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一种降解重油的固氮螺菌新物种及其微生物制剂

2020-11-03 10:42:09

　　一种降解重油的固氮螺菌新物种及其微生物制剂

　　技术领域

　　本发明涉及微生物领域，具体涉及一种降解重油的固氮螺菌新物种及其微生物制剂。

　　背景技术

　　固氮螺菌属(Azospirillum)是细菌域中α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)的一个类群。1978年，Tarrand等学者发现描述了巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)，并再分类具脂螺菌(Spirillum lipoferum)为具脂固氮螺菌(Azospirillum lipoferum)，至此该属首次被提出并包含两个物种，由于具脂固氮螺菌的发现时间优先性，其成为该属的典型菌种。目前该属共包含18个物种，大多来源于耕种土壤，也有分离自泉水、生物电池等环境，据报道其代表菌株大部分都具有固氮能力，因此具备促进植物生长的潜能。

　　重油是指重质原油，即相对密度介于0.90～1.00克/立方厘米之间的原油，其密度大、性质粘稠，含有大量难生物降解的大分子多环芳烃及胶质、沥青质等重质组分，难于开采，同时一旦在环境中积累，又难于降解。但目前随着能源需求的不断增长和常规油气资源的日益消耗，重油在石油工业中的比例和地位大幅提升，而开采率低的现状，及运输、加工过程中的冒、滴、漏等问题都在所难免。例如2011年发生重大溢油事故的渤海湾油田，其原油产量的70%～80%属于重质油。另外，作为全球第二大石油进口国，我国从委内瑞拉等国大量进口重质原油，运输中发生溢油事故的风险也大大增加。一旦发生泄漏，对环境造成的影响比常规原油、燃料油更加严重和持久，重油污染的治理也更加困难。近年来，以微生物降解为核心，具有高效、环保、经济等显著优点的微生物采油及污染物微生物修复技术已受到学者的广泛关注。尽管目前已经在多种生境中分离得到多株原油降解菌，但对重油降解菌的报道还较少;与此同时，仅有一篇对固氮螺菌属降解轻质原油的报道(Muratova,A.Y,Turkovskaya,O.V.,Antonyuk,L.P.,et al.2005.Oil-oxidizing potential ofassociative rhizobacteria of the genus Azospirillum.Microbiology,74,2:210-215.)，而没有对该属菌株降解重油的相关报道。

　　发明内容

　　本发明的目的是提供一种降解重油的固氮螺菌新物种及其微生物制剂。

　　第一方面，本发明要求保护解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)RWY-5-1-1T。

　　本发明所要求保护的解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)RWY-5-1-1T属于固氮螺菌属(Azospirillum)的一个新菌种，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏编号为CGMCC No.17324。

　　第二方面，本发明要求保护一种微生物制剂。

　　本发明所要求保护的微生物制剂，含有前文第一方面所述的解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)RWY-5-1-1T。其余成分可为本领域常用的辅料或载体。

　　第三方面，本发明要求保护所述解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)RWY-5-1-1T或所述微生物制剂在如下任一中的应用：

　　(a1)降解石油或原油;

　　进一步地，所述石油为重质石油;所述原油为重质原油;

　　(a2)微生物采油;

　　(a3)生物固氮;

　　(a4)土壤修复和/或土质改良;

　　(a5)促进植物生长。

　　未经加工处理的石油称为原油。

　　土壤污染的微生物修复技术，就是利用微生物在污染的胁迫下，能够从体内分泌出某种具有络合或分解转化污染物能力的有机物质，使污染物的移动性降低或极性改变，从而不容易进入生物体内;或者，使污染物在微生物分泌的胞外酶的作用下，在体外被分解转化为无毒无害的物质。增加土壤中抗性微生物的数量，不仅可以降低污染程度，同时还可以提高土壤的肥力，这是一项既经济又实效的技术。

　　微生物土壤改良技术，是将有机肥与促使土壤养分快速释放的微生物群体混合物施于土壤中。微生物在土壤中可快速、高效地分解有机质而加速自身的生长与繁殖，将空气中的分子态氮固定并转化为植物可以吸收的氨态氮，同时将土壤中不溶的P、K分解为可溶性的元素，从而易于为植物吸收利用，以此来改良土壤;此外，在作物收获后，直接将有效微生物群体喷施在残茬上，可使地表上下的残茬迅速分解，以而达到增加土壤肥力、改良土壤结构、充分保持和利用土壤水分的目的。

