胰腺癌的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用
第一、技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种胰腺癌的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用。
第二、背景技术
胰腺癌是一种恶性程度很高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90%起源于腺管上皮的导管腺癌。胰腺癌的发病率因地区而异，平均约为5.1/10万人。男性发病率比女性较高，比例约为1.5-2:1。总体发病率近年来呈现上升趋势。中国国家癌症中心最新统计数据显示，胰腺癌位居中国城市男性恶性肿瘤发病率的第8位，居北京市和上海市人群恶性肿瘤死亡率的第5位。
胰腺癌的病因尚不十分清楚。其发生与吸烟、饮酒、高脂肪和高蛋白饮食、过量饮用咖啡、环境污染及遗传因素有关;近年来的调查报告发现糖尿病人群中胰腺癌的发病率明显高于普通人群;也有人注意到慢性胰腺炎病人与胰腺癌的发病存在一定关系，发现慢性胰腺炎病人发生胰腺癌的比例明显增高;另外还有许多因素与此病的发生有一定关系，如职业、环境、地理等。胰腺癌的常见临床表现如下：
1、腹痛：疼痛是胰腺癌的主要症状，不管癌位于胰腺头部或体尾部均有疼痛。除中腹或左上腹、右上腹部疼痛外，少数病例主诉为左右下腹、脐周或全腹痛，甚至有睾丸痛，易与其他疾病相混淆。当癌累及内脏包膜、腹膜或腹膜后组织时，在相应部位可有压痛。
2、黄疸：黄疸是胰腺癌，特别是胰头癌的重要症状。黄疸属于梗阻性，伴有小便深黄及陶土样大便，是由于胆总管下端受侵犯或被压所致。
3、消化道症状：最多见的为食欲不振，其次有恶心、呕吐，可有腹泻或便秘甚至黑便，腹泻常常为脂肪泻。
4、消瘦、乏力：胰腺癌和其他癌不同，常在初期即有消瘦、乏力。
5、腹部包块：胰腺深在，于后腹部难摸到，腹部包块系癌肿本身发展的结果，位于病变所在处，如已摸到肿块，多属进行期或晚期。慢性胰腺炎也可摸到包块，与胰腺癌不易鉴别。
6、症状性糖尿病：少数病人起病的最初表现为糖尿病的症状，即在胰腺癌的主要症状如腹痛、黄疸等出现以前，先患糖尿病，以至伴随的消瘦和体重下降被误为是糖尿病的表现，而不去考虑胰腺癌。
7、血栓性静脉炎：晚期胰腺癌患者出现游走性血栓性静脉炎或动脉血栓形成。
8、精神症状：部分胰腺癌患者可表现焦虑、急躁、抑郁、个性改变等精神症状。
9、腹水：一般出现在胰腺癌的晚期，多为癌的腹膜浸润、扩散所致。
10、其他：此外，患者常诉发热、明显乏力。可有高热甚至有寒战等类似胆管炎的症状，故易与胆石症、胆管炎相混淆。
胰腺癌的临床特点是整个病程短，早期诊断困难容易于其它疾病混淆，中晚期病情发展快且迅速恶化。因此，胰腺癌的治疗非常困难，且预后极差。因为早期诊断困难，只有10%到15%病人有手术切除的机会。胰腺癌的平均生存期为诊断后2-3个月，一年生存为8%，五年生存率仅有3%。因此，亟需寻找有效的诊断和治疗方法。目前针对胰腺癌的诊断手段主要分为生物化学及分子生物学检测、基因检测、影像学检测和病理学检测四大类。
1、生物化学及分子生物学检测：
1)糖类抗原CA19-9是目前最常用的胰腺癌诊断标志物，具有以下临床特征：将血清CA19-9>37U/ml作为阳性指标，诊断胰腺癌的灵敏度和特异度分别达到78.2%和82.8%。约10%的胰腺癌患者Lewis抗原阴性，CA19-9不升高，此时需结合其他肿瘤标志物如CA125和(或)癌胚抗原(CarcinoEmbryonic Antigen，CEA)等辅助诊断。对于CA19-9升高者，在排除胆道梗阻或胆道系统感染等因素后应高度怀疑胰腺癌。
