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一种根瘤菌菌株ZT-vig2及其应用

2021-03-14 15:59:34

一种根瘤菌菌株ZT-vig2及其应用

　　技术领域

　　本发明属于农业微生物领域，涉及一种具有防治草莓病害功能的豆科绿肥“苏绿4号”绿豆及共生根瘤菌ZT-vig2在草莓大棚土壤中的应用。

　　背景技术

　　现代的农业生产对于化肥的多功能性和高效率性有极大的要求。随着科学技术的不断发展，化肥使用量的逐年增加，农耕土壤受到的影响也越来越大。化肥的使用量每年持续增加，随之而来的是化肥利用率和肥效越来越低，农作物增产效率逐年降低，化肥使用量逐年增加，土壤肥力也随之下降，土壤荒漠化越来越严重；农药使用量也在逐年上升，引起了环境的污染以及农产品中农药残留的超标；农耕土壤生态环境恶化，生态功能下降。

　　虽然传统化肥可快速提高农作物产量，但是如果长期大面积、大量的使用，不仅对农作物产量提高的效率会大大下降，而且会对环境造成严重污染。微生物肥料相对于传统化肥所体现的优势正是在于对农作物产量提高的持续性，以及它对于环境的友好性。如果用微生物有机肥部分替代传统化学肥料，则能在一定程度上，起到增加土壤中有效养分含量，提高肥料利用率的作用。将微生物肥料、有机肥、传统无机化肥三元结合，能够最大程度的开发和利用土壤中蕴藏的养分资源，提高农作物产量，并在一定程度上提升农作物品质。所以对于微生物有机肥的研究、开发和应用，具有很大的研究价值和市场前景，对于农业的可持续发展也具有特别重要的意义。它在环境净化与生态系统的平衡，营养元素的转化，土壤肥力的提高与保持和提高化肥利用率，促进农作物生长，拮抗土壤病原菌等方面都起着重要的作用。我们应当充分利用和发挥微生物肥料的以上诸多功能和优点，从而为现代农业的生产和农业可持续发展服务。随着生活品质的提高，现代人类的饮食结构已经同以前大不一样，对粮食的摄入在逐年下降，取而代之的是高品质的水果、蔬菜。所以在一定程度上，肥料市场对于微生物肥料的需求促进和推动了它的发展。目前中国的国家生态示范区，绿色和有机农产品基地等都在大规模使用微生物有机肥料，微生物肥料近年来的市场占有比重也在逐年增加，慢慢的在农业生产中转变为主力军，带来越来越明显的生态、社会和经济效益。

　　草莓是一种很受大众欢迎的水果，随着受欢迎度越高，近年来草莓种植也在不断发展，与此同时，草莓病害也掺杂其中，影响着草莓生产，威胁着食用者的健康。目前，在草莓种植过程中常见的病害有炭疽病、灰霉病、叶斑病、根腐病、黄萎病，此类病害的传播速度快，发病危害性大，可能造成果实腐烂、作物减产等后果。我国草莓病害研究正在不断进展，主要研究方向是草莓病害的症状、特点、病原与解决措施等。草莓病害对草莓种植的产销量和产品质量都有影响，对于草莓病害的防治一直是广大学者研究的课题。就目前研究成果来看，生物防治危害小，且清洁无污染，具有广阔的市场前景。尽管对草莓各种病害的生物防治研究有很多报道，但生物防治还是缺乏经验和技术，在实际生产操作中很难推广应用，因此，目前的草莓病害研究与防治仍然主要采用化学防治，化学防治容易造成二次污染，对人体与环境均有危害。

　　发明内容

　　本发明的目的在于提供一株根瘤菌ZT-vig2，该菌株能够在绿豆根部结瘤固氮，使其与绿豆作为豆科绿肥作物，通过与在大棚中的草莓轮作，形成根瘤菌-豆科作物-非豆科作物体系，减少草莓病害的发生，并提高草莓质量与产量。

