座子和质粒在细菌中水平传播，它能促进ARGs更广泛的传播。根据intI基因编码的不同整合酶可以对整合子进行分类，现已发现至少5种类型的整合子(I、II、III、IV、V型整合子)能够使ARGs实现水平转移。结构复杂的I型整合子(intI1)与ARGs关系更为密切，能够通过位点特异性重组将不同ARGs 进行重排，对ARGs在环境中的传播扩散起到了至关重要的作用(苏志国等，“环境中抗生素抗性基因与I型整合子的研究进展”，微生物学通报，2018)。
规模化养殖场畜禽粪便是ARGs的重要储存库，不同畜种粪便中ARGs的种类与丰度差别较大。因此，实现畜禽粪便无害化处理，降低入田导致的抗性基因污染风险十分重要。
堆肥是畜禽粪便无害化与资源化利用的主要途径之一。经高温堆肥(55℃堆肥不低于5 天)后畜禽粪便中的主要病原菌被杀灭，可以削减ARGs从畜禽粪便进入土壤环境的机会。但由于堆肥工艺不同，堆肥原料多样，传统好氧堆肥对ARGs的削减效果并不稳定，大多数ARGs 堆肥后丰度减少，也有少量类型ARGs出现富集(李厚禹，徐艳，成卫民，邵振鲁，李碧菡，郑向群，“好氧-厌氧两相堆肥过程中抗生素耐药基因的变化特征及影响因素研究.环境科学研究”，2020，10.13198/j.issn.1001-6929.2020.05.26)；Zhang等(Zhang J Y,WeiY S,Tong J,et al. Impacts of addition of natural zeolite or a nitrificationinhibitor on antibiotic resistance genes during sludge composting.WaterResearch,2016,91:339-349.)研究发现堆肥处理过后，一些 ARGs(blaCTX-M、blaTEM、ermB、ereA和tetW)的丰度减少了0.3～2.0logs，但另一部分 ARGs(ermF、sul1、sul2、tetG、tetX以及mefA)的丰度增加了0.3～1.3logs。
在提高畜禽粪便抗性基因和整合子基因intI1去除效率技术研究上，目前主要通过改变物料初始性状、添加不同堆肥添加剂、改进堆肥工艺等措施进行。如中国专利CN107129374 A公布了一种利用竹材生物炭降低堆肥四环素类抗性基因丰度的方法；即将竹材在600℃的温度下裂解成生物炭，并以2.5％的干重比例添加到鸡粪秸秆混合物中，四环素抗性基因降低70％以上，但生物炭在制备过程中需要耗费大量能源；CN 106495871 A公开了一种通过添加鼠李糖脂和吐温80两种表面活性剂的方法降低大内环酯类抗性基因以及intI1丰度的方法，但该方法对其他类型抗生素的去除效果未知；CN 108148606 A公开了一种借助热解工艺的高温过程，消除养殖废弃物抗生素耐药基因的丰度的方法，但该方法需要特殊的热解装置，热解温度高达 600～800℃，能源消耗高，热解过程中产生的气体也容易对大气造成污染。CN 110184218 A公开了一种利用枯草芽孢杆菌BS1的复合菌剂消减堆肥中病原菌和抗性基因，但该方法在操作过程中需要对多种微生物进行预培养，步骤复杂繁琐。钱勋(钱勋.2016.好氧堆肥对畜禽粪便中抗生素抗性基因的削减条件探索及影响机理研究.西北农林大学博士学位论文)研究表明连续高温堆肥工艺下intI1基因丰度下降了98％，而普通高温堆肥intI1基因丰度仅下降了76％；但该工艺要求整个堆肥过程(40天)保持55℃高温，且其结论仅基于温度可调的实验室生化培养箱内，在实际堆肥生产中必须辅助加热才能实现，能耗高。