2)血糖变化监测：a)老年、体重指数低、无糖尿病家族史的新发糖尿病者，应警惕胰腺癌的发生;b)既往长期罹患糖尿病，短期出现血糖波动且难以控制者，亦应警惕胰腺癌的发生;c)前瞻性研究结果显示，空腹血糖每升高0.56mmol/L，胰腺癌发病风险增加14%;2)其他生物标志物：外周血内microRNA、ctDNA、外泌体内Glypican-1等也具有潜在临床应用前景，但临床应用尚待高级别循证医学证据的证实。
2、基因检测：CDKN2A、BRCA1/2、PALB2等基因突变被证实与家族性胰腺癌发病密切相关。但这种基因检测只能评估患癌风险，不能作为诊断标准。
3、影像学检查
1)增强三维动态CT薄层扫描：目前诊断胰腺癌最常用的手段，能清晰显示肿瘤大小、位置、密度及血供情况，并依此判断肿瘤与血管【必要时采用CT血管成像(ComputedTomography Angiography，CTA)检查】、邻近器官的毗邻关系，指导术前肿瘤的可切除性及新辅助化疗效果评估。
2)核磁共振成像(MRI)：除显示胰腺肿瘤解剖学特征外，还可清晰地显示胰腺旁淋巴结和肝脏内有无转移病灶;且在与水肿型或慢性肿块型胰腺炎鉴别方面优于CT检查。磁共振胰胆管造影(Magnetic Resonance Cholaniopancreatography，MRCP)与MRI薄层动态增强联合应用，有助于明确胰腺囊性和实性病变(尤其是囊腺瘤、胰腺导管内乳头状黏液肿瘤的鉴别诊断)，并进一步明确胰管、胆管的扩张及侵犯情况，诊断价值更高。
3)正电子发射断层显像(Positron Emission Tomography，PET)-CT检查：可显示肿瘤的代谢活性和代谢负荷，在发现胰外转移和评价全身肿瘤负荷方面具有明显优势。
4)超声内镜(Endoscopic UltraSonography，EUS):在内镜技术的基础上结合了超声成像，提高了胰腺癌诊断的灵敏度和特异度;特别是EUS引导细针穿刺活检(Fine NeedleAspiration，EUS-FNA)，已成为胰腺癌定位和定性诊断最准确的方法。另外，EUS也有助于判断肿瘤分期，诊断T1～2期胰腺癌的灵敏度和特异度分别为72%和90%，诊断T3～4期胰腺癌的灵敏度和特异度分别为90%和72%。
4、病理学检查：组织病理学和(或)细胞学检查是诊断胰腺癌的"金标准"。除拟行手术切除的患者外，其余患者在制订治疗方案前均应力争明确病理学诊断。目前获得组织病理学或细胞学标本的方法包括：
1)EUS或CT引导下穿刺活检;2)腹水脱落细胞学检查;3)腹腔镜或开腹手术下探查活检。
但以上的现有检测方法，都有其局限性。如生物化学及分子生物学检测，因为标志物种类较少，难以同时保证特异性及灵敏度;影像学检测价格昂贵;病理学检查需要穿刺或抽取腹水，病人痛苦大等等。而且，所有现有检测方法，都难以区分早期胰腺癌与其他类型疾病，病人往往错过早期诊断机会。因此，亟需一种更高灵敏度和特异性，且简便易行的胰腺癌诊断方法。
第三、发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种胰腺癌的外周血TCR标志物及其检测试剂盒和应用，能准确快速的判断待测样本中是否有较高胰腺癌风险患者。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种胰腺癌的外周血TCR标志物，该标志物包括序列为SEQ ID NO.1～100所示的蛋白中的至少一种，具体序列见表1。
表1标志物序列
进一步地，标志物的蛋白序列为SEQ ID NO.1～100所示的序列经取代、缺失和/或替换一个或多个碱基后，能表达相同功能的蛋白。
进一步地，标志物为外周血TCR CDR3序列。
上述标志物在制备治疗胰腺癌的制剂中的应用。
