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一种耐盐辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法

2021-03-15 08:41:53

一种耐盐辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法

　　技术领域

　　本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种耐盐辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法。

　　背景技术

　　餐厨垃圾的传统处理方式一般采用堆肥、填埋、焚烧、固体饲料、粉碎直排等方式，这些处理方式都会对资源、环境造成不同程度的恶劣影响。像堆肥，会占有大量的土地面积，处理周期也较长，并且在堆肥过程中产生的污水、臭水会对周边的环境造成污染，还有长期堆肥会造成土壤的盐碱化；粉碎直排，会污染地下水，造成河水发臭，滋生出细菌、病菌，会造成疾病传播，而且一些油垢会造成管道堵塞，影响人们的正常生活。

　　好氧降解是在有氧的条件下，利用好氧微生物(主要是好氧细菌)将餐厨垃圾中大分子的有机物分解为小分子物质。在降解过程中，餐厨垃圾中的可溶性有机质透过微生物的细胞壁和细胞膜为微生物所吸收；固体的和胶体的有机物先附着在微生物体外，由生物所分泌的胞外酶分解为可溶性物质，再渗入细胞。微生物通过自身的生命活动——氧化还原和生物合成过程，把一部分被吸收的有机物氧化成简单的无机物，并放出生物生长活动所需要的能量，把另一部分有机物转化合成新的细胞物质，使微生物生长繁殖，产生更多的生物体继续产生一系列的生化作用。

　　辣椒是一种广泛使用的调味剂，其中辣椒素作为其主要活性成分可用做食品添加剂、药品等。辣椒中含有较多的辣椒素类物质，估计有80％～95％的天然辣椒素存在于辣椒中。它们包含4种主要的类似物：辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高二氢辣椒素，其中辣椒素和二氢辣椒素在辣椒素类物质中含量超过91％。

　　研究表明，辣椒素具有较强的抗菌能力，国内外对辣椒素作为抑菌剂的抑菌种类和抑菌效果进行了广泛的研究；结果表明，辣椒素对大多的微生物都具有抑制作用，如：大肠杆菌、枯草杆菌、葡萄球菌、酵母等，但对霉菌基本没有效果；最低抑菌浓度MIC为30～150μg/L。

　　辣椒素的酶水解物也引起了人们的极大兴趣，因为它可用于辣椒的还原辛辣或天然风味的生产。辣椒素水解物由香草胺和辣椒酸(8-甲基-6-反式壬烯酸)组成。这些酰胺的脱酰化反应提供了香草胺(4-羟基-3-甲氧基苄胺)，可进一步酶法转化为使用特定微生物或植物氧化酶的香草醛。这两步酶将天然辣椒素转化为香兰素是有吸引力的，因为所获得的产品可归类为天然风味。事实上，美国和欧洲的立法规定，“天然”味物质只能通过从自然来源或酶或微生物过程中提取，这些过程涉及从自然中分离出来的前体。

　　辣椒作为调味料在我国四川和湖南地区使用较为广泛，尤其是四川火锅中的使用量很大。这也导致了火锅类餐厨垃圾的生物降解造成了影响，因为生物降解的原理就是使用了大量的微生物分解餐厨垃圾，但是辣椒素能够抑制微生物的生长。

　　新鲜的餐厨垃圾含盐量都很高，当水分减少后含盐量还会增加，高盐条件下回抑制大部分的微生物生长，所以餐厨垃圾降解菌应该需要具有耐盐特性。

　　所以寻找能够在高浓度氯化钠(高盐)条件下降解辣椒素的菌种在含辣椒素的餐厨垃圾的微生物处理方面具有重要意义。

　　发明内容

　　本发明提供了一种能够高效降解辣椒素的耐盐辣椒素降解菌、该耐盐辣椒素降解菌的应用及餐厨垃圾处理方法。

　　一种耐盐辣椒素降解菌，命名为嗜麦芽假单胞菌(Stenotrophomona sp.)，株号ZJB19164，保藏号为CCTCC M 2020013。

　　菌株ZJB19164的形态特征：革兰阴性杆菌，有1～8根极端鞭毛，有动力、无芽孢、无荚膜、菌落不溶血，有黄色素。

　　菌株ZJB19164的生理生化特性：明胶水解试验结果为阳性，淀粉水解试验结果为阳性，柠檬酸盐试验结果为阴性，吲哚试验结果为阴性，硝酸盐还原试验结果为阳性，尿素试验结果为阴性，硫化氢试验结果为阳性，葡萄糖试验产酸不产气。

