一种棘豆蠕孢菌、及其分离方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种棘豆蠕孢菌、及其分离方法和应用。
背景技术
不损害环境质量的可持续性的农业是当今世界要解决的主要问题。过量使用肥料和杀虫剂等农业化学物质对环境造成了严重的危害。应用生物技术能逐渐减少化学物质的使用并不影响农作物的产量和质量成为可能。在过去几十年，生物技术的使用对以可持续的方式增加农业的产量开创了新的局面。
有研究表明从植物中部分分离到的微生物具有很好的应用价值。例如，用作生物肥料，这些微生物对不同的农作物有不同的影响，不同植物组织地方的微生物对植物影响也不同，不同的季节的微生物对植物也有不同影响，主要依赖种子、根和土壤中的微生物。内生真菌可与宿主植物形成互惠共生关系，一方面内生真菌从宿主植物中获取自身生长所需的养分，另一方面内生真菌可促进植物的生长发育，增强宿主植物的抗生物和非生物胁迫的能力，两者之间存在物质与能量的循环交流。内生真菌对宿主植物的作用有很多方面，主要包括促生、抗病性、抗虫性、抗逆性等。
但目前没有任何黄花棘豆蠕孢菌对植株促生长的科学报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种棘豆蠕孢菌、及其分离方法和应用，该丝状真菌分类命名为波浪芽管孢(Undifilum sp)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年1月7日，保藏编号：CGMCC NO.16997。将CGMCC NO.16997菌片与模式植物拟南芥和烟草植株在培养基共培养，最高可使模式植物拟南芥与烟草的平均单株鲜重增加51.75％与 75.35％，平均单株干重增加24.88％与36.60％，可应用于植物促生剂或生物肥料的制备。
为实现上述任务，本发明采取如下技术解决方案：
一种棘豆蠕孢菌，棘豆蠕孢菌的保藏编号为CGMCC NO.16997，拉丁文为Undifilumsp。
具体的，棘豆蠕孢菌的ITS序列为SEQ ID NO:1。
一种棘豆蠕孢菌的分离方法，棘豆蠕孢菌为上述的棘豆蠕孢菌，棘豆蠕孢菌是从黄花棘豆种子中分离出的内生真菌。
具体的，棘豆蠕孢菌为将灭菌的黄花棘豆种子放入培养基，所述的培养基是PDA培养基，在PDA培养基中加入200μg/mL氯霉素，并在22℃的条件下培养五天得到白色菌丝，再将白色菌丝接种新鲜的PDA培养基纯化培养即得。
上述棘豆蠕孢菌用于制备促进植物生长生物肥料/植物促生剂中的应用。
具体的，植物包括南芥或烟草。
由于采用上述技术方案，具有以下有益效果：
(1)本发明棘豆蠕孢菌是从黄花棘豆种子中分离出的棘豆蠕孢菌，该棘豆蠕孢菌的分类命名为波浪芽管孢，拉丁文为Undifilumsp，保藏编号为 CGMCC NO.16997，通过在模式植物拟南芥/烟草栽培过程中加入CGMCC NO. 16997的菌片，可显著增加拟南芥与烟草的生物量；
(2)本发明的棘豆蠕孢菌，通过模式植物拟南芥/烟草与棘豆蠕孢菌 CGMCCNO.16997共培养15天后，可使模式植物拟南芥与烟草的平均单株鲜重增加51.75％与75.35％，平均单株干重增加24.88％与36.6％，可应用于植物促生剂或生物肥料的制备。
(3)本发明棘豆蠕孢菌的分离方法简单实用，制备得到的棘豆蠕孢菌可显著增加拟南芥与烟草的生物量。
附图说明
图1黄花棘豆U.oxytropis内生真菌15天的菌落形态
图2黄花棘豆U.oxytropis内生真菌菌丝体结构(40×)
图3棘豆蠕孢菌与拟南芥幼苗共培养；其中A为CK对照组，B为加入直径6mm菌片的效果；
图4棘豆蠕孢菌与烟草幼苗共培养；其中C为CK对照组，D为加入直径6mm菌片的效果。
具体实施方式
目前报道最多为根际内生真菌侵染宿主后，与宿主稳定的长期相互作用即形成内生菌根。内生菌根能与80％的陆生植物形成共生关系，这种共生关系有利于提高植物抗御不良环境的能力，促进植物生长。目前大量研究表明内生菌根能促进植物吸收土壤中的无机盐等养分，诱导产生植物激素，例如细胞分裂素和赤霉酸，促进植物生长，分泌生物碱、萜类、类黄酮和类固醇等抗菌活性物质，帮助植物防御病原体，提高植物的抗病性等。
本发明从黄花棘豆种子中分离出棘豆蠕孢菌的内生真菌，即为波浪芽管孢(Undifilum sp)，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2019年1月7日，保藏编号：CGMCCNO.16997，并将CGMCC NO. 16997在模式植物拟南芥与烟草植株培养基过程中添加菌片，可使模式植物拟南芥与烟草的平均单株鲜重增加51.75％与75.35％，平均单株干重增加干重增加24.88％与36.6％，可应用于植物促生剂或生物肥料的制备。
本发明的黄花棘豆种子采自宁夏海原县。
CGMCC NO.16997的分离方法：