　　第四方面，本发明要求保护应用，具体为解油固氮螺菌(Azospirillumoleiclasticum)或含有所述解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)的微生物制剂在如下任一中的应用：

　　(a1)降解石油或原油;

　　进一步地，所述石油为重质石油;所述原油为重质原油;

　　(a2)微生物采油;

　　(a3)生物固氮;

　　(a4)土壤修复和/或土质改良;

　　(a5)促进植物生长。

　　其中，所述解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)是革兰氏染色阴性的杆状细菌，且其菌株16S rRNA基因序列与SEQ ID No.1具有98.7%或以上的同源性。

　　以98.7%作为划分细菌物种的阈值，依据来自于参考文献“Stackebrandt E,Ebers J.2006,Taxonomic parameters revisited:tarnished goldstandards.Microbiol Today,33:152-155.”。

　　实验证明，本发明所提供的解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)RWY-5-1-1TCGMCC No.17324属于固氮螺菌属(Azospirillum)的一个新菌种。解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)RWY-5-1-1T CGMCC No.17324不仅具有固氮功能，还具有重质原油和石油的降解功能，在微生物采油、土壤生物修复、土质改良和促进作物生长等方面具有广泛的综合应用前景。

　　保藏说明

　　菌株名称：解油固氮螺菌

　　拉丁名：Azospirillum oleiclasticum

　　参椐的生物材料(株)：RWY-5-1-1T

　　保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

　　保藏机构简称：CGMCC

　　地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

　　保藏日期：2019年3月8日

　　保藏中心登记入册编号：CGMCC No.17324

　　附图说明

　　图1为本发明菌株RWY-5-1-1T的透射电镜图。

　　图2为本发明菌株RWY-5-1-1T的重油降解效果图。

　　图3为本发明菌株RWY-5-1-1T基于16S rRNA基因序列的系统进化树。

　　具体实施方式

　　下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

　　下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

　　A.picis DSM 19922T：该菌株的详细信息记录在如下网址中：https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/DSM-19922.html?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=304。同时该菌株在“International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology(2009),59:761-765”一文中有所记载。

　　A.thiophilum DSM 21654T：该菌株的详细信息记录在如下网址中：https://www.dsmz.de/catalogues/details/culture/DSM-21654.html?tx_dsmzresources_pi5%5BreturnPid%5D=304。同时该菌株在“International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology(2010)，60:2832–2837”一文中有所记载。

　　A.lipoferum NBRC 102290T：该菌株的详细信息记录在如下网址中：https://www.jcm.riken.jp/cgi-bin/jcm/jcm_cc?CC=NBRC&NUM=102290。同时该菌株在“Canadian Journal of Microbiology(1978),24:967-980.”一文中有所记载。

　　A.humicireducens KACC 16605T：该菌株的详细信息可在如下网址中查询：http://www.cctcc.org/news_show1.php?newsid=88。同时该菌株在“InternationalJournal of Systematic and Evolutionary Microbiology(2013),63:2618-2624.”一文中有所记载。

　　实施例1、菌株RWY-5-1-1T的分离筛选及鉴定

　　1、菌株RWY-5-1-1T的分离筛选

　　本发明菌株RWY-5-1-1T分离自玉门油田单北区块的原油采出液，具体分离操作如下：

　　原油样品预处理：用无菌异辛烷反复洗涤原油样品，并将洗涤的上清液转移至无菌的容器中。使用0.22微米孔径有机滤膜收集全部上清液中细胞，并将滤膜放入5ml无菌生理盐水中，通过充分振荡洗膜，形成的菌悬液分菌备用。