　　菌株ZJB19164的分子生物学鉴定结果：通过16S rDNA序列比对，与Stenotrophomonas sp.strain GR27同源性为100％，菌株ZJB19164的16S rDNA序列系统进化树显示菌株ZJB19164和Stenotrophomonas sp.同源。

　　本发明又提供了所述耐盐辣椒素降解菌在降解辣椒素类物质中的应用。

　　本发明又提供了所述耐盐辣椒素降解菌在含辣椒素类物质的餐厨垃圾处理中的应用。

　　进一步优选的，所述辣椒素类物质具有苯环类和长链脂肪酸。

　　辣椒素类物质包括辣椒素和辣椒素类似物。进一步优选的，所述辣椒素类物质为以下至少一种：合成辣椒素(N-Vanillylnonanamide)、辣椒碱(Capsaicin)、二氢辣椒碱(Dihydrocasaicin)、降二氢辣椒碱(Nordihydrocapsaicin)、高辣椒碱(Homocapsaicin)、高二氢辣椒碱I(Homodihydrocapsaicin I)、高二氢辣椒碱II(HomodihVdrocapsaicinII)、壬酞香荚兰胺(Nonoyl vanillylamide)、辛酞香英兰胺(Decoyl vanillylamide)、癸酞香英兰胺(Capryl vanillylamide)。上述辣椒素类物质中，可以分为两大类，一类是辣椒素，包括：合成辣椒素、辣椒碱、二氢辣椒碱、降二氢辣椒碱、高辣椒碱、高二氢辣椒碱I、高二氢辣椒碱II；另一类是辣椒素类似物，包括：壬酞香荚兰胺、辛酞香英兰胺、癸酞香英兰胺。

　　本发明还提供了一种含辣椒素类物质的餐厨垃圾处理方法，将所述耐盐辣椒素降解菌接种到含辣椒素类物质的餐厨垃圾中进行发酵处理。含辣椒素类物质的餐厨垃圾中如果辣椒素类物质含量较高，其中辣椒素及其类似物能够抑制微生物生长，所以一般难以使用常规微生物进行降解处理。

　　优选的，发酵处理温度为30～50℃，更优选为35～45℃，进一步优选为37～40℃。

　　优选的，餐厨垃圾的盐浓度为5wt％～15wt％。更优选的情况为盐浓度5wt％～10wt％。盐浓度超过10wt％时，菌株降解辣椒素类物质的速度逐渐减慢，但还是有一定的降解能力。

　　优选的，所述耐盐辣椒素降解菌接种量为：以OD600的吸光度为1.0计，稀释菌液与待处理餐厨垃圾的体积比为1∶40。

　　优选的，发酵处理时间不少于12h。进一步优选的，发酵处理时间为12～48h。

　　本发明保藏号为CCTCC M 2020013的耐盐辣椒素降解菌：嗜麦芽假单胞菌(Stenotrophomonas sp.)ZJB19164，能够以辣椒素类物质为唯一碳源进行繁殖，能够快速、高效降解辣椒素类物质，降解率能够达到100％，同时该降解菌还能高效降解淀粉和蛋白质；并且，本发明菌株能够耐受高盐，在高盐浓度下依旧能够高效地降解餐厨垃圾中的辣椒素类物质，可适用于高盐高辣餐厨垃圾的降解处理。

　　附图说明

　　图1为嗜麦芽假单胞菌(Stenotrophomona sp.)ZJB19164平板菌落图。

　　图2为嗜麦芽假单胞菌(Stenotrophomona sp.)ZJB19164基于16S rDNA序列同源性构建的系统发育树。

　　图3为菌株ZJB19164的耐盐实验结果图。

　　图4为菌株ZJB19164在辣椒素培养基中的生长曲线和降解曲线。

　　图5为温度对菌株耐盐辣椒素降解菌ZJB19164降解辣椒素酶活的影响检测结果图。

　　图6为添加了耐盐辣椒素降解菌ZJB19164的实验菌剂降解餐厨垃圾时的各菌种生长曲线和各物质降解率实验结果图。

　　图7为没有添加耐盐辣椒素降解菌ZJB19164的对照菌剂降解餐厨垃圾时的各菌种生长曲线和各物质降解率实验结果图。

　　具体实施方式

　　实施例1

　　富集培养基：MOPS powder(MOPS粉末)8.37mM、tricine 0.08mM、NaCl 0.3mM、NH4Cl 0.05mM、KOH 0.16mM、K2SO4 0.28mM、MgCl2 0.53mM、K2HPO4 2.0mM和60mg/Lcapsaicin。

　　分离纯化培养基：富集培养基添加20％琼脂粉。

　　辣椒素降解培养基：10g胰化蛋白胨(Tryptone)，5g酵母提取物(Yeast extract)，5g NaCl，2g辣椒素(capsaicin)，用蒸馏水定容至1L。