褐煤是一种色泽介于泥炭与沥青煤之间的低级煤。我国褐煤资源丰富，其总量占我国煤炭重量的13％。目前，我国褐煤主要用于燃烧发电，附加值未得到充分利用。褐煤富含碳，与 C/N较低的畜禽粪便混合以后，能优化堆肥原料C/N,减少堆肥中秸秆等调理剂的使用。同时由于褐煤结构中孔隙大，能改善物料容重、孔隙度等物理性状，改善微生物生长的微环境，增强堆肥微生物活性，提高堆体温度，加快堆肥进程。褐煤较大的阳离子代换量也能降低畜禽粪便中可提取态重金属铜锌的含量，降低重金属-抗性基因的共抗性出现频率。目前，褐煤作为一种吸附材料，在重金属、有机污染物吸附效果上应用较多，但对于畜禽粪便堆肥过程的抗性基因的影响尚未报道。
发明内容
针对上述问题，本发明在实现褐煤高值利用下，提供一种利用褐煤增强禽畜粪便堆肥过程中抗性基因及I型整合子(intI1)丰度去除效果的方法。
为实现上述目的，本发明是通过下述技术方案获得的：
1)原材料准备：
将畜禽粪便、堆肥调理剂与褐煤混合后，获得C/N比为20～30(优选C/N比为20～25)，含水率为55～60％(优选含水率55％)的堆肥原料，备用；
所述畜禽粪便为鸡粪、猪粪、牛粪中的一种或多种；
所述堆肥调理剂为秸秆、稻壳、木屑、砻糠、蘑菇渣中的一种或多种；
所述褐煤颗粒直径<2mm,pH值介于3～5，含水率<40％；
所述的畜禽粪便、堆肥调理剂、褐煤的质量比为50～65:20～30:15～20；
所述的抗性基因为针对β-内酰胺类、磺胺类、四环素类、大内环酯类的抗性基因。
2)堆肥：利用步骤1)获得的堆肥原料经槽式、条垛式、反应器等堆肥等常规工艺进行高温好氧堆肥，每隔7天翻堆一次，堆肥28-42天后物料腐熟；堆肥产物符合畜禽粪便堆肥技术规范(NY/T 3442-2019)的要求；
上述技术术语“高温好氧堆肥”为本领域常规堆肥方式，其堆肥温度是指按照“粪便无害化卫生要求GB 7959-2012”标准进行，即堆温≥55℃持续时间不低于5天。
本发明利用褐煤堆肥处理畜禽粪便，一是利用褐煤碳含量较高、pH较低的性质，改善畜禽粪便堆料碳氮比和pH，优化原料初始理化性状；二是利用褐煤孔隙度大的特点，降低物料的容重，提高孔隙度，改善堆体中氧气和水分条件，增强微生物活性，提高堆体发酵温度，提升堆肥效率。三是利用褐煤较强的吸附效果，降低畜禽粪便中重金属铜锌的生物有效性，减少重金属共抗性、交叉抗性、共调控作用对ARGs产生的选择性压力。堆肥温度的提高可以增强对病原微生物的杀灭效果，理化性质的改变可以影响堆肥过程中微生物群落结构演替规律，降低抗性基因潜在宿主微生物的数量。重金属浓度的降低，减少重金属-抗性基因的共抗性出现的可能性，间接降低畜禽粪便中的抗性基因丰度。
具体而言，与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
1)本发明实施成本低廉。制备褐煤堆肥的原材料来源广泛，且产量大，可适用全球各矿区产生的褐煤(pH值介于3～5)，堆肥制备过程中可以实现农业固体废弃物资源化利用，且缩短了堆肥腐熟期，堆肥产品稳定安全。同时增加了腐熟堆肥产品中养分浓度，降低了可溶性铜、可溶性锌的含量。
2)本发明技术操作简便。堆肥过程非常简单，采用常规条垛式、仓式、槽式等均可进行；对畜禽粪便粪中多种类型的抗性基因均有显著去除效果。褐煤鸡粪堆肥处理中β-内酰胺类、磺胺类、四环素类、大内环酯类抗性基因的相对丰度比对照分别降低35.5％、33.1％、65.7％、 41.1％；整合子基因intI1相对丰度比对照低76％。在猪粪堆肥中，与添加生物炭相比，褐煤处理中β-内酰胺类、四环素类、磺胺类抗性基因的丰度分别降低17.3％、34.0％、5.9％。整合子基因intI 1相对丰度降低7.1％,并显著降低了处理成本。
