一种畜禽粪便堆肥用促腐保氮菌剂及制备和应用方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种堆肥用促腐保氮除臭菌剂及制备和应用方法。
背景技术
堆肥是指在微生物参与条件下，堆肥原料经过矿化和腐殖化作用，可降解有机物被转化为无机物或性质相对稳定的腐殖质的生物化学过程。
堆肥控制包括过程控制和污染控制两个方面。其中，堆肥过程控制技术是降低运行成本、提高堆肥产品质量的重要技术。降低堆肥原料的矿化率比例、提高腐殖化比例是实现堆肥控制并区别于自然腐败的主要标志。原因在于，以矿化过程为主的自然腐败，原料中的有机碳需降解超过38％时，才认为基本腐熟，利用有机质与有机碳的转换系数 1.724计算可知，此时有机质降解幅度在65％左右。这样的堆肥方式会极大造成堆肥原料的损失，从而导致堆肥产品总量和品质的显著下降。
定向腐殖化堆肥，是降低矿化作用，特异性加强腐殖化过程的堆肥发酵新技术。该技术既有利于增加堆肥产品的总量，同时还能减少CO2和NH3的排放。但堆肥腐殖化过程受多种因素的影响，其中，原料本身的差异和微生物制剂的使用尤为关键。
现代理论认为，腐殖质的形成机理为：在微生物参与下，有机残体中的木质纤维素成分经分解-氧化-缩合-脱氢作用形成酚类、醌类物质，这些物质与蛋白质的降解产物(氨基酸或肽)合成低分子量腐植酸，腐植酸可进一步缩合形成分子量更大的腐殖质。腐殖质形成的直接原料是醌酚类的芳构化单体或衍生物与氨基酸类物质。因此，以木质素、纤维素为主的辅料常常被大量添加应用在以畜禽粪便为主的堆肥发酵中，一方面可调节原料碳氮比，同时也可增加堆肥腐殖质含量。但简单的物质堆摞难以引发腐殖化所需要的生化过程，原因是缺乏促使腐殖酸形成的微生物类群，或者难以协调微生物在堆肥过程中的时空分布和代谢关系，而这也是以往研究极少涉及到的领域。
不仅如此，自然条件下，堆肥物质的降解有“先易后难”的显著特点。即微生物会优先利用堆肥原料中易降解的蛋白质(产生氨基酸或肽)、糖类和脂肪，再分解难于利用的纤维素和木质素。从而导致腐殖质合成的两大前体物质的错位供应，造成矿化作用在堆肥前中期强烈发生，释放出大量的氨气，而堆肥中后期腐殖化作用才开始缓慢进行。然而，企业为提高生产效率对堆肥发酵的时长往往实行严格控制(30天左右)，这进一步造成许多产品没有得到完全腐熟，使用此类产品容易造成烧根、死苗、根系缺氧以及土壤酸化等不利影响。
目前大部分堆肥微生物制剂的实质仍是增加堆肥初期微生物数量，以寻求堆肥原料的快速矿化降解，从而快速达到使物料稳定化的目的。这种方式虽然能够在一定程度上缩短堆肥周期，避免原料的大量堆积，但快速分解会造成大量的氨挥发氮素损失以及各种挥发性臭味气体，既污染环境又降低了堆肥品质。
如何科学有效地实现堆肥过程控制与污染控制一直被认为是快速堆肥的核心问题，也是高效复合菌剂研发的理论基础。其关键在于挖掘优良的微生物菌种资源，帮助菌株在堆肥环境中的快速稳定扩繁，以及调节各微生物代谢的协调进行。现有技术往往直接利用仅有单一降解作用的不同功能菌株，通过各种合成培养基在人为营造的条件下进行扩培、混合后直接作为堆肥菌剂，无法真正解决上述问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种堆肥用促腐保氮除臭菌剂及制备和应用方法。（保藏地址均为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号）
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一株短芽孢杆菌，于2020年 3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNo.19516。
相应的，一株短芽孢杆菌，其16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。
相应的，一株短芽孢杆菌，菌落呈黄灰色圆形，表面光滑湿润，有光泽，表面低凸，边缘不规则；菌体杆状，芽孢中生，孢子椭圆形；适宜生长条件为：25～35℃，pH值为 5～8。
相应的，所述短芽孢杆菌在降解蛋白质中的应用。
相应的，一种包括所述短芽孢杆菌的微生物组合物。
优选的，所述微生物组合物包括：蛋白质降解菌、纤维素降解菌、定向促腐菌、角蛋白降解菌、产乳酸芽孢菌、氨氧化菌及硫氧化菌，所述蛋白质降解菌包括所述短芽孢杆菌。
优选的，所述蛋白质降解菌同时包括适宜生长温度为20～45℃的中温菌及适宜生长温度为45～60℃的高温菌。
优选的，所述蛋白质降解菌为所述短芽孢杆菌或所述短芽孢杆菌和短短芽孢杆菌的混合物；和/或；所述纤维素降解菌为橙色嗜热子囊菌；和/或；所述定向促腐菌为堆肥气杆菌；和/或；所述角蛋白降解菌为甲基营养型芽孢杆菌；和/或；所述产乳酸芽孢菌为凝结芽孢杆菌；和/或；所述氨氧化菌为地尿素芽孢杆菌；和/或；所述硫氧化菌为鞘鞍醇杆菌。
优选的，所述短短芽孢杆菌于2020年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.19517；和/或；所述橙色嗜热子 囊菌于2020年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏编号为：CGMCCNo.19606；和/或；所述堆肥气杆菌于2019年05月30日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.17866；和/或；所述甲基营养型芽孢杆 菌的16S rDNA如SEQ ID NO：5所示；和/或；所述凝结芽孢杆菌购自中国普通微生 物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.10823；和/或；所述地尿素芽孢杆菌为 于2020年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏 编号为：CGMCC No.19518；和/或；所述鞘鞍醇杆菌于2016年6月16日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.12632。
相应的，所述微生物组合物在处理畜禽粪便中的应用。
本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种微生物菌剂，包括多种可相互协作的微生物。其中主要包括，可实现堆肥全过程纤维素高效降解并产生醌、酚类芳构化单体的橙色嗜热子囊菌；分别在中温和高温条件下快速分解蛋白质产生氨基酸、多肽等腐植酸组成成分的土壤短芽孢杆菌和短短芽孢杆菌；以及降低矿化率、催化醌酚类芳构化单体与氨基酸和多肽形成腐植酸、促进堆肥定向腐殖化的堆肥气杆菌。另外，地尿素芽孢杆菌可将游离氨氧化成亚硝酸，进而向硝酸转化，减少氨氮的积累。凝结芽孢杆菌具有极强的高温耐受能力，可避免被高温杀灭，且能够产生大量乳酸，抑制堆体pH上升，进一步避免氨挥。鞘氨醇杆菌可将硫化氢氧化为硫酸根，既可避免了恶臭产生，还提高了堆肥的硫营养。此外，该微生物菌剂对畜禽粪便堆肥中典型的臭味VOCs有显著的减排作用。
附图说明
图1为鸡粪堆肥中，温度变化情况示意图；
图2为鸡粪堆肥中，氨气挥发量情况示意图；
图3为鸡粪堆肥中，硫化氢挥发量情况示意图；
图4为鸡粪堆肥中，pH变化情况示意图；
图5为鸡粪堆肥中，氨氮浓度变化情况示意图；
图6为鸡粪堆肥中，硝氮浓度变化情况示意图。
具体实施方式
一、本发明提供了一种微生物菌剂，可对畜禽粪便进行针对性堆肥发酵处理，实现畜禽粪便的保氮、除臭、低矿化定向腐殖化堆肥。可广泛应用于静态通气堆肥、动态条垛堆肥、槽式好氧堆肥以及设备容器堆肥等。
所述微生物菌剂包括中温蛋白质降解菌、高温蛋白质降解菌、纤维素降解菌、定向促腐菌、角蛋白降解菌、产乳酸芽孢菌、氨氧化菌以及硫氧化菌。各微生物具体如表1 所示。
表1微生物菌剂中各微生物
优选的方案为，所述微生物菌剂中，按各微生物固体制剂的质量份数，包括3份中温蛋白质降解菌、7份高温蛋白质降解菌、10～20份纤维素降解菌、10～20份定向促腐菌、1份角蛋白降解菌、1～5份产乳酸芽孢菌、1～5份氨氧化菌以及1份硫氧化菌。
所述微生物的固体制剂的制备方法为：
(1)获得各微生物种子液：对于细菌(即除橙色嗜热子囊菌ZJ3以外的其它微生物)，分别挑取一接种环菌体，培养至活菌浓度为109CFU/mL，制得种子液。对于真菌(橙色嗜热子囊菌ZJ3)，从橙色嗜热子囊菌中挑取一接种环菌丝体，培养至菌丝体浓度15％，制得种子液。