菌株分离培养基：使用R2A培养基，溶剂为水，溶质及浓度如下：葡萄糖0.5g·L-1、可溶性淀粉0.5g·L-1、蛋白胨0.5g·L-1、酵母浸膏0.5g·L-1、酸水解酪素0.5g·L-1、丙酮酸钠0.3g·L-1、磷酸氢二钾0.3g·L-1、七水合硫酸镁0.05g·L-1、琼脂15g·L-1;pH值7.2。分离筛选方法：将预处理所得菌悬液涂布于R2A培养基平板上，30℃培养7天。挑取生长良好，菌苔完整且形态特征各异的单菌落，于相同分离培养基平板上划线纯化，得到不同纯菌株，以便后续研究。同时所得纯菌株均使用10%(v/v)脱脂牛奶真空冷冻干燥和15%(v/v)甘油超低温液氮两种方式保藏。将其中所得一株菌编号为RWY-5-1-1T。

　　菌株在30℃条件下，生长于R2A培养基上，进行形态学、生理生化、细胞化学及基因水平研究时，其他特殊情况将说明。

　　2、RWY-5-1-1T菌株的生理生化特征检测

　　菌株RWY-5-1-1T在培养条件下生长3天后，使用透射电子显微镜进行细胞形态学观察。生长温度检测范围为4、10、15、20、25、30、37、42和45℃;生长盐浓度(NaCl)检测范围为0-6%(0-6g/100ml)的7个(0、1、2、3、4、5、6)浓度梯度;生长pH检测范围为4-10之间的10个(4、5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、10)梯度(Meng,Y.C.,Liu,H.C.,Zhou Y.G.,et al.2018,Vibrio gangliei sp.nov.,a novel member of Vibrionaceae isolated from sawdustin a pigpen.Int J Syst Evol Microbiol,68:1969-1974.)。菌株的生理生化功能使用法国梅里埃公司生产的检测试剂盒API 20E、API ZYM，以及美国BiOLOG公司生产的检测系统GEN III完成。麦康凯培养基生长检测是在麦康凯平板上接种菌株，30℃培养7天，观察菌落颜色及其周围浑浊圈的变化。生物素需求按Tarrand等人(Tarrand,J.J.,Krieg,N.R.&Dobereiner,J.1978,A taxonomic study of the Spirillum lipoferum group,withdescriptions of a new genus,Azospirillum gen.nov.and two species,Azospirillumlipoferum(Beijerinck)comb.nov.and Azospirillum brasilense sp.nov.Can JMicrobiol 24:967-980.)描述的方法进行检测。其他菌株生理特征，包括革兰氏染色属性、细胞内含物、运动性、氧需求、触酶活性、酪素水解活性，按照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠,蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社)进行。

　　鉴定结果显示，菌株RWY-5-1-1T为革兰氏染色阴性细菌，细胞呈略弯曲短棒状，长2.95-4.0微米，宽1.5-1.9微米，兼性厌氧，以单端鞭毛运动(见图1)，内含聚羟基丁酸酯。菌株在30℃下R2A培养基上培养48小时后，菌落呈乳白色，圆形、光滑、微凸，直径0.8-1.0毫米。菌株的生长耐受范围是15-37℃、0-3%NaCl、pH 6-8.5，最适生长条件是25℃、0%NaCl、pH 7.5。氧化酶、触酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、酪蛋白酶、脲酶的产生及硝酸盐还原、七叶灵水解均呈阳性;类脂酶(C14)、胱氨酸芳胺酶、精氨酸双水解酶的产生及柠檬酸利用、明胶液化、吲哚产生和麦康凯平板生长为阴性。菌株RWY-5-1-1T与固氮螺菌属近源物种代表菌株的生理生化特征差异见表1。