　　本发明的目的可通过如下技术方案实现：

　　本发明提供一种根瘤菌菌株ZT-vig2，于2017年6月由分离人曹亚君在浙江石濑村豇豆植株中分离，经细菌16srDNA部分序列鉴定该菌株属于慢生根瘤菌属慢生根瘤菌(Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp)，其性质为抑制草莓炭疽病的固氮菌，于2020年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCCNO.19883。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

　　本发明所述菌株ZT-vig2的菌落为圆形，半透明，粘稠，革兰氏染色阴性；利用碳源较为广泛，能利用硝态氮、氨态氮和有机氮为氮源生长；在甘露醇或其它碳水化合物培养基上生长产酸，产生大量胞外多糖粘液。

　　本发明还提供包含本发明所述的菌株ZT-vig2的发酵液。

　　本发明还提供一种组合物，所述组合物包括本发明所述的菌株ZT-vig2的发酵液。

　　在一些实施例中，本发明所述的组合物是以液体或者粉末的形式存在。

　　本发明还提供一种豆科绿肥，为本发明所述的菌株ZT-vig2或包括本发明所述的菌株ZT-vig2的发酵液的组合物接种于豆科植物根部。

　　在一些实施例中，接种豆科根部的活菌接种量为1×1010～1×1015CFU/亩，优选的，接种量为1×1011～1×1012CFU/亩。在一些实施例中，用于接种的发酵液浓度可以为1×107～1×1010CFU/ml。

　　本发明还提供了菌株ZT-vig2、发酵液、组合物或豆科绿肥在豆科植物结瘤固氮中的应用。

　　本发明还提供了菌株ZT-vig2、发酵液、组合物或豆科绿肥在防治草莓病害功能的应用。

　　本发明还提供了菌株ZT-vig2作为接种该菌株的豆科绿肥在草莓病害防治中的应用。

　　在本发明的一些实施例中，草莓病害防治具体为接种本发明所述的菌株ZT-vig2的豆科植物与草莓进行轮作。

　　在一些实施例中，本发明所述的豆科为绿豆。

　　在一些实施例中，本发明所述的草莓病害包括但不限于炭疽病、灰霉病、叶斑病、根腐病、黄萎病。

　　本发明的有益效果：

　　1、本发明提供的接种ZT-vig2的“苏绿4号”绿豆通过与草莓轮作，可富集土壤中的养分，改善土壤的理化性质，缓解土壤的酸化现象，增加土壤氮含量与有机质含量，抑制土壤内病原微生物的增殖，从而减少草莓植株的病害发生。

　　2、本发明提供的接种ZT-vig2的“苏绿4号”豆科绿肥与草莓轮作，可增加土壤肥力，增加植物根部的固氮能力，促进草莓发芽与生根，促进草莓生长，又可以减少传统化学肥料对土壤性质的破坏，减肥减药从而减少农业污染，有利于实现农业可持续发展，提高作物产量与质量。

　　本专利主要采用生物防治的方法，减弱或抑制草莓炭疽病病害的发生。而生物防治的方法主要是通过接种根瘤菌的豆科绿肥与草莓轮作，豆科绿肥在开花期进行翻压腐熟，腐熟过程中高温的产生会使土壤中病原菌的减少，在轮作草莓后降低草莓的病害。综上，使用豆科绿肥替代化肥的应用过程中，能够有效改善土壤结构，优化调整内部的元素成分，提升农业生产环境质量，减少农作物的病害程度，保证农作物的较高产量，实现经济效益和生态效益的统一，促进我国农业生产和环境保护的协调发展。

　　附图说明

　　图1本发明提供的根瘤菌ZT-vig2的菌落形态；

　　图2本发明提供的根瘤菌ZT-vig2的固氮酶活；

　　图3菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与水旱轮作的处理腐熟后土壤全氮含量和有机质含量的比较；