(2)将步骤(1)获得的各微生物种子液分别以1：5的重量比，单独接入畜禽粪便发酵培养基中，调节含水率在50％～60％之间，于固体发酵罐内各菌株适应的温度条件下进行驯化扩培至单克样品中菌体数量或孢子数量≥109即可。扩培结束后，于阴凉通风处控干水分至20％左右，即获得所需的各微生物的固体制剂。
二、本发明还在微生物菌剂的基础上，进一步提供了将其应用到堆肥中，尤其是针对性应用到畜禽粪便的堆肥中的方法。所述方法为：调节堆肥原料的C/N为25～35，含水率为50％～60,pH为6～9；将所述微生物菌剂接种到堆肥原料中，接种比例≥堆肥原料的1％(w/w)。在30～60℃下进行堆肥发酵处理即可。
下面结合具体实施例，对本发明进行进一步阐释。
实施例一：微生物菌剂中各微生物的初步筛选
畜禽粪便是一种常见的堆肥原料，主要成分为碳水化合物(以纤维素为主)、粗蛋白以及无机盐，在堆肥过程中常常还会添加以纤维素为主的辅料物质。能否高效利用畜禽粪便中的主要成分进行快速生长繁殖，能否高效将主要成分定向转化为腐殖质，是选择畜禽粪便特异性功能堆肥微生物的关键。因此，本实施例利用常见畜禽粪便(鸡粪与猪粪)混合物作为唯一的碳源和氮源，对相关微生物进行筛选。另外，由于堆肥不同阶段温度差异较大，为尽量避免高温阶段对部分菌株造成毁灭性伤害，所以在功能菌株备选材料中以芽孢菌为主。需要说明的是，本发明前期进行了大量功能菌筛选试验，因篇幅限制，本实施例只展示了其中部分具有代表性的备选菌，并非指本发明只对列出的备选菌进行了相关试验。
1、蛋白质降解菌的筛选
(1)培养基的准备：
畜禽粪便固体培养基：粉末状鸡粪50g，粉末状猪粪50g，花生壳粉25g，琼脂12g、蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。
畜禽粪便液体培养基：粉末状鸡粪50g，粉末状猪粪50g，花生壳粉25g，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min。
LB培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，酵母粉4g，葡萄糖5g，蒸馏水 1000mL，pH＝7.0，121℃灭菌20min。
(2)备选微生物：
中温蛋白质降解备选菌：土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri，命名编号为N10，从土壤中分离)，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus，命名编号为H1，从堆肥中分离)，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，命名编号为L3A，从淤泥中分离)，类短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis，编号为H22，从堆肥中分离)，枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis，编号L1A，从堆肥中分离)。
高温蛋白质降解备选菌：约翰逊不动杆菌(Acinetobacter johnsonii，命名编号为50-1，从堆肥中分离)，丝状芽孢杆菌(Bacillus velezensis，命名编号为DF，从堆肥中分离)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号ACCC 10213)，短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis，命名编号为 50-11，从土壤中分离)，嗜热脂肪地芽胞杆菌(Geobacillus stearothermophilus，购买自中国农业微生物菌种保藏管理中心，编号ACCC 10253)。
(3)将上述10株菌活化后，各取一环分别接种到LB培养基液体培养基中，分别于40℃(中温菌)或55℃(高温菌)摇床培养36h，制备各微生物种子液。
用无菌移液器分别吸取10μL各微生物种子液，分别接种到畜禽粪便固体培养基中间，随后分别于40℃(中温菌)或55℃(高温菌)下倒置培养48h。随后利用游标卡尺测定各培养基中的菌落直径D。相同培养条件下，D值越高，表明菌株的生长越好。同时将各微生物种子液按体积比为5％的接种量转接到畜禽粪便液体培养基中，于对应的温度下40℃或55℃、160r/min培养72h，并以不接种作对照。采用双缩脲法测定蛋白质降解率，蛋白质降解率越高，菌株降解蛋白类物质的能力越强。结果如表2所示。
表2各微生物在畜禽粪便培养基中的生长情况和蛋白质降解情况展示
根据表2的结果，并综合考虑各微生物在微生物菌剂中是否存在拮抗作用和协同作用，选择N10作为中温蛋白质降解菌，选择50-11作为高温蛋白降解菌。
2、纤维素降解菌的筛选
(1)培养基的准备：
高氏1号：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，pH＝7.4～7.6。
PDA液体培养基：称取去皮土豆200g，切成小块，加水煮沸20～30分钟，用八层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20.0g，补充水分到1000mL。
纤维素液体培养基：羧甲基纤维素钠15.0g、MgSO4·7H2O 0.5g、KH2PO4 4.0g、CaCl20.3g、NaCl 0.5g、酵母膏0.5g，蛋白胨3.0g和蒸馏水1000mL制成，调pH至6.5～7.0。
(2)备选微生物：玫瑰色放线菌(Actinomyces roseodiastaticus，命名编号为DZ13，从堆肥中分离)、纤维单胞菌(Cellulomonas fimi，命名编号为DY6，从堆肥中分离)、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum，命名编号为ZJ1，从堆肥中分离)、热梭菌(Clostridium thermocellum，命名编号为DZ41，从堆肥中分离)、嗜热毁丝菌(Mycelophthora thermophis，购买自中国微生物菌种查询网，编号为DSM 1799)、橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus，命名编号为ZJ3，从堆肥中分离)、褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca，命名编号为F5，从堆肥中分离)、弯曲高温单胞菌(Thermomonospora curvata，命名编号为B-5，从堆肥中分离)、高温单胞菌(Thermomonospora sp.，命名编号为Q-0，从堆肥中分离)、里氏木霉(Trichodermakoningii，命名编号为AC-2，从堆肥中分离)。
(3)将上述10株菌活化后，各取一环分别接种到高氏1号(放线菌)或PDA液体(真菌)液体培养基中，50℃摇床培养36h，制备为各微生物种子液。
将各微生物种子液分别按体积比为5％的接种量转接到纤维素液体培养基中，50℃、 160r/min培养72h。采用DNS法测定纤维素酶的活力，纤维素酶活力越高，菌株降解纤维素类物质的能力越强。同时用无菌移液枪分别吸取10μL各微生物种子液，接种到畜禽粪便固体培养基中间，分别于45℃和55℃条件倒置培养48h。再分别利用游标卡尺测定各菌落直径D，相同培养条件下，D值越高，表明菌株的生长越好。结果如表3所示。
表3各微生物在畜禽粪便培养基中的生长情况和纤维素降解情况展示
根据表3的结果，并综合考虑各微生物在微生物菌剂中是否存在拮抗作用和协同作用，选择ZJ3作为纤维素降解菌。
3、定向促腐菌的筛选