　　降解菌的筛选与分离：降解菌的筛选采用以辣椒素为唯一碳源，逐渐提高辣椒素浓度的驯化方法。具体操作如下：准确称取1g样品，加入装有9ml无菌水的三角瓶中，恒温摇床中充分震荡30min，制成1：10浓度的土壤悬浊液。待土粒沉淀后，吸取1ml上清液，移入装有9ml无菌水的试管中，制成10-2菌悬液，以此类推，制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的菌悬液。选择10-4、10-5、10-6、10-7四个浓度各100μL，加入到辣椒素选择培养基中，辣椒素浓度按0.1、1、10、100mg·L-1依次提高梯度驯化与富集降解菌。经过多次转接培养，梯度稀释培养液并涂布于20mg·L-1辣椒素固体选择培养基上，在37℃恒温培养箱中倒置培养48h。挑取菌落形态不同的单菌落接种至LB固体培养基上，反复划线分离纯化得到纯菌株，菌株经试管斜面富集培养后保存于4℃冰箱中备用。

　　筛选到1株能够降解辣椒素的降解菌，株号为ZJB19164(ZJB19164来源为四川眉山农地辣椒种植地土壤样本)。

　　实施例2

　　降解菌的鉴定：

　　(1)降解菌形态特征鉴定：

　　降解菌经LB培养基培养18h后，观察降解菌的菌落形状、大小、颜色、透明度、粘稠度、湿润度、隆起和边缘特征及是否产色素等，菌体染色后用高倍显微镜观察菌体革兰氏染色、鞭毛、荚膜、芽孢等结构。

　　(2)降解菌生理生化特性测定：

　　降解菌经LB培养基培养18h后，按照文献进行石蕊、葡萄糖、甲基红反应、V-P试验、吲哚反应、柠檬酸盐、淀粉水解、明胶液化、需氧性、产生H2S和硝酸盐还原等生理生化试验。

　　(3)降解菌16S rDNA基因序列的测定及分子系统发育树的构建：

　　降解菌基因组DNA采用(快速提取盒)试剂盒提取菌株的总DNA，用16S rDNA通用引物27F(正向引物)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1492R(反向引物)：5′-TACGGGTACCTTGTTACGACTT-3′，以分离降解菌的总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系(50μL)：DNA模板1μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTP(2.5mmol/L)4μL，引物(10μmol/L)各1μL，Tap酶(5U/μL)0.5μL，双蒸水37.5μL。扩增程序：95℃预变性5min；94℃变性45s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共30次循环；72℃延伸10min。反应完成后，经1％琼脂糖电泳，检测扩增片段的大小和特异性。PCR产物经琼脂糖电泳检测纯化，送北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序并拼接输出全序列，16S rDNA序列与Genebank中已收录的16S rDNA序列进行同源性比对，采用MEGA7进行序列匹配分析，软件使用邻接法(Neighbor-Joiningmethod)构建系统发育树。

　　试验结果表明：菌株ZJB19164的形态特征：革兰阴性杆菌，有1-8根极端鞭毛，有动力、无芽孢、无荚膜、菌落不溶血，有黄色素(图1)。菌株ZJB19164明胶水解试验结果为阳性，淀粉水解试验结果为阳性，柠檬酸盐试验结果为阴性，吲哚试验结果为阴性，硝酸盐还原试验结果为阳性，尿素试验结果为阴性，硫化氢试验结果为阳性，葡萄糖试验产酸不产气。分子鉴定通过引物27F/1492R扩增细菌进行16S rDNA检测鉴定，将测序结果与NCBI比对，再使用比对结果构建发育树(图2)，判定菌株ZJB19164为嗜麦芽假单胞菌(Stenotrophomonasp.)，保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期为2019年1月6日，菌种保藏号为CCTCC M 2020013。

　　实施例3

　　耐盐实验：将ZJB19164分别接种到含有5、7、10、13、15wt％NaCl的培养基(含有2g/L的辣椒素)试管中，37℃，150rpm，培养36h，每隔3h取样，测定辣椒素降解率。

　　实验结果如图3所示，ZJB19164在10％浓度的NaCl的培养基中33h后降解率也能达到100％，说明降解菌虽然降解速度较慢，但还是能够在盐浓度为10％的高盐条件下降解辣椒素。

　　实施例4

　　辣椒素类物质降解试验：将辣椒素降解菌ZJB19164接种到分别含有2g/L天然辣椒碱(Capsaicin)、二氢辣椒碱(DihVdrocapsaicin)或辣椒素(合成)(N-Vanillylnonanamide)的降解培养基(和氯化钠10％)中，37℃培养36h，每隔3h取样测定生物量和辣椒素类物质的含量。