附图说明
图1为实施例1褐煤对鸡粪堆肥过程不同类型抗性基因丰度的影响示意图；
图2为实施例1褐煤对鸡粪堆肥过程中整合子基因intI 1丰度的影响示意图；
图3为实施例2褐煤对猪粪堆肥过程不同类型抗性基因丰度的影响示意图；
图4为实施例2褐煤对猪粪堆肥过程中整合子基因intI 1丰度的影响示意图。
具体实施方式
实施例中褐煤取自于澳大利亚维多利亚省墨尔本Bacchus Marsh矿区，其pH值介于3～5，将褐煤粉碎并过2mm筛(褐煤颗粒直径<2mm),调整含水率<40％；在具体实施中，也可以使用其他产地的褐煤。
堆肥箱购自Maze公司，型号为MCT-D160，尺寸为725mm宽×935mm高度×660mm长度)；
以下实施例使用高通量实时荧光定量PCR(HT-qPCR)平台(Wafergen SmartChip实时PCR 系统)对堆肥样品中抗性基因及整合子基因intI 1丰度进行定量；该平台可以在具有5184纳孔的芯片上同时量化296种经过验证的引物，包括285个ARG，10个可移动操作元件标记基因(2个整合子基因和8个转座子基因)和1个16S rRNA基因，具体检测方法参见文献(黄福义,李虎,韦蓓,欧阳纬莹,苏建强.长期施用猪粪水稻土抗生素抗性基因污染研究.环境科学，2014,35(10)：3869-3873.)。
实施例1：褐煤对鸡粪堆肥中抗性基因和整合子基因intI 1丰度的影响
本实施例利用鸡粪、木屑作为原材料，其具体堆肥步骤(实验组)如下：
1)将鸡粪、木屑风干后剪成1cm小段，褐煤风干后粉碎过2mm筛，备用；
2)将褐煤粉末、鸡粪、木屑按照干质量比15:60:25的比例充分混匀后获得堆肥原料，使得混合物C/N为25,加水使得混合物初始含水率为55％；
3)将混合物50kg(鲜质量)放入体积为160L的堆肥箱进行堆肥，每隔7天人工翻堆一次，28天后堆肥完全腐熟(堆肥过程中最高温度69℃，55℃以上天数维持5天以上)，获得褐煤堆肥产物，经检测，该褐煤堆肥产物符合畜禽粪便堆肥腐熟标准(NY/T3442-2019)。
同时设立不添加褐煤的堆料为对照组(CK)；实施例中添加褐煤的堆肥处理，简称为T。
对两组堆肥产物中的抗性基因和整合子基因intI 1丰度进行检测，检测结果分别如图1和图2所示。图1中CK为对照组，T代表实验组；图1A为β-内酰胺类抗性基因相对丰度检测示意图，图1B为四环素类抗性基因相对丰度检测示意图，图1C为大环内酯类抗性基因相对丰度检测示意图，图1D为磺胺类抗性基因相对丰度检测示意图。可以看出，不同类型抗生素耐药基因丰度对高温好氧堆肥的响应不一。添加褐煤可以降低鸡粪堆肥中四环素类、大内环酯类抗性基因的丰度。与堆肥原料相比，对照四环素类抗性基因丰度增加了42.4％，处理则降低了46.6％；对照、处理堆肥后大内环酯类抗性基因丰度较原料分别下降了72.1％、83.5％。高温好氧堆肥后，β-内酰胺类、磺胺类抗性基因丰度较原料有所增加，但添加褐煤降低了增加幅度。从图1可知，对照和处理腐熟堆肥中β-内酰胺类抗性基因相对丰度较堆肥原料分别增加了141.8％、73.4％；而磺胺类抗性基因相对丰度分别增加了33.6倍、17.7倍。堆肥结束后，褐煤处理中β-内酰胺类、磺胺类、四环素类、大内环酯类抗性基因的相对丰度比对照分别降低 35.5％、33.1％、65.7％、41.1％。