(1)备选微生物：堆肥气杆菌(Aeribacillus composti，命名编号为GZY6-1，从堆肥中分离)、苍白气杆菌(Aeribacillus pallidus，保藏编号为CICC 22990，从堆肥中分离)、纤毛湿热菌(Aliibacillus thermotolerans，命名编号为AXY-4，从堆肥中分离)、琼脂梭菌(Ammoniibacillus agariperforans，命名编号为DF-154，从堆肥中分离)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC10518)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus，命名编号为LJ-71，从堆肥中分离)、土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri，命名编号为N-10，从堆肥中分离)、乌米堆肥芽孢菌(Compostibacillus humi，命名编号为DF-39，从堆肥中分离)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus，购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC10267)、托比副杆菌(Parageobacillus toebii，命名编号为DF-101，从堆肥中分离)、堆肥嗜热杆菌(Thermobacillus composti，命名编号为DF-92，从堆肥中分离)、高山热长杆菌(Thermolongibacillus altinsuensis，命名编号为WQ-C2，从堆肥中分离)、堆肥脲杆菌(Ureibacillus composti，命名编号为DF-208，从堆肥中分离)。
(2)将上述各微生物活化后，分别接种到LB液体培养基，55℃摇床培养36h，制备得各微生物种子液。
用无菌移液枪吸取10μL各微生物种子液，接种到畜禽粪便固体培养基中间，于55℃条件下倒置培养48h。随后利用游标卡尺测定菌落直径D。相同培养条件下，D值越高，表明菌株的生长越好。
同时，将各微生物种子液按照重量比为5％的比例接种到盛有2kg堆肥原料的5L广口瓶中。所述堆肥原料组分为：5重量份的鸡粪和2重量份的花生壳粉，C/N为25.16： 1。用无菌水调节水分含量在55％左右，在瓶口盖上6层厚的纱布并用橡皮筋套紧，放置在55℃的培养箱中连续培养，作为试验组，每组设置3个平行。以相同条件、相同堆肥原料，接种等量灭菌的LB液体培养基(替代微生物种子液)作为空白对照组(CK)。试验期间，每隔12小时，将培养瓶放置于弹簧振荡器中摇晃5min，进行“翻堆”透气处理，另用称重法补充水分，调整含水率为55％。培养至30天时，分别对各试验组进行取样，使用水杨酸分光光度法和1％NaOH浸提-重铬酸钾容量法，分别测定各组的氨氮和游离腐植酸(Humic Acid，简写HA)含量，并测定矿化率。矿化率计算公式为：
式中：RM表示有机物的矿化率；M0表示原料初始质量(干基)；RO0表示原料初始有机质含量；Mt表示试验结束时物料质量(干基)；ROt表示试验结束时物料有机质含量。结果如表4所示。
表4各微生物在畜禽粪便培养基中的生长情况和定向促腐情况展示
根据表4的结果，在连续培养条件下，GZY6-1处理下的物料氨氮含量较对照处理减少81.03％，腐殖酸含量显著高于其他菌株处理，且矿化率得到有效抑制，仅为17.38％，表现出优异的低矿化定向腐殖化性能。并综合考虑各微生物在微生物菌剂中是否存在拮抗作用和协同作用，选择GZY6-1作为定向促腐菌。
4、角蛋白降解菌的筛选
(1)准备培养基和溶液：
羽毛角蛋白降解培养基：NaCl 0.5g，K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.35g，MgSO4·7H2O0.2g，羽毛5g，蒸馏水1000mL，微量元素1mL，调pH至7.0～7.2。
微量元素溶液：EDTA-二钠0.5g、ZnSO4·7H2O 0.22g、CaCl2 0.056g、MnCl2·4H2O0.05g、 CuSO4·5H2O 0.016g、FeSO4·7H2O 0.05g、(NH4)6MoO24·4H2O 0.01g、CaCl2·4H2O0.016g、CoCl2.6H2O 0.02g、蒸馏水1000ml。调节pH＝7.0。
(2)备选微生物：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens，命名编号为H23，从堆肥中分离)、解淀粉芽孢杆菌亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp，命名编号为H5，从堆肥中分离)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus，命名编号为H1，从堆肥中分离)、甲基营养芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus，命名编号为H0，从堆肥中分离)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，命名编号为H27，从堆肥中分离)、土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri，命名编号为N10，从堆肥中分离)、短短芽孢杆菌 (Brevibacillusparabrevis，命名编号为H22，从堆肥中分离)、耳炎假单胞菌类 (Pseudomonas otitidis，命名编号为H11，从堆肥中分离)。
(3)将上述8株菌活化后，各取一环分别接种到LB培养基液体液体培养基中，50℃摇床培养36h，制备各微生物种子液。
用无菌移液枪吸取10μL各微生物种子液，接种至畜禽粪便固体培养基中间，于40℃或55℃条件倒置培养48h。利用游标卡尺测定菌落直径D，相同培养条件下，D值越高，表明菌株的生长越好。同时，将各微生物种子液按体积比为5％的接种量分别转接到羽毛角蛋白降解培养基中，于对应温度下160r/min分别培养72h。将反应后发酵液用真空抽滤瓶进行抽滤，滤渣于105℃烘干至恒重后称量，并按照下式计算角蛋白降解率：
结果如表5所示。
表5各微生物在畜禽粪便培养基中的生长情况和降解角蛋白情况展示
根据表5的结果，并综合考虑各微生物在微生物菌剂中是否存在拮抗作用和协同作用，选择H0作为角蛋白降解菌。
5、产乳酸芽孢菌的筛选
(1)配制乳酸发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，牛肉膏5g，吐温80 1mL，柠檬酸铵2g，柠檬酸钠5g，硫酸镁0.1g，硫酸锰0.05g，磷酸氢二甲2g，碳酸钙10g，蒸馏水1000mL，调pH至7.0～7.2。
(2)备选微生物：凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans，命名编号为FD3-1，从堆肥中分离)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.10823)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.0813)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.1870)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，命名编号为YX7，从土壤中分离)、枯草芽孢杆菌 (Bacillussubtilis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.884)、胶冻样类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.153)。备选微生物的选择要求为：能适应堆肥的高温、高pH恶劣环境；故主要选择适应能力强的芽孢菌。
(3)将上述8株菌活化后，各取一环分别接种到LB培养基液体培养基中，于对应温度摇床培养36h，分别制备为各微生物种子液。
用无菌移液枪吸取10μL各微生物种子液接种到畜禽粪便固体培养基中间，于40℃或55℃条件倒置培养48h。利用游标卡尺测定菌落直径D，相同培养条件下，D值越高，表明菌株的生长越好。同时，将各微生物种子液按体积比为5％的接种量转接到乳酸发酵培养基或畜禽粪便液体培养基中，于对应温度下50r/min培养72h，获得各微生物发酵液。取各发酵液用冷冻离心机4℃、10000r/min离心5min，用0.42μm的针头过滤器过滤，再利用高效液相色谱仪进行乳酸含量分析，并测定pH。结果如表6所示。
表6各微生物在畜禽粪便培养基中的生长情况和乳酸产量展示
根据表6可以看出，备选菌株1.10823在畜禽粪便固体培养基和乳酸发酵培养基均能够获得最大的乳酸浓度，并综合考虑各微生物在微生物菌剂中是否存在拮抗作用和协同作用，选择1.10823作为产乳酸芽孢菌。
6、氨氧化菌的筛选
(1)准备培养基和溶液：
氨氧化液体培养基：葡萄糖9.09g/L、乙酸钠6.20g/L、丁二酸钠6.13g/L、柠檬酸钠7.42g/L、蔗糖4.32g/L、硫酸铵2.0g，碳酸钙5.0g，维氏盐溶液50mL，去离子水1000mL， pH＝7.0。
维氏盐溶液：磷酸氢二甲5.0g，七水合硫酸镁2.5g，氯化钠2.5g，七水合硫酸亚铁0.05g，硫酸锰0.05g，去离子水1000mL。