进一步地，制剂中包括含有该标志物的T细胞受体，或能表达产生该标志物的T细胞受体的质粒、病毒载体或核酸片段。
一种用于胰腺癌检测的试剂盒，包括能与上述标志物发生特异性结合的抗体。
一种制剂，包括能与上述标志物发生特异性结合的抗体;所述制剂可用于对胰腺癌进行诊断、预测、检测或筛查。
一种检测胰腺癌的蛋白质芯片，该蛋白质芯片包括基片和点样在基片上特异性抗体，该特异性抗体为能与上述标志物发生特异性结合的抗体。
本发明的原理为：人体内的B淋巴细胞和T淋巴细胞是获得性免疫系统中重要的两类细胞。B细胞通过细胞表面的B细胞受体(BCR)识别抗原，后期BCR在B细胞分化成浆细胞时，表达成抗体，分泌到细胞外。T细胞通过细胞表面的T细胞受体(TCR)识别抗原。BCR和TCR的多样性是建立获得性免疫系统的基础。BCR多样性的理论值是1018，TCR多样性的理论值是1014。BCR与TCR序列中，抗原决定簇3(CDR3)是决定其抗原特异性最重要的部分，因此CDR3的序列被认为可以代表BCR、TCR序列的特性。
在各种疾病中，随着不同的抗原刺激，BCR和TCR的多样性或者表达水平都会发生改变。因此，利用BCR或者TCR高通量测序结果可以追踪疾病的发生、发展。人体内细胞中，衰老蛋白质降解后，其片段会被运输到细胞表面，通过组织相容性抗原II(MCHII)呈递给免疫系统中的T细胞。正常细胞呈递的抗原片段，由于免疫耐受的关系，不会引起免疫反应。一旦当正常细胞出现癌变后，突变的基因表达的异常蛋白，其片段被呈递到细胞表面后，就会引起人体免疫系统产生针对性的免疫反应。因此，分析BCR或TCR的变化，能够检测出肿瘤的发生和发展。
本发明的有益效果为：
1、本发明中，首先利用1300个非胰腺癌的对照组样本、和6个胰腺癌病人的TCR高通量测序数据建立了人工智能分析模型，通过和这些胰腺癌特异性TCR序列对比，可以清楚的判断待测样本中是否有较高胰腺癌风险者。
2、通过高通量测序分析TCR变化可以发现很早期的胰腺癌，利用胰腺癌特有的TCRCDR3序列分析人的免疫系统中的T细胞对胰腺癌的反应，是一种新型的检测方法。
3、本发明通过采用高通量测序技术，能够同时比较数量巨大的特异性TCR序列，比起单独检测一种或几种标记物，具有更高的特异性和准确性。
4、本发明中使用的高通量测序仪器成本低于大型影像学设备，且可向第三方外包，此外，采样、处理的人力成本低于同时检测多种标记物，也低于大量细胞学检测，因此，本发明大大降低了检测成本;并且，本发明只需要采取少量外周血，采样简便、安全。
5、本发明中所述TCR CDR3序列，可用于胰腺癌的免疫治疗。
第四、附图说明
图1为本发明中，对照组CDR3序列及胰腺癌特征序列。横坐标代表某一特定氨基酸组合的CDR3序列被加入对照序列集合或胰腺癌特征序列集合的先后顺序,纵坐标代表该序列在某一样本中重复出现次数CX的对数值;胰腺癌患者的免疫图谱具有多个种类且重复次数较高的胰腺癌特征序列，健康人极少胰腺癌特征序列，而未知受试者的胰腺癌特征比较明显，说明罹患胰腺癌风险较高。
图2为本发明中，针对胰腺癌特征序列集，计算健康人、非肿瘤病人、非胰腺癌肿瘤患者和胰腺癌患者的胰腺癌特征性指数，健康人、非肿瘤病人、非胰腺癌肿瘤患者的胰腺癌特征性指数均与胰腺癌患者具有显著差异，证明了胰腺癌特征序列集的特异性。据此可以判断未知受试者是否罹患胰腺癌。
第五、具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。
实施例1通过免疫图谱分析，获得胰腺癌TCR标志物CDR3序列集
1、采样及免疫图谱分析(方法参考专利ZL201910300069.9)
采集1301名对照组(包括健康人和非肿瘤疾病病人，1300人用于建立模型，1个健康人用于验证)、7名胰腺癌患者(6人用于建立模型，1人用于验证)及1名未知健康状况受试者的外周血(每人10mL)，通过高通量测序得到受试者和对照组的TCR的抗原决定簇3(CDR3)氨基酸序列，保证每个样本的功能性TCR的CDR3序列总数综合不低于30000;