　　表1菌株与固氮螺菌属近源菌种代表菌株生理生化特征差异表

　　注：表中，+表示为阳性，-表示为阴性。

　　由表1所示结果可见，本发明菌株RWY-5-1-1T与已报到的近源菌株都存在明显差异，是固氮螺菌属新物种。

　　3、菌株RWY-5-1-1T的细胞化学特征检测

　　通过气相色谱(6890;Hewlett Packard)分析检测菌株RWY-5-1-1T的细胞壁脂肪酸成分(Sasser M.1990,Identification of bacteria by gas chromatography ofcellular fatty acids.USFCC News Lett,20:1-6.)。在本发明菌株RWY-5-1-1T中，具有10个异戊二烯单元侧链的辅酶Q(Q-10)是呼吸链中的主要呼吸醌类型。比较发明菌株RWY-5-1-1T与近源菌种代表菌株A.picis DSM 19922T、A.thiophilum DSM 21654T、A.lipoferumNBRC 102290T、A.humicireducens KACC 16605T的脂肪酸成分，见表2。结果显示，本发明菌株RWY-5-1-1T的主要脂肪酸是C18:1ω7c/C18:1ω6c，占总含量的72.72%，这一主要成分也与固氮螺菌属其他种一致。但本发明菌株RWY-5-1-1T又有与其他近源种不同的独到之处，例如C16:1ω9c就是其独有成分，同时如表2所示，菌株RWY-5-1-1T很多脂肪酸成分的含量也与其他近源种不同，因此本发明菌株RWY-5-1-1T是固氮螺菌属新物种。

　　表2菌株与固氮螺菌属近源菌种代表菌株脂肪酸特征差异表

　　注：表中“-”表示未检测出;概括特征组分指无法通过气相色谱MIDI系统分离的2或3种脂肪酸组分。概括特征2包括C12:0aldehyde(未知成分)、C16:1iso I/C14:0 3-OH;概括特征3包括C16:1ω7c/C16:1ω6c;概括特征8包括C18:1ω7c/C18:1ω6c。

　　4、菌株的固氮能力检测

　　菌株RWY-5-1-1T的固氮能力使用乙炔还原法测定(Baldani,J.I.,Reis,V.M.,Videira,S.S.,et al.2014,The art of isolating nitrogen-fixing bacteria fromnon-leguminous plants using N-free semi-solid media:a practical guide formicrobiologists.Plant and Soil,384:413-431.)。具体步骤如下：制作NFb半固体培养基装入带有通气胶塞的厌氧管中，接种菌株培养物，黑暗中30℃培养36h。更换丁基胶塞，用乙炔置换厌氧管中10%(v/v)的气体，继续培养36h。然后每隔4小时测一次厌氧管中的乙烯含量，共24小时。检测时，从厌氧管中抽取2ml气体，打入反应气体存储瓶中，并从反应气体存储瓶中取100μl气样，注入气相色谱仪7820A(Agilent)中，控制仪器中N2，H2和干燥空气的流速分别为40、40和400ml min-1，根据仪器屏幕显示值，记录样品中乙烯的峰面积。同样方法检测100μl乙烯标气的峰面积。同时用稀释平板涂布法，计算菌株CFU值。最后根据如下公式计算菌株RWY-5-1-1T固氮酶活性：

　　结果显示菌株RWY-5-1-1T固氮酶活性为22nmol C2H4/h˙108cells。为进一步确定本发明菌株RWY-5-1-1T的固氮能力，从菌株RWY-5-1-1T的基因组DNA中扩增编码固氮还原酶的nifH基因(Poly F.,Monrozier L.J.,Bally R.2001,Improvement in the RFLPprocedure for studying the diversity of nifH genes in communities of nitrogenfixers in soil.Res Microbiol 152:95-103.)片断(332bp)并测序，将其与GenBank上公开的固氮螺菌属nifH基因序列进行比对，结果显示，其与A.brasilense Gr29T相似度最高为96.6%，与本属其他种的nifH基因序列相似度在85.5%-96.3%。进一步说明了本发明菌株RWY-5-1-1T具有固氮能力且与其他已知物种不同。

　　5、菌株的重质原油降解能力检测

　　本发明菌株RWY-5-1-1T的重质原油降解率采用重量法计算(谢丹萍,尹华,彭辉,等.2004,混合菌对石油的降解.《应用与环境生物学报》,10,2:210-214.)。具体步骤如下：配制NFb液体培养基，并添加1%(1g/100ml)来源于我国玉门油田的重质原油样品(相对密度0.94)，灭菌备用。接种生长至对数生长期的RWY-5-1-1T菌液4ml至100ml培养基中，30℃培养14天，并设空白对照组，原油降解效果如图2所示。由图可见：经培养后，在常温下，未接种菌株RWY-5-1-1T的空白对照组培养基中残油仍是清晰可见的一块固体状重质原油，无任何乳化、分散现象;而接种了菌株RWY-5-1-1T的实验组培养基中，残油是明显的极小体积的液质油滴，分散在培养基的表层，说明了菌株RWY-5-1-1T对重质原油显著的降解能力。进一步为了计算原油的降解率，随后采用石油醚并使用分液漏斗分别充分萃取实验组与对照组培养瓶中的残存原油，所得原油组分68℃烘干，置干燥器中冷却恒重，称重，根据如下公式计算原油降解率。M0为空白对照组残油重量，M1为实验组残油重量。