(2)备选微生物：地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus，命名编号为SD2-2，分离自堆肥)、嗜热球形尿素芽胞杆菌(Ureibacillus thermosphaericus，命名编号为 HF2，分离自堆肥)、堆肥尿素芽孢杆菌(Ureibacillus composti，命名编号为DF-208，分离堆肥)、苍白地杆菌(Geobacillus pallidus，命名编号为DF-133，分离堆肥)。
(3)将上述各微生物活化后，各取一环分别接种到氨氧化液体培养基中，于55℃温度摇床培养36h，制备各微生物种子液。
用无菌移液枪吸取10μL各微生物种子液接种于畜禽粪便固体培养基中间，于50℃条件倒置培养48h。利用游标卡尺测定菌落直径D，相同培养条件下，D值越高，表明菌株的生长越好。同时，将各微生物种子液按体积比为5％的接种量转接到畜禽粪便液体培养基中，于55℃条件下180r/min培养72h，获得发酵液。取各微生物的发酵液用冷冻离心机4℃、10000r/min离心5min，采用水杨酸分光光度法(λ＝697nm)、酸萘乙二胺分光光度法(λ＝540nm)和酚二磺酸比色法(λ＝420nm)测定上清液中NH4+、NO2-和NO3-浓度。结果如表7所示。
表7各微生物在畜禽粪便培养基中的生长情况和氨氧化情况展示
从表7可以看出，SD2-2的氨氧化能力最强，培养基中剩余的氨氮含量最少。并综合考虑各微生物在微生物菌剂中是否存在拮抗作用和协同作用，选择SD2-2作为氨氧化菌。
7、硫氧化菌的筛选
(1)准备培养基和溶液：
硫氧化菌液体培养基：牛肉膏5.0g、酵母粉5.0g、KH2PO4 1.0g、K2HPO4 1.0g、MgCl20.8g、NH4Cl 0.4g、微量元素溶液10mL、维生素溶液10mL、蒸馏水1000mL，pH＝7.0。微量元素溶液组分同上文。
维生素溶液：维生素H 2.0mg、维生素B2 5.0mg、维生素B 2.0mg、烟酸5.0mg、盐酸吡哆醇10.0mg、D-泛酸钙5.0mg、盐酸硫胺5.0mg、维生素B12 0.1mg、对氨基苯甲酸5.0mg、硫辛酸5.0mg、蒸馏水1000mL。
A型脱硫培养基：NaHS·H2O 1.5g、NaHCO3 1g、KH2PO4 1g、K2HPO4 1g、NH4C 0.8g、MgSO4 0.4g、维生素溶液1mL、微量元素溶液1mL，1000mL蒸馏水。
B型脱硫培养基：NaHS·H2O 1.5g、鸡粪50g、猪粪50g、花生壳粉25g，1000mL蒸馏水。
(2)备选微生物：别许旺氏菌(Alishewanella aestuarii，命名编号为DS-21，分离自硫氧化富集培养物)、脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans，命名编号为DS-2，分离自硫氧化富集培养物)、善变副球菌(Paracoccus versutus，命名编号为DS-11，分离自硫氧化富集培养物)、蒙氏假单胞菌(Pseudomonas monteilii，命名编号为DS-8，分离自硫氧化富集培养物)、红细菌(Rhodobacter sp.，命名编号为DS-17，分离自硫氧化富集培养物)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium.sp.，命名编号为DS-4，分离自硫氧化富集培养物)。
通常情况下，非芽孢属的功能菌若分布于堆肥内部，在堆肥高温阶段会遭受严峻的生存考验。但发明人通过对不同层次的堆肥物料微生物群落进行调查后发现，以硫氧化为主的功能菌主要集中在堆肥温度较低的表层，这是因为硫氧化菌属于好氧微生物。因此，上述备选微生物虽然均不是芽孢杆菌，但依然可以应用于堆肥中。
(3)将上述各微生物活化后，各取一环分别接种到硫氧化菌液体培养基中，于40℃摇床培养36h，获得各微生物种子液。
用无菌移液枪吸取10μL微生物种子液接种到畜禽粪便固体培养基中间，随后于40℃条件倒置培养48h。利用游标卡尺测定菌落直径D，相同培养条件下，D值越高，表明菌株的生长越好。同时，将各微生物种子液按体积比为5％的接种量分别转接到A型脱硫培养基和B型脱硫培养基中，于40℃条件下180r/min培养4h，获得各微生物发酵液。取各微生物发酵液用冷冻离心机4℃、10000r/min离心5min，采用亚甲基蓝分光光度法 (λ＝660nm)测定上清液的硫化物浓度，用于计算硫化物去除率。结果如表8所示。
表8各微生物在畜禽粪便培养基中的生长情况和硫化物去除情况展示
根据表8可以看出，备选菌株DS-4和DS-8的适应性强、硫化物去除率高，并综合考虑各微生物在微生物菌剂中是否存在拮抗作用和协同作用，作为备选微生物。
实施例二：微生物菌剂中各微生物的二次筛选
实施例一在选择微生物时，某些微生物出现多个菌株均能较好实现发明目的的情况。在实施例一的基础上，补充进行了微生物间的拮抗试验，最终确定微生物菌剂中所用的微生物种类。进行拮抗试验的备选微生物如表9所示。
表9进行拮抗试验的微生物一览表
将表9中各微生物活化、制备为微生物种子液。随后利用温度适宜区间进行分组：具体分为20～45℃组(包括N10、L3A、H0、1.10823、DS-8、DS-4)和45～60℃组(包括50-11、ZJ3、GZY6-1、SD2-2)。
吸取同一组中的各微生物种子液分别涂布于畜禽粪便固体培养基(平板)上，使该微生物生长布满平板。随后再将蘸有其他单一菌株种子液的滤纸片粘贴在各长满单一微生物的平板上。每种菌株重复3次，处理完成后将平板倒置于对应温度区间的培养箱中 48h，观察并记录菌株的拮抗情况。如果滤纸片周围出现生长真空圈，则说明滤纸片上的微生物与平板上的微生物间存在拮抗作用。
结果表明，L3A与1.10823间存在明显的抑制现象，DS-8和N1O间存在明显的抑制现象，其余各菌株之间均不存在的拮抗关系。故排除L3A和DS-8。
当然，应当理解的是，发明人并非只进行了如上拮抗试验，上述试验只作为示例。
综合考虑各菌种功能效果和菌种之间的拮抗关系及协同作用，选择N10、50-11、ZJ3、 GZY6-1、H0、1.10823、SD2-2、DS-4作为最终入选功能菌株，这些菌株的情况介绍如下：
土壤短芽孢杆菌N10的菌落微凸呈黄灰色圆形，表面光滑湿润，有光泽，边缘不规则。菌体呈杆状，芽孢中生，不膨大，孢子椭圆形。适宜培养条件为：25～35℃，pH值为5～8。可产蛋白酶，能快速分解动植物蛋白类物质。所述土壤短芽孢杆菌 (Brevibacillus agri)N10于2020年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：CGMCC No.19516。其16S rDNA如SEQ ID NO：1所示。
短短芽孢杆菌50-11的菌落呈圆形，表面光滑、湿润、边缘整齐，颜色为灰白色。球杆状，无芽孢，无鞭毛。适宜培养条件为：40～60℃，pH值为5～9。可产蛋白酶，能快速分解动植物蛋白类物质，适合在高温时期(发酵中后期、放热期)分解厨余垃圾中的豆制品、肉制品和牛奶等物质。所述短短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)50-11 于2020年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：CGMCC No.19517。其16SrDNA如SEQ ID NO：2所示。
橙色嗜热子囊菌ZJ3的菌落呈棉絮状，初为白色，在培养过程中逐渐变为橙色，后期分泌橙色液体，生长极快，在PDA培养基上，50℃下可在24h内长满平板。最适生长温度为45～50℃，最适生长pH为5～6。可产纤维素酶，能快速分解纤维素类物质，适合分解厨余垃圾中的水果、蔬菜等食物残渣。所述橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)ZJ3于2020年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：CGMCC No.19606。其16S rDNA如SEQ ID NO：3所示。