　　图4菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与水旱轮作的处理腐熟后土壤PH的比较；

　　图5菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与水旱轮作的处理腐熟后对草莓株高的比较；

　　图6菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与水旱轮作的处理腐熟后对草莓叶面积的比较；

　　图7菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与水旱轮作的处理腐熟后对于草莓病发率比较；

　　图8绿豆接根瘤菌ZT-vig2与草莓轮作、水稻与草莓轮作示意图。

　　具体实施方式

　　下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。

　　实施例1绿豆根瘤菌的分离筛选

　　通过将从土壤中分离的多种根瘤菌在实验室条件下接种到绿豆根部，以明确与“苏绿4号”绿豆匹配性最佳的根瘤菌，最终发现只有接种USDA-110，ZT-vig3以及ZT-vig2的处理组结瘤，对这三组处理的植株进行结瘤数及固氮酶活的测定，发现三组处理组结瘤数及固氮酶活较高的菌株ZT-vig2(图2)固氮酶活可达到1214.45(C2H4μmol·min-1·g-1)。该菌株菌落为圆形，半透明，粘稠，革兰氏染色阴性(图1)；利用碳源较为广泛，能利用硝态氮、氨态氮和有机氮为氮源生长；在甘露醇或其它碳水化合物培养基上生长产酸，产生大量胞外多糖粘液。经细菌16srDNA部分序列(SEQ ID NO.1)鉴定该菌株属于慢生根瘤菌属慢生根瘤菌(Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp)，其性质为抑制草莓炭疽病的固氮菌，于2020年5月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号CGMCCNO.19883。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。以下实施例选择ZT-vig2作为匹配根瘤菌。

　　实施例2 ZT-vig2作用研究

　　本研究采用以下5种指标作为豆科绿肥的评价标准，即土壤pH、土壤全氮、土壤全碳、土壤有机质、病情指数。

　　①土壤pH：可缓解土壤酸化的现象。

　　②土壤全氮：种植此豆科绿肥可帮助更好进行固氮，增加土壤含氮量。

　　③土壤全碳：能够调整土壤中碳氮比。

　　④土壤有机质：能增加土壤有机质含量。

　　⑤病情指数：可减少草莓植株病害，提高产品质量。

　　1.菌株ZT-vig2菌液的制备

　　从ZT-vig2的平板上挑取单菌落到3ml的TY培养基(TY液体培养基：胰蛋白胨(bacto-tryptone)16g，酵母提取物(bacto-yeast extract)10g，NaCl 5g)中，试管放入28℃，180r/min的摇床中培养4天，使其菌液达到109CFU/ml。然后以1％的接种量转接到500ml的TY液体培养基中，28℃，180r/min的摇床中培养4天，使其菌液达到109CFU/ml，待用。

　　2.处理组设置

　　分为三个处理组：绿豆与草莓的轮作是指在同一块土壤中，种植一轮绿豆后在绿豆开花进行翻压腐熟一个月后进行草莓的种植。a.绿豆未接根瘤菌ZT-vig2与草莓轮作b.绿豆接根瘤菌ZT-vig2与草莓轮作c.水稻与草莓轮作。绿豆种子播种量为1.5kg/亩，根瘤菌接菌量为500ml/亩，如图8所示。

　　3.采集土样并测定相应指标

　　在播种前、初花期、和翻下腐熟后三个时期分别采集种植绿豆的土样，分别测土壤pH，土壤全氮，土壤全碳，土壤有机质。

　　(1)风干过筛土样

　　将取回的土样放在通风、干燥和无阳光直射的地方，或摊放在油布、牛皮纸、塑料布上，尽可能铺平并把大土块捏碎，以便风干快些。去杂、磨细和过筛，将风干后土样先用台称称出总重量，然后将土样倒在橡皮垫上，碾碎土块，并尽可能挑出样品中的石砾、新生体、侵入体、植物根等杂质，分别放入表面皿或其它容器中；将土样铺平，用木棒轻轻辗压，将辗碎的土壤用带有筛底和筛盖的100目筛孔的土筛过筛，并盖好盖、防止细土飞扬。不能筛过的部分，再行去杂，余下的土壤铺开再次碾压过筛，直至所有的土壤全部过筛，只剩下石砾为止。

　　(2)土壤pH测定

　　将过筛土壤取2g于10ml离心管中，加水至10ml刻度线并搅拌均匀，使土粒充分分散，先用pH标准缓冲液校准pH计，再使用pH计测定土壤悬浊液的pH。

　　(3)土壤全氮测定

　　准备试剂：

　　①混合催化剂：称取硫酸钾100g、五水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细。贮于瓶中。

　　②比重1.84浓硫酸。

　　③40％氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶解。

　　④2％硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入2.5ml混合指示剂。(按体积比100:0.25加入混合指示剂)