从阴干的黄花棘豆(采集宁夏.海源)种子中随机选取无病斑颗粒饱满种子，用自来水冲洗，转移至超净台上用75％的乙醇浸泡2min，浸泡期间不停摇动，无菌水冲洗2次，每次2min，再用2％次氯酸钠的处理5min，无菌水冲洗3～4次后，用无菌滤纸吸干，最后用灭菌的刀片从种子中间切开接种于PDA固体培养基上，用parafilm膜封口，22℃培养箱暗培养，培养 4天后观察。同时，将最后一次冲洗的无菌水涂布于PDA培养基上，用 parafilm膜封口，室温培养7天，如没有菌落产生证明表面消毒彻底。观察分离PDA培养基种子周围长出的真菌，及时挑取单一菌种菌丝转移到新的PDA培养基以防被后面分离到的真菌覆盖。
经过上述分离程序得到的内生真菌分别用接种针挑取单一菌丝转移到新的含氯霉素的PDA培养基上，置于22℃恒温培养箱。观察菌落生长特征，分别为分离的到的内生真菌编号命名、拍照记录菌落形态。
CGMCC NO.16997的鉴定方法：
通过分子生物学方法对CGMCC NO.16997进行鉴别，提取棘豆蠕孢菌 (Undifilumoxytropis)的DNA作模板，以ITS-1-s/ITS-4-as为引物：扩增真菌ITS片段，产物为583bp；经NCBI同源性比对，与Undifilum sp. 近缘性≥99％。该菌ITS序列如下(5′→3′)为SEQ IDNO:1。
CGMCC NO.16997的生长特征：
黄花棘豆U.oxytropis在PDA培养基上的菌落形态见图1。菌丝体生长初期，菌落呈白色，随着培养时间的延长，菌落底部开始分泌黑色色素物质，由最初的白色转为灰色甚至变成黑色，继续延长培养时间，整个菌落变成黑色。菌丝体生长致密；菌落隆起，边缘整齐，呈辐射状生长；随着培养时间的延长，菌落逐渐变大。
菌丝体显微结构见图2。菌丝具有横向隔膜，随着培养时间的延长，逐渐变长。
以下结合实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的内容并不局限于此。
以下各实施例中的菌片是本发明公开的从黄花棘豆种子中分离出的内生真菌片。
实施例1：
将灭菌后的拟南芥种子均匀点播于含2.0％蔗糖和0.65％的1/2MS固体培养基上，待幼苗长出4片真叶(约7天)后，小心用灭菌镊子平铺在垂直培养基中，加入直径6mm菌片，共培养15天后，测量苗鲜重及生理特征，实验结果表明该菌株对拟南芥具有明显的促生主要，平均单株鲜重增加 51.75％，平均单株干重增加24.88％(图3)。
实施例2：
与实施例1不同的是将灭菌拟南芥种子(Col-0)平铺在1/2MS培养基。待幼苗长出真叶(约7天)，小心用灭菌镊子平铺在垂直培养基中，加入直径4mm菌片，共培养15天后，测量苗鲜重及生理特征，实验结果表明该菌株对拟南芥具有明显的促生主要，平均单株鲜重增加46.38％，平均单株干重增加13.78％。
实施例3：
与实施例2不同的是将灭菌拟南芥种子(Col-0)平铺在1/2MS培养基。待幼苗长出真叶(约7天)，小心用灭菌镊子平铺在垂直培养基中，加入直径8mm菌片，共培养15天后，测量苗鲜重及生理特征，实验结果表明该菌株对拟南芥具有明显的促生主要，平均单株鲜重增加49.78％，平均单株干重增加15.68％。
实施例4：
与实施例2不同的是将灭菌拟南芥种子(Col-0)平铺在1/2MS培养基。待幼苗长出真叶(约7天)，小心用灭菌镊子平铺在垂直培养基中，加入直径10mm菌片，共培养15天后，测量苗鲜重及生理特征，实验结果表明该菌株对拟南芥具有明显的促生主要，平均单株鲜重增加42.53％，平均单株干重增加11.97％.
实施例5：
将灭菌烟草种子平铺在1/2MS培养基。待幼苗长出真叶(约8天)，小心用灭菌镊子平铺在垂直培养基中，加入直径6mm菌片，共培养15天后，测量苗鲜重及生理特征，实验结果表明该菌株对拟南芥具有明显的促生主要，平均单株鲜重增加75.35％，平均单株干重增加36.6％(图4)。
PDA配方：新鲜土豆200g，切成小细丝熬制土豆汁，葡萄糖20g，琼脂 15g，pH6.8-7.0.
实施例6：
本实施例与实施例5不同的是，将灭菌烟草种子平铺在1/2MS培养基。待幼苗长出真叶(约8天)，小心用灭菌镊子平铺在垂直培养基中，加入直径4mm菌片，共培养15天后，测量苗鲜重及生理特征，实验结果表明该菌株对拟南芥具有明显的促生主要，平均单株鲜重增加65.75％，平均单株干重增加33.28％。
实施例7：
本实施例与实施例5不同的是，将灭菌烟草种子平铺在1/2MS培养基。待幼苗长出真叶(约8天)，小心用灭菌镊子平铺在垂直培养基中，加入直径8mm菌片，共培养15天后，测量苗鲜重及生理特征，实验结果表明该菌株对拟南芥具有明显的促生主要，平均单株鲜重增加69.88％，平均单株干重增加34.54％。
实施例8：
本实施例与实施例5不同的是，将灭菌烟草种子平铺在1/2MS培养基。待幼苗长出真叶(约8天)，小心用灭菌镊子平铺在垂直培养基中，加入直径10mm菌片，共培养15天后，测量苗鲜重及生理特征，实验结果表明该菌株对拟南芥具有明显的促生主要，平均单株鲜重增加60.88％，平均单株干重增加28.68％。