由图2可以看出，堆肥高温期整合子基因intI1相对丰度显著下降，其中添加褐煤处理的 intI1基因未曾检测到，并一直持续到降温期。堆肥腐熟期intI1丰度回升。对照中整合子基因 intI1相对丰度经高温好氧堆肥后较原料增加了72％，添加褐煤后的腐熟堆肥中intI1相对丰度较原料降低了71％。腐熟堆肥中褐煤处理intI1相对丰度比对照低76％。
同时对2组堆肥产物的养分和可溶性铜、可溶性锌含量进行检测，检测结果如表1所示：
表1褐煤对鸡粪堆肥产品养分及可溶性铜、锌含量的影响
从表1可知，添加褐煤还增加了腐熟堆肥产品的养分含量，添加褐煤的腐熟堆肥中总氮、总磷、总钾含量分别比对照高出72.3％、14.1％、7.3％；中微量元素总钙、总镁、总硫、总铝含量分别高出31.3％、41.7％、129.6％、9.1％。同时降低了可溶性重金属元素铜和锌的含量，褐煤鸡粪堆肥中可溶性铜、可溶性锌含量分别对对照降低30.5％、11.7％。
实施例2：褐煤对猪粪堆肥中抗性基因和整合子基因intI 1丰度的影响
本实施例利用猪粪、稻壳、蘑菇渣作为原材料(褐煤处理组，简称T)，其具体堆肥步骤如下：
1)将猪粪、蘑菇渣、稻壳风干后剪成1cm小段，褐煤风干后粉碎过2mm筛，备用；
2)将褐煤粉末、猪粪、蘑菇渣+稻壳按照干质量比20:65:15的比例充分混匀后获得堆肥原料，使得混合物C/N为20,加水使得混合物初始含水率为55％；
3)将混合物50kg(鲜质量)放入体积为160L的堆肥箱进行堆肥，每隔7天人工翻堆一次， 28天后堆肥完全腐熟，获得褐煤堆肥产物，经检测，该褐煤堆肥产物符合畜禽粪便堆肥腐熟标准(NY/T3442-2019)。
实施例2中增加生物炭处理作为对比例，所添加的生物炭由20目的麦秸经马弗炉600℃厌氧裂解1h所得，用量为堆肥原料(猪粪+蘑菇渣、稻壳等)总干质量的5％，简称BC。同时以不添加褐煤的堆料为对照，简称CK。
堆肥产物的抗性基因相对丰度及整合子基因intI 1丰度进行检测检测结果分别如图3和图 4所示。其中，图3A为β-内酰胺类抗性基因相对丰度检测示意图，图3B为四环素类抗性基因相对丰度检测示意图，图3C为大环内酯类抗性基因相对丰度检测示意图，图3D为磺胺类抗性基因相对丰度检测示意图。由图3可见，堆肥降低了猪粪中β-内酰胺类、四环素类、大环内酯类抗性基因的相对丰度，添加了褐煤或生物炭可以增强这些抗性基因的去除效果。腐熟堆肥中，CK、BC、T中的β-内酰胺类ARGs相对丰度比初始物料分别下降35.1％、36.6％、42.3％；四环素类分别下降53.0％、73.5％、81.7％。CK、BC中磺胺类抗性基因丰度堆肥后上升了42.4％、 5.44倍，但T中下降了36.9％。与BC相比，T中β-内酰胺类、四环素类、磺胺类抗性基因的丰度分别降低17.3％、34.0％、5.9％。
堆肥后，整合子基因intI 1相对丰度出现富集，CK、BC、T腐熟堆肥中该基因丰度比初始物料增加71.9％、87.7％、30.6％，且T中丰度最低，分别比CK、BC低21.3％、7.1％。可见褐煤可以抑制堆肥后整合子基因intI 1的增加。
此外，由于生物炭制备过程中，需要在500℃到600℃的高温下，将有机物质置于缺氧状态下，对其有控制地进行高温分解。因此生物炭生产成本较高，一般市场价格1600～2000元/ 吨。褐煤属于自然资源，世界多个国家包含中国存量丰富，在主产区褐煤价格一般200～300元 /吨。堆肥法每处理1吨畜禽粪便，添加生物炭成本需要96～120元，添加褐煤成本仅需要56～84 元。可见，与生物炭相比，褐煤显著降低了处理成本。