　　经计算本发明菌株RWY-5-1-1T的原油降解率为36.2%。实际降解效果图(图2)和36.2%的原油降解率均证明本发明菌株RWY-5-1-1T具有重质原油和石油的降解乳化功能。

　　6、菌株系统进化地位的确定

　　提取本发明菌株RWY-5-1-1T的基因组DNA并扩增、克隆测序其16S rRNA基因序列(GeneBank登录号为MK332580)，将得到的序列(SEQ ID No.1)在国际权威细菌分类学分析数据库(http://www.ezbiocloud.net/)中进行在线比对(Kim OS,Cho YJ,Lee K,etal.2012,Introducing EzTaxon-e:a prokaryotic 16S rRNA gene sequence databasewith phylotypes that represent uncultured species.Int J Syst Evol Microbiol,62:716-721.)。结果显示本发明菌株RWY-5-1-1T与固氮螺菌属的菌种相似性最高，其中序列两两相似性最高的物种代表菌株分别为Azospirillum picis DSM 19922T(相似性96.0%)、A.thiophilum DSM 21654T(95.9%)和A.humicireducens KACC 16605T(95.9%)。由此可见，本发明菌株RWY-5-1-1T16S rRNA基因序列与已知菌种的最高相似性是96.0%，该值明显低于细菌不同物种的界定阈值98.7%。为进一步明确菌株的系统进化地位，选取固氮螺菌属所有菌种的代表菌株16S rRNA基因序列构建系统进化树(Thompson J.D,Higgins D.G,Gibson T.J.1994,CLUSTAL W:improving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting,position-specific gap penalties and weight matrix choice.Nucleic Acids Res,22:4673-4680.Saitou N,Nei M.1987,The neighbor-joining method:a new method forreconstructing phylogenetic trees.Mol Biol Evol,4:406-425.Kumar S,Stecher G,Tamura K.2016,MEGA7:molecular evolutionary genetics analysis version 7.0forbigger datasets.Mol Biol Evol,33:1870-1874.Kimura M.1980,A simple method forestimating evolutionary rates of base substitutions through comparativestudies of nucleotide sequences.J Mol Evol,16:111-120.Felsenstein J.1985,Confidence limits on phylogenies:an approach using thebootstrap.Evolution.39:783-791.)，如图3所示，本发明菌株RWY-5-1-1T单独形成一枝，聚在固氮螺菌属中，充分说明了其为固氮螺菌属新物种。

　　综上所述，本发明菌株RWY-5-1-1T与现有固氮螺菌有许多明显且显著的差异特征，包括表型、生理生化及细胞化学等方面。同时基于基因水平的系统进化分析进一步说明了该菌株与现有固氮螺菌各物种的不同，充分证明了本发明菌株RWY-5-1-1T代表了固氮螺菌属的一个新物种，命名为解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)。同时通过固氮能力和降解原油(石油)能力的检测，也证明了本发明菌株同时具有固氮和重质原油(石油)降解能力，是一株多功能的固氮螺菌新物种，在土壤修复、土质改良及促进作物生长等方面具有广泛的应用前景。解油固氮螺菌(Azospirillum oleiclasticum)RWY-5-1-1T已经于2019年3月8日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.17324。

　　<110> 中国科学院微生物研究所

　　<120> 一种降解重油的固氮螺菌新物种及其微生物制剂

　　<130> GNCLN190415

　　<160> 1

　　<170> PatentIn version 3.5

　　<210> 1

　　<211> 1443

　　<212> DNA

　　<213> Azospirillum oleiclasticum

　　<400> 1

　　gagtttgatc ctggctcaga acgaacgctg gcggcatgcc taacacatgc aagtcgaacg 60

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