　　辣椒素浓度测定方法：在日立Primaide高效液相色谱法(Hitachi Primaide)上，用1410紫外检测器Hitachi Primaide和5μm粒径ODS(C18)柱(4.6×250mm，J&K)进行了30℃生物转化分析。流动相在70％甲醇中为0.1％乙酸，在30℃下流速为1mL/min。取样体积为10μL，紫外检测波长为280nm。保留时间为10.5min。

　　生物量测定方法(MTT比色实验)：(1)取发酵好的菌液，用灭好菌的PBS稀释液倍比稀释成10个浓度，分别对不同浓度的菌液做MTT比色实验，同时选择合适的稀释度，做平板菌落计数。(2)用微量吸液器吸取不同浓度的发酵液100μL，分别加入96孔酶标板中，每个样液做5个复孔，同时设阴性对照。(3)用微量吸样器在96孔酶标板中含有样品的各孔分别加入10μL或20μL的MTT应用液，ZJB19164菌株于37℃、恒温培养箱放置20min后取出，向各孔分别加入100μL的DMSO，用全自动酶标仪于570nm处测定OD570值，测量前振动60s。

　　降解菌ZJB19164的生长曲线和降解曲线的试验结果如图4所述，在6h就进入了对数生长期，并且降解率达到了50％左右；培养后降解率都达到了100％。

　　实施例5

　　温度对酶活性的影响：将ZJB19164分别接种到含有2％辣椒素(合成)和氯化钠(10％)的培养基试管中，分别在30、35、40、45、50℃温度，150rpm，培养36h，每隔3h取样测定降解率。

　　实验结果如图5所示，ZJB19164的辣椒素降解酶活最适温度为40℃，最早21h的降解率达到了100％。

　　实施例6

　　高盐高辣餐厨垃圾降解试验：添加氯化钠(10％)到餐厨垃圾(样品来源于火锅店的餐厨垃圾)中形成高盐高辣餐厨垃圾，最终辣椒素浓度为2.14g/L。

　　以本实验室现有不含辣椒素降解菌的餐厨垃圾降解菌剂(专利公开号CN110272834A)为对照菌剂，对照菌剂包含克鲁维毕赤酵母和林生地霉两株菌。然后将耐盐辣椒素降解菌ZJB19164添加到对照菌剂中制备为实验菌剂。

　　将菌种分别进行摇瓶培养，按等比例混合，菌液稀释到OD 600的吸光度为1.0备用。将200mL高辣餐厨垃圾和两种菌剂各5mL稀释菌液混合添加到500mL摇瓶中，同时制备4个对照，37℃培养间培养48h，每隔3h取样测定辣椒素降解率和蛋白质、淀粉、油脂的降解率。辣椒素浓度使用实施例3中的液相测定，蛋白质含量使用索莱宝公司的考马斯亮蓝试剂盒测定，淀粉含量测定使用索莱宝的淀粉含量检测试剂盒测定。

　　试验结果：图6为添加了耐盐辣椒素降解菌ZJB19164的实验菌剂降解餐厨垃圾时的各菌种生长曲线和各物质降解率，图7为没有添加耐盐辣椒素降解菌的对照菌剂降解餐厨垃圾时的各菌种生长曲线和各物质降解率。实验菌剂处理的餐厨垃圾辣椒素降解菌最先开始繁殖，其他菌种都稍微减少，然后辣椒素被辣椒素降解菌快速降解，同时开始降解了部分蛋白质和淀粉，然后其他菌种开始大量繁殖，最终淀粉、蛋白质的降解较为迅速，辣椒素12h就降解完全，蛋白质和淀粉也在24h后基本降解完全，但是油脂最终的降解率不高；而对照菌剂处理的餐厨垃圾里面的菌种由于辣椒素的抑制作用生物量基本没有增加，因此辣椒素、淀粉和蛋白质基本没有降解。

　　说明降解菌ZJB1 9164能够在高辣的环境中有效的降解高辣餐厨垃圾中的辣椒素，解除辣椒素对不耐辣椒素菌种的抑制作用，能够有效改善菌剂对高辣餐厨垃圾的降解效果。

　　序列表

　　<110> 浙江工业大学

　　<120> 一种耐盐辣椒素降解菌、应用及餐厨垃圾处理方法

　　<160> 1

　　<170> SIPOSequenceListing 1.0

　　<210> 1

　　<211> 1406

　　<212> DNA

　　<213> 嗜麦芽假单胞菌(Stenotrophomonas sp.)

　　<400> 1

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