堆肥气杆菌GZY6-1的菌落呈乳白色，表面凸起有光泽，边缘近似圆形，不粘稠易挑取。24h后，60℃下菌落直径约为2～3mm。堆肥气杆菌GZY6-1为短杆状，大小为(1.0～ 2.0)μm×(2.5～4.0)μm，革兰氏染色为阳性，存在内生孢子。生长环境为：30～65℃， pH 5.5～10.0，2～9％(w/v)NaCl。最佳生长温度为55℃，pH＝8.5，含0.6％氯化钠(w/w；在TSB培养基上)。于2019年06月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，菌种名称：堆肥气杆菌(Aeribacilluscomposti strain)GZY6-1，保藏号为CGMCC No.17866。其16S rDNA 如SEQ ID NO：4所示。
甲基营养型芽孢杆菌H0菌落特征为：在牛肉膏蛋白胨平板上培养48h后，菌落近圆形，扁平状，中间凸起，边缘有缺刻，不透明，干燥易挑取。H0的细胞形态为杆状，长 1.27～3.0μm，无鞭毛，革兰氏染色为阳性；其其培养条件的pH值范围为2.0～11.0，最适pH值为7.0，生长温度为20～45℃，最适温度为31℃，在牛肉膏蛋白胨培养基中生长迅速，8h后进入稳定期。所述甲基营养型芽孢杆菌(bacillus methylotrophicus) H0于2017年6月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：CGMCC No.14263。其16S rDNA如SEQ ID NO：5所示。
凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.10823。
氨氧化菌地尿素芽孢杆菌SD2-2的菌落呈白色，表面干燥，边缘不整齐，不易挑取，棒杆状，革兰氏阳性。适宜生长条件为：45～65℃，pH为4～8。高温条件下氨的挥发较为严重，非常容易造成氨恶臭。该菌能够将挥发性的氨气氧化为不挥发的硝酸盐，可用于降低厨余垃圾生物干化高温期氨的挥发，从而达到除臭的目的。所述氨氧化菌地尿素芽孢杆菌(Ureibacillus terrenus)SD2-2于2020年3月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：CGMCC No.19518。其16S rDNA如SEQ ID NO：6所示。
硫氧化细菌鞘鞍醇杆菌DS-4的菌落呈圆形，表面湿润，中间凸起，边缘整齐，颜色为淡黄色，短杆状，革兰氏阴性。适宜生长温度为：20℃～40℃，最适生长温度为30℃，适宜pH为6.0～8.0，最适pH值为7.0。去除硫化物的能力强，可用于厨余垃圾生物干化过程中产生的含硫化物如硫化氢、硫醇和甲硫醇等恶臭气体的去除；为中温菌。所述鞘鞍醇杆菌(sphingobacterium sp.)DS-4于2016年6月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏编号为：CGMCC No.12632。其16S rDNA如SEQ ID NO：7所示。
实施例三：微生物菌剂中各微生物配比选择
以畜禽粪便为主的堆肥原料中一般都存在较高含量的粗蛋白和纤维素；同时，在自然堆肥过程中，由于缺少能够降低堆肥原料的矿化率、提高其腐殖化率的微生物，所以往往会产生并挥发大量的氨气，且堆肥成品中的腐殖质含量低，腐熟程度不高。因此，本发明在微生物的配比上，以蛋白质降解菌、纤维素降解菌及定向促腐菌为主，其他功能菌株为辅。另外，发明人研究发现，畜禽粪便堆肥过程中，处于＜45℃状态的时间和处于＞45℃状态的时间占比约为3:7；因此，将中温蛋白质降解菌与高温蛋白质降解菌的用量配比设置为3:7。
为进一步提供一种可针对性处理畜禽粪便、降低矿化率、提高腐殖化率的微生物菌剂，在其它条件相同的情况下，按表10的方式设置8组微生物配比不同的微生物菌剂。其中，表10中的数值指对应微生物的固体制剂的重量份数。所述微生物的固体制剂的制备方法为：
(1)获得各微生物的发酵液：
对于细菌(即除橙色嗜热子囊菌ZJ3以外的其它微生物)，分别挑取一接种环菌体，单独接入已灭菌的LB培养基中，于各菌株适应的温度条件下培养至菌体浓度为 109CFU/mL(血球计数板计数法)，制得种子液。将种子液以20％(v/v)的接种量接入新的 LB培养基中进行发酵培养至菌体浓度≥109CFU/mL，制得对应菌株的发酵液。
对于真菌(橙色嗜热子囊菌ZJ3)，从橙色嗜热子囊菌中挑取一接种环菌丝体，接入已灭菌的PDA培养基中，于45℃条件下培养至菌丝体浓度15％(体积测量法)制得种子液。将种子液以20％(v/v)的接种量接入新的PDA培养基中进行发酵培养至菌丝体浓度≥15％，制得对应菌株的发酵液。
(2)将步骤(1)获得的各微生物发酵液分别以1：5的重量比，单独接入畜禽粪便发酵培养基中，调节含水率在50％～60％之间，于固体发酵罐内各菌株适应的温度条件下驯化扩培至单克样品中菌体数量或孢子数量≥109即可。
扩培结束后，于阴凉通风处控干水分至20％左右，即获得所需的各微生物的固体制剂。
表10各处理组中各微生物的配比展示
按表10的配比，制备8组重量均为87kg的微生物菌剂，分别接种于体积为1方的鸡粪堆肥原料中。所述鸡粪堆肥原料组成为：0.72方新鲜鸡粪与0.28方花生壳粉， C/N＝24.1，总质量8700kg。接种后放入堆肥箱中进行好氧发酵。同时设置不接种微生物菌剂的组别为空白对照组。各组发酵条件、时间相同，并每隔一天将所有堆肥物料倾倒翻堆一次。连续堆肥30天，分别于第3天测定堆体温度，第10天取样测定样品氨含量和pH，并利用静态箱-气相色谱法分析氨挥发与硫化氢浓度，第30天称重后取样测堆肥腐殖质含量。结果如表11所示。
表11鸡粪堆肥结果展示
在相同条件下，将鸡粪堆肥原料替换为猪粪堆肥原料，进行相同实验。所述猪粪堆肥原料的组成为：0.83方新鲜猪粪与0.17方花生壳粉；C/N＝25.7，总质量为8400kg。各微生物菌剂的接种总量为84kg，其余条件不变。结果如表12所示。
表12猪粪堆肥结果展示
根据表11、12的结果，针对鸡粪堆肥，组3、4的配比最佳，针对猪粪堆肥，组6 的配比最佳。对于畜禽粪便，按质量份数，各微生物固体制剂组成，3份土壤短芽孢杆菌、7份短短芽孢杆菌、10～20份橙色嗜热子囊菌、10～20份堆肥气杆菌、1份甲基营养型芽孢杆菌、1～2.5份凝结芽孢杆菌、1～2.5份地尿素芽孢杆菌、1份鞘氨醇杆菌，可取得较好的处理效果。
实施例四：微生物菌剂在鸡粪堆肥处理中的应用
按实施例三的方法制备微生物菌剂，微生物菌剂中，按质量比，各微生物固体制剂组成为：土壤短芽孢杆菌、短短芽孢杆菌、橙色嗜热子囊菌、堆肥气杆菌、甲基营养型芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、地尿素芽孢杆菌、鞘氨醇杆菌比值为3：7：10：20：1：2.5： 2.5：1。
本实施例针对性的选取了氨挥发量大、臭味较强的鸡粪作为堆肥原料；所述堆肥原料包括70％的鸡粪和30％花生壳粉(w/w)。堆肥方式为条垛式堆肥，堆肥规模为单位条垛100吨(长50m×宽3m×高1.5m)。
先将250kg微生物菌剂与4750kg堆肥原料均匀混合制堆(长8.5m×宽1.5m×高1m)，每隔一天翻堆一次。翻堆2次后，再与95吨鸡粪堆肥原料(鸡粪：花生壳粉＝7:3，w/w)均匀混合后制堆(长50m×宽3m×高1.5m)，堆肥时长50天。设置不添加微生物菌剂的组别作为为对照组，对照组与实验组间隔100米以上，防止相互干扰。
堆肥期间，每天10点测定堆垛两侧40cm深度处的温度(每间隔10米测一次，取均值)，并利用静态箱-气相色谱法测定堆体NH3、H2S的释放速率。并于第25天取样测定典型臭味VOCs(三甲胺、二甲二硫醚、甲苯以及丙醛)的释放速率。此外，堆肥当天采集初始样品，此后每天取样一次，用于分析物料pH、NH4+-N(靛酚蓝比色法)、NO3--N(酚二磺酸比色法)。从第30天起，增加测定样品的有机质(重铬酸钾-外加热法)、腐殖酸 (1.5％焦磷酸钠+0.7％氢氧化钠混合浸提液)、全氮(凯氏定氮法)以及种子的发芽指数 (《生活垃圾堆肥处理技术规范CJJ52-2014》附录A 0.3)。
温度变化情况如图1所示。堆体温度呈现先升温和先降温的现象，说明微生物菌剂可快速适应堆体环境，微生物发挥作用快，使堆体温度迅速增加，持续的高温快速降解使得原料易降解物质分解殆尽后，堆体温度开始下降，物料开始提前进入腐殖化阶段。与对照组相比，实验组升温更快、温度更高，降温也更快，进入腐殖化阶段的时间提前。
NH3释放情况如图2所示。NH3的挥发主要出现在堆肥高温阶段，添加微生物菌剂后，NH3排放量显著下降。整个堆肥期间每平米NH3排放总量为27628.97mg/m2，较对照处理减少90949.31mg/m2，微生物菌剂对氨挥发的抑制效果明显。
H2S的释放情况如图3所示。到第23天后，H2S的排放量接近零。与对照组相比，实验组H2S释放量减少了79.92％，堆肥期间释放总量仅为36.25mg/m2。