　　⑤混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95％的乙醇中,用稀氢氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。

　　⑥0.01N的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至1000ml，用基准物质标定。

　　消煮：在分析天平上准确称取过筛的风干土0.5000g左右，移入干燥的消化管中，加入1.5g的还原性混合催化剂。用移液枪加入5ml浓硫酸，放到通风柜内的消煮器上消煮1.5h左右。直至内容物呈清彻的淡蓝色为止。

　　蒸馏：消煮完毕后冷却。

　　将三角瓶置于冷凝管的承接管下，管口淹没在硼酸溶液中(三角瓶用2％的硼酸20ml作吸收剂)，然后打开冷凝器中的水流，进行蒸馏。在整个蒸馏过程中注意冷凝管中水不要中断，当接受液变篮后蒸馏5min,将冷凝管下端离开硼酸液面，再用蒸馏水冲净管外。

　　滴定：用0.001当量的盐酸标准溶液滴定至红色为止。记录所消耗的盐酸标准溶液的体积。

　　土壤含氮量(％)＝(V-V0)*N*0.014*100/W

　　V-滴定试样时消耗的盐酸标准溶液体积，ml。

　　V0-滴定空白时消耗的盐酸标准溶液体积，ml。

　　N-盐酸标准溶液的当量浓度。

　　W-土壤样品重，g。

　　0.014-氮的毫克当量。

　　(4)土壤有机质及全碳测定

　　准备试剂：

　　①0.1333mol/L重铬酸钾标准溶液：称取经过130℃烘烧3～4h的分析纯重铬酸钾39.216g,溶解于400ml蒸馏水中，必要时可加热溶解，冷却后架蒸馏水定容到1000ml，摇匀备用。

　　②0.2mol/L硫酸亚铁：称取化学纯硫酸亚铁55.60g或硫酸亚铁铵78.43g，溶于蒸馏水中，加6mol/L H2SO41.5ml，再加蒸馏水定容到1000ml备用。

　　③硫酸亚铁溶液的标定：准确吸取3份0.1333mol/L K2Cr2O7标准溶液各5.0ml于250ml三角瓶中，各加5ml6mol/L H2SO4和15ml蒸馏水，再加入邻啡罗啉指示剂3～5滴，摇匀，然后用0.2mol/LFeSO4溶液滴定至棕红色为止。

　　④邻啡罗啉指示剂：称取化学纯硫酸亚铁0.659g和分析纯邻啡罗啉1.485g溶于100ml蒸馏水中，贮于滴瓶中备用。

　　准确称取通过100目筛的风干土样0.1000～0.5000g(程量多少依有机含量而定)，放入干燥硬质试管中，用移液管准确加入0.1333mol/L重铬酸钾溶液5.00ml，再用量筒加入浓硫酸5ml，小心摇动。将试管插入铁丝笼内，放入预先加热至185～190℃间的油浴锅中，此时温度控制在170～180℃之间，自试管内大量出现气泡时开始计时，保持溶液沸腾5min，取出铁丝笼，代试管稍冷却后，用草纸擦拭干净使馆外部油液，放凉。经冷却后，将试管内容物洗入250ml的三角瓶中，使溶液的总体积达60～80ml,酸度为2～3mol/L，加入邻啡罗啉指示剂3～5滴摇匀。用标准的硫酸亚铁溶液滴定，溶液颜色由橙色(或黄绿色)经绿色、灰绿色变到棕红色即为终点。