2、对每个样本的TCR的CDR3序列进行随机不放回抽样，使每个样本的CDR3序列数量总和均为30000。对任一特定CDR3序列X，在单样本测序结果中重复出现次数计为CX;
3、通过分析TCR CDR3数据，确定胰腺癌TCR标志物CDR3序列：
a)将1300名用于建立模型的对照组样本的所有CDR3序列归总去重，设为对照序列集;
b)将6名用于建立模型的胰腺癌样本的所有CDR3序列归总去重，再去除所有与对照序列集中包含序列重复的序列，设为胰腺癌特征序列集。作图如附图1A所示，其中横坐标代表某一特定氨基酸组合的CDR3序列被加入对照序列集合或胰腺癌特征序列集合的先后顺序，纵坐标代表该序列在某一样本中重复出现次数CX的对数值。
c)按照同样作图方法，将1名健康人、1名胰腺癌患者和1名健康状况未知受试者的免疫图谱，参照对照序列集合和胰腺癌特征序列集合进行作图，见附图1B-D。从图中可见，胰腺癌患者的免疫图谱中，含有较多种类且较高重复出现次数的胰腺癌特征序列;健康人的免疫图谱中，只有极少量胰腺癌特征序列;而未知健康状况受试者，有高于健康人的胰腺癌特征序列，说明此人有较高风险罹患胰腺癌。
d)将胰腺癌特征序列集中，将所有出现在两个及以上参与建模胰腺癌样本里的CDR3序列，按“所有参与建模胰腺癌样本里该序列单样本中重复出现次数CX的总和×包含该序列的参与建模胰腺癌样本数”从高到低排序，排名前100者即为胰腺癌TCR标志物CDR3序列，具体序列如SEQ ID NO.1～100所示。
实施例2验证胰腺癌TCR标志物CDR3序列集的特异性
1、采样及免疫图谱分析(方法参考专利ZL201910300069.9)
采集349名非胰腺癌的肿瘤患者、2名未知健康状况受试者的外周血(每人10mL)，通过高通量测序得到受试者和对照组的TCR的抗原决定簇3(CDR3)氨基酸序列，保证每个样本的功能性TCR的CDR3序列总数综合不低于30000;对每个样本的TCR的CDR3序列进行随机不放回抽样，使每个样本的CDR3序列数量总和均为30000。
2、从实施例1的对照组中随机挑选100名健康人及45名非肿瘤疾病病人。
3、根据来自实施例1的100名健康人、45名非肿瘤疾病病人、6名胰腺癌患者，以及实施例2新获取的349名非胰腺癌肿瘤患者、2名未知健康状况受试者的免疫图谱，分析其胰腺癌特征性指数。
其中，胰腺癌特征性指数定义为：某个样本中，属于胰腺癌特征序列集的所有CDR3序列在该样本内重复出现次数CX的总和。分析结果见下表2及附图2。胰腺癌组与健康人(p=1.9E-78)、非肿瘤疾病(p=6.6E-43)、其它肿瘤(p=9.9E-162)都有显著差异，这证明了胰腺癌特征序列集的特异性。
表2不同样本组的胰腺癌特征性指数
4、分析各组的胰腺癌特征指数(表3)，未知健康状况受试者(检测样本)中，2人的胰腺癌特征指数均高于“其它肿瘤”组的平均值+2×SD(16.1+2×41.1=98.2)，此2人具有较高风险罹患胰腺癌。与临床体检结果对照后，此2人确为胰腺癌患者。此实施例证明了利用胰腺癌特征序列集及胰腺癌特征性指数，预测受试者罹患胰腺癌风险的可行性。
表3胰腺癌特征性指数分析
健康人非肿瘤疾病其他肿瘤胰腺癌检测样本Mean11.8910.4216.0610978.672365.00SD11.9011.9741.082665.46202.23mean+2SD35.6934.3698.23
综上所述，本发明所述胰腺癌TCR标志物CDR3序列，确实具有显著的胰腺癌特异性，不仅可以用于胰腺癌预测受试者罹患胰腺癌风险，未来还可用于胰腺癌的生物免疫治疗。