典型臭味VOCs释放情况如表13所示。
表13 VOCs释放速率展示表
pH变化情况如图4所示。实验组的pH相对稳定，基本保持在7.0～8.0之间，而对照组pH最高达到9.36。高pH会促使NH3挥发，出现该现象的原因可能在于地尿素芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌发挥了作用。
氨氮浓度(NH4+-N)变化情况如图5所示。对照组的氨氮浓度随着时间的推进，呈现先上升再下降的趋势，而实验组的整个处理过程中，氨氮浓度均保持较低的状态，且呈现下降趋势。堆肥气杆菌的同化吸收作用，及地尿素芽孢杆菌的氨氧化作用或许是出现这种结果的原因。
硝氮浓度(NO3--N)变化情况如图6所示。无论是对照组还是实验组，堆肥过程中，硝氮都呈现累计增加的趋势。但实验组的硝氮积累效果明显更佳，最终硝氮浓度较对照处理增加了3.20倍，达到了1076.66mg/kg，有效提高了堆肥产品的品质。
各组终产品(50d样品)中，有机质、腐殖酸和发芽指数如表14所示。
表14菌剂处理对堆肥有机质、腐殖酸以及发芽指数的影响
序列表
<110> 中国科学院成都生物研究所
<120> 一种畜禽粪便堆肥用促腐保氮菌剂及制备和应用方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213> 土壤短芽孢杆菌N10(Brevibacillus agri)
<400> 1
cggctggctc cttgcggttc ctcaccgact tcgggtgttg caaactcccg tggtgtgacg 60
ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca tgctgatccg cgattactag 120
cgattccgac ttcatgtagg cgagttgcag cctacaatcc gaactgagat tggttttaag 180
agattggcgt cctctcgcga ggtagcatcc cgttgtacca accattgtag cacgtgtgta 240
gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc gccttcctcc gtcttgtcga 300
cggcagtctc tctagagtgc ccaactgaat gctggcaact aaagataagg gttgcgctcg 360
ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg acaaccatgc accacctgtc 420
accgctgccc cgaagggaag ctctgtctcc agagcggtca gcgggatgtc aagacctggt 480
aaggttcttc gcgttgcttc gaattaaacc acatgctcca ccgcttgtgc ggacccccgt 540
caattccttt gagtttcact cttgcgagcg tactccccag gcggagtgct tattgcgtta 600
gctgcggcac tgagggtatt gaaaccccca acacctagca ctcatcgttt acggcgtgga 660
ctaccagggt atctaatcct gtttgctccc cacgctttcg cgcctcagcg tcagttacag 720
accagaaagc cgccttcgcc actggtgttc ctccacatct ctacgcattt caccgctaca 780
cgtggaatac cgctttcctc ttctgcactc aagctacaca gtttccgatg cgaaccgggg 840
ttgagccccg ggctttaaca ccagacttac atagccgcct gcgcgcgctt tacgcccaat 900
aaatccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct gctggcacgt agttagccgt 960
ggctttctcg tcaggtaccg tcaaggtacc gccctattcg aacggtacgt gttcgtccct 1020
gacaacagaa ctttacaatc cgaagacctt catcgttcac gcggcgttgc tccatcagac 1080
tttcgtccat tgtggaaaat tccctactgc tgcctcccgt aggagtctgg gccgtgtctc 1140
agtcccagtg tggccggtca ccctctcagg tcggctacgc atcgtcgcct tggtaggccg 1200
ttaccccacc aactagctaa tgcgccgcag gcccatctcc cagtgatagc gaaaagccat 1260
cttttctttt cagatcatgc gatccaaaaa cctatccggt attagcataa gtttccctat 1320
gttatcccag tctgagaggc aggttgccta cgtgttactc acccgtccgc cgctagcccc 1380
cgaagggact cgctcgactg c 1401
<210> 2
<211> 1468
<212> DNA
<213> 短短芽孢杆菌50-11(Brevibacillus brevis)
<400> 2
tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc gagcgagggt tttcggaccc 60
tagcggcgga cgggtgagta acacgtaggc aacctgcctc tcagaccggg ataacatagg 120
gaaacttatg ctaataccgg ataggttttt ggatcgcatg atctgaaaag gaaagatggc 180
gtttgctatc actgggagat gggcctgcgg cgcattagct agttggtggg gtaacggcct 240
accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgaccg gccacactgg gactgagaca 300
cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaattttc cacaatggac gaaagtctga 360
tggagcaacg ccgcgtgaac gatgaaggtc ttcggattgt aaagttctgt tgtcagggac 420
gaataagtac cgttcgaaca gggcggtacc ttgacggtac ctgacgagaa agccacggct 480
aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg 540
cgtaaagcgc gcgcaggcgg ctatgtaagt ctggtgttaa agcccggggc tcaaccccgg 600
ttcgcatcgg aaactgtgta gcttgagtgc agaagaggaa agcggtattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcggctttc tggtctgtaa 720
ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctag gtgttggggg tttcaatacc ctcagtgccg cagctaacgc 840
aataagcact ccgcctgggg agtacgctcg caagagtgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacatc ccgctgaccg ctctggagac agagcttccc ttcggggcag cggtgacagg 1020
tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080
caacccttat ctttagttgc cagcattcag ttgggcactc tagagagact gccgtcgaca 1140