　　土壤全碳可通过以下公式换算。

　　式中：c——表示硫酸亚铁消耗摩尔浓度(mol/L)；

　　V0——空白试验消耗得硫酸亚铁溶液的体积(ml)；

　　V——滴定待测土样消耗的硫酸亚铁的体积(ml)；

　　0.003——1/4mmol碳的克数；

　　10172——由土壤有机碳换算成有机质的换算系数；

　　1.1——校正系数(用此法氧化率为90％)。

　　4.草莓株高和叶面积测定

　　株高：株高是指植株根颈部到顶部之间的距离，其中顶部是指主茎顶部，测量可将尺子挨着地面量到苗顶最高位置，读数即为株高。

　　叶面积：叶长×叶宽系数法:叶面积＝叶长×叶宽×I叶面积为取心叶向外第3片展平的功能叶，用游标卡尺测量3片复叶中央小叶，以长×宽×0.73进行计算得出。

　　5.病害监测

　　草莓病害有多种病症，常见的有炭疽病、灰霉病、叶斑病、根腐病、黄萎病。而接种ZT-vig2的绿豆翻压腐熟后对草莓炭疽病有一定的防治作用。因此，在病害监测阶段主要对草莓炭疽病进行病害监测。于病害高发期,在大棚内进行病害调查,对草莓大棚采用棋盘式5点取样法,每点调查10株。每2周调查1次,共调查4次。对草莓病害种类和发生情况进行调查,记载各种病害发病率和严重度。

　　枝叶病害以株为单位,对所发生病害进行调查。

　　0级：无病；

　　1级：有病面积占该取样点整个面积的比例≤5％；

　　2级：有病面积占该取样点整个面积的比例6％～10％；

　　3级：有病面积占该取样点整个面积的比例11％～25％；

　　4级：有病面积占该取样点整个面积的比例26％～50％；

　　5级：有病面积占该取样点整个面积的比例＞50％。

　　6.实验结果

　　菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与未接种ZT-vig2和水旱轮作的处理腐熟后土壤全氮含量和有机质含量的比较如图3所示，结果表明：接种ZT-vig2的处理组比不接种ZT-vig2的处理组土壤全氮含量提高了7.3％，有机质含量提高了6％，接种ZT-vig2的处理组比水旱轮作的处理组土壤全氮含量提高了10％，有机质含量提高了10％。接种该菌株的豆科绿肥翻压腐熟后，能够提高土壤中的有机质和全氮含量。

　　菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与未接种ZT-vig2和水旱轮作的处理腐熟后土壤PH的比较如图4所示，结果表明：接种ZT-vig2的处理组的pH与初始相比，提高了0.9，未接种ZT-vig2处理组与pH与初始相比，提高了0.5，水旱轮作处理组的pH与初始相比，提高了0.2，充分说明接种ZT-vig2更有利于调节土壤中的pH。

　　菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与未接种ZT-vig2和水旱轮作的处理腐熟后对草莓株高的比较如图5所示，结果表明：接种ZT-vig2的处理组与未接种ZT-vig2的处理组相比，可使草莓在生长期的株高增加7.3％，结果期的株高增加13.3％.与水稻轮作的相比，可使草莓在生长期的株高增加21.8％，结果期的株高增加15.7％。

　　菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥与未接种ZT-vig2和水旱轮作的处理腐熟后对草莓叶面积的比较如图6所示，结果表明：接种ZT-vig2的处理组与未接种ZT-vig2的处理组相比，可使草莓在生长期的叶面积增加11.3％，结果期的叶面积增加11％。与水稻轮作的相比，可使草莓在生长期的叶面积增加27.7％，结果期的叶面积增加5％。

　　菌株ZT-vig2参与的豆科绿肥未接种ZT-vig2和与水旱轮作的处理腐熟后对于草莓病发率比较如图7所示，结果表明：接种ZT-vig2的处理组与未接种ZT-vig2的处理组相比，可使草莓的发病率在生长期降低54％，在结果期的降低27％。与水稻轮作的相比，发病率在草莓生长期降低64.3％，在结果期降低32％。

　　综上可见，接种该菌株的绿豆与草莓轮作后，能提高草莓的株高，增大草莓叶面积，降低草莓的病发率。

　　序列表

　　<110> 江苏丘陵地区南京农业科学研究所

　　南京农业大学

　　<120> 一种根瘤菌菌株ZT-vig2及其应用

　　<160> 1

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1264

　　<212> DNA

　　<213> 慢生根瘤菌(Bradyrhizobium Bradyrhizobium sp)

　　<400> 1