agacggagga aggcggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200
cgtgctacaa tggttggtac aacgggatgc tacctcgcga gaggacgcca atctcttaaa 1260
accaatctca gttcggattg taggctgcaa ctcgcctaca tgaagtcgga atcgctagta 1320
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accacgggag tttgcaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc gcaaggagcc agccgccgaa 1440
ggtggggtag atgactgggg tgaagtcg 1468
<210> 3
<211> 593
<212> DNA
<213> 橙色嗜热子囊菌ZJ3(Thermoascus aurantiacus)
<400> 3
tccgtagggt ggacctgcgg aaggatcatt accgagtgcg ggtcctccgg ggcccaacct 60
ccccacccgt gtgtaccgta ccctgttgct tcggcgggcc cgccgcaagg ccgccggggg 120
gcgtgtcccg cccccgggcc cgcgcccgcc ggagaccctt cgaacgctga gcttttgaag 180
gcgtgccgtc tgagtcgcgt gagaaatcgt gaaaactttc aacaacggat ctcttggttc 240
cggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattccgtga 300
atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc ccctggcatt ccggggggca tgcctgtccg 360
agcgtcattg ctgccctcaa gcccggcttg tgtgttgggc cgccgtcccc gcccgccgcg 420
gggggacggg cccgaaaggc agcggcggcg ccgcgtccgg tcctcgagcg tatggggctt 480
cgtcacccgc tcttgcaggc ccggccggag cctcagcccg accccgcgtc aacatcttcc 540
aggttgacct cggatcaggt agggataccc gctgaactta agcatatcaa aaa 593
<210> 4
<211> 1407
<212> DNA
<213> 堆肥气杆菌GZY6-1(Aeribacillus composti strain)
<400> 4
tcggcggctg gctcccgtaa gggttcccca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa gacccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccggcttca tgcaggcgag ttgcagcctg caatccgaac tgagagtggt 180
tttttgggat tcgctccacc tcgcggtttc gctgcccttt gtaccaccca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccgact 300
tttagccggc agtcacctta gagtgcccaa ctgaatgctg gcaactaagg tcaagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcaccc tgtccccgaa aggggaacgc cctatctcta gggttgtcag gggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gtccccgtca attcctttga gtttcagcct tgcggccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgtttgc tgcagcacta aagggtggat accctctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt tcgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc 720
agttacaggc cagagagccg ccttcgccac tggtgttcct ccacatctct acgcatttca 780
ccgctacacg tggaattccg ctcccctctc ctgcactcaa gttccccagt ttccaatggc 840
cgctcgcggt tgagccgcga gatttcacat cagacttaag gaaccgcctg cgcgcgcttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gcttcctcgt caggtaccgt caaggtaccg ccctgttcga acggtacttg 1020
ttcttccctg acaacagagc tttacgatcc gaagaccttc ttcgctcacg cggcgttgct 1080
ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta ggagtctggg 1140
ccgtgtctca gtcccagtgt ggccggtcac cctctcaggt cggctacgca tcgtcgcctt 1200
ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcgccgcggg cccatcctgc agtgacagct 1260
aaaagccgcc tttcaaccga aaaccatgcg gttttcggtg ttatccggta ttagctccgg 1320
tttcccgaag ttatcccagt ctgcagggca ggttgcccac gtgttactca cccgtccgcc 1380
gctaacctaa aggagcaagc tcccttc 1407
<210> 5
<211> 1462
<212> DNA
<213> 甲基营养型芽孢杆菌H0(bacillus methylotrophicus)
<400> 5
tcattttgtc accttcggcg gctggctcct aaaaggttac ctcaccgact tcgggtgtta 60
caaactctcg tggtgtgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcggca 120
tgctgatccg cgattactag cgattccagc ttcacgcagt cgagttgcag actgcgatcc 180
gaactgagaa cagatttgtg ggattggctt aacctcgcgg tttcgctgcc ctttgttctg 240
tccattgtag cacgtgtgta gcccaggtca taaggggcat gatgatttga cgtcatcccc 300
accttcctcc ggtttgtcac cggcagtcac cttagagtgc ccaactgaat gctggcaact 360
aagatcaagg gttgcgctcg ttgcgggact taacccaaca tctcacgaca cgagctgacg 420
acaaccatgc accacctgtc actctgcccc cgaaggggac gtccttatct ctaggaattg 480
tcagagtgat gtcaagacct ggtaaggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa acccacatgc 540
tcccaccgct tgtgcgggcc cccgtcaatt cctttgagtt tcagtcttgc gaccgtactc 600
cccaggcgga gtgcttaatg cgttagctgc agcactaagg ggcggaaacc ccctaacact 660
tagcactcat cgtttacggc gtggactacc agggtatcta atcctgttcg ctccccacgc 720
tttcgctcct cagcgtcagt tacagaccag agagtcgcct tcgccactgg tgttcctcca 780
catctctacg catttcaccg ctacacgtgg aattccactc tcctcttctg cactcaagtt 840
ccccagtttc caatgaccct ccccggttga gccgggggct ttcacatcag acttaagaaa 900
ccgcctgcga gccctttacg cccaataatt ccggacaacg cttgccacct acgtattacc 960
gcggctgctg gcacgtartt agccgtggct ttctggttag gtaccgtcaa ggtgccgccc 1020
tatttgaacg gcacttgttc ttccctaaca acagagcttt acgatccgaa aaccttcatc 1080
actcacgcgg cgttgctccg tcagactttc gtccattgcg gaagattccc tactgctgcc 1140
tcccgtagga gtctgggccg tgtctcagtc ccagtgtggc cgatcaccct ctcaggtcgg 1200
ctacgcatcg tcgccttggt gagccgttac ctcaccaact agctaatgcg ccgcgggtcc 1260
atctgtaagt ggtagccgaa gccacctttt atgtctgaac catgcggttc aaacaaccat 1320
ccggtattag ccccggtttc ccggagttat cccagtctta caggcaggtt acccacgtgt 1380
tactcacccg tccgccgcta acatcaggga gcaagctccc atctgtccgc tcgacttgca 1440
tgtatagcac ccgccatttc cc 1462
<210> 6
<211> 949
<212> DNA
<213> 地尿素芽孢杆菌SD2-2(Ureibacillus terrenus)
<400> 6
gggacgggtg ctataatgca agtcgagcgg acctcatagg aagcttgctt tttatgaggt 60
tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt aacctgccct atagaccggg ataactcgcg 120
gaaacgcgtg ctaataccgg ataacacagc ggagcgcatg ctccggtgtt gaaaggtggt 180
tctgctaccg ctataggatg ggcccgcggc gcattagcta gttggtgggg taacggccta 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatgggcg aaagcctgat 360
ggagcaacgc cgcgtgagcg aagaaggtct tcggatcgta aagctctgtt gtaagggaag 420
aacaagtgcg gtagtaactg accgcaccct gacggtacct tacgagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcgagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagcgcgc gcaggcggtc tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600
ggtcattgga aactgggaga cttgagtgca ggagagggaa gcggaattcc atgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatatg gaggaacacc agtggcgaag gcggcttcct ggcctgtaac 720
tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctagg tgttaggggg cttgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacc 949
<210> 7
<211> 1290
<212> DNA
<213> 鞘鞍醇杆菌DS-4(sphingobacterium sp.)
<400> 7
cggcggacgg gtgagtaacg cgtgggaata tgccctttgg tacggaatag tcctgggaaa 60
ctgggggtaa taccgtatgc gcccttcggg ggaaagattt atcgccaaag gattagcccg 120
cgttggatta ggtagttggt ggggtaatgg cctaccaagc cgacgatcca tagctggttt 180
gagaggatga tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca 240
gtggggaatc ttagacaatg ggggcaaccc tgatctagcc atgccgcgtg agtgatgaag 300
gccctagggt tgtaaagctc tttcagctgg gaagataatg acggtaccag cagaagaagc 360
cccggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gggctagcgt tgttcggaat 420
tactgggcgt aaagcgcacg taggcggacc ggaaagttgg gggtgaaatc ccggggctca 480
accccggaac tgccttcaaa actatcggtc tggagttcga gagaggtgag tggaattccg 540
agtgtagagg tgaaattcgt agatattcgg aggaacacca gtggcgaagg cggctcactg 600
gctcgatact gacgctgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt 660
agtccacgcc gtaaacgatg aatgccagtc gtcgggcagc atgctgttcg gtgacacacc 720
taacggatta agcattccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg 780
acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt 840
accaaccctt gacatcccag gaccggcccg gagacgggtc tttcacttcg gtgacctgga 900
gacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttcggtta agtccggcaa 960
cgagcgcaac ccacactctt agttgccagc atttggttgg gcactctaag agaactgccg 1020
atgataagtc ggaggaaggt gtggatgacg tcaagtcctc atggccctta cgggttgggc 1080
tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg ggttaatccc caaaagccat ctcagttcgg 1140
attggggtct gcaactcgac cccatgaagt tggaatcgct agtaatcgcg gaacagcatg 1200
ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttgggt 1260
ctacccgacg gccgtgcgct aaccagcaat 1290
