一种针对离子阱的调整方法和离子阱
技术领域
本发明涉及质谱分析领域，具体地说，涉及一种针对离子阱的调整方法和离子阱。
背景技术
质谱检测技术能够直观地展示带电样品物质的质荷比分布，实现对检测样品的定性和定量分析。目前，蛋白质组学在生命科学研究领域占据日益重要的位置。便携式的小型蛋白检测质谱具有广泛的适用场景和应用领域，因此将质谱仪的检测范围扩展至蛋白量级具有重大科研意义和实用价值。
离子阱检测器具有灵敏度和分辨率较高、易于小型化的特点。而且，在高气压下对样品进行检测，能够降低在传统离子阱质谱仪器中对高真空度的要求，更有助于蛋白质谱仪器的进一步小型化。同时，频率扫描共振激发的方式相较于射频幅度扫描激发方式更为低能耗。
分辨率是质谱仪的一项重要性能指标。然而，由于蛋白检测在离子阱质谱仪中的分辨率普遍偏低，因此在质谱仪小型化的基础上提高蛋白检测的分辨率是十分重要的。
发明内容
为了克服上述技术问题，本发明提供了一种针对离子阱的调整方法和离子阱，能够提高蛋白检测分辨率。
为了实现上述目的，本发明提供了一种针对离子阱的调整方法，包括：
根据碰撞模型，确定阻尼系数c；其中阻尼系数c与缓冲气体气压p的关系为
根据半峰宽
在离子阱上以所述射频扫描速度a施加主射频信号。
在一种可选的实施方式中，所述方法还包括：
校准实际气压值，使实际操作气压值比理论气压值低2mTorr～4mTorr。
在一种可选的实施方式中，所述碰撞模型包括：Langevin碰撞模型和硬球碰撞模型。
本发明还提供了一种离子阱，包括：
两两相对设置的四个电极；在x方向的一对电极上施加主射频信号；在y方向的另一对电极上施加相互反向的辅助射频信号；
其中，所述主射频信号以如前所述任意一种针对离子阱的调整方法来施加。
在一种可选的实施方式中，所述主射频信号的角频率与所述辅助射频信号的角频率比值固定。
本发明所述的针对离子阱的调整方法和离子阱，通过动态调整频率扫描速度，实现高效的高气压蛋白检测，提高蛋白检测分辨率。本发明所述的针对离子阱的调整方法和离子阱在动态频率扫描的低功耗模式下通过优化气压值和动态调整扫描速度，得到小型离子阱质谱仪在搞一起范围内对蛋白的高效优化检测结果。
附图说明
图1为本发明实施例提供的针对离子阱的调整方法的流程图；
图2a至图2c为本发明实施例提供的离子阱的结构图；
图3为扫速a＝4kHz/ms时细胞色素c的仿真结果与实验结果对照图；
图4为扫速a＝4kHz/ms和a＝2kHz/ms时BSA的仿真结果图；
图5a为BSA蛋白在3种不同主射频频率扫描速度时最有分辨率对应的气压值的示意图；
图5b展示了一种可以参考的主射频频率随时间动态变化的控制方式示意图；
图6为三种蛋白在超高气压范围(5-500mTorr)内的分辨率变化趋势的仿真结果图。
具体实施方式
下面参考附图来说明本发明的实施例。在本发明的一个附图或一种实施方式中描述的元素和特征可以与一个或更多个其他附图或实施方式中示出的元素和特征相结合。应当注意，为了清楚的目的，附图和说明中省略了与本发明无关的、本领域普通技术人员已知的部件或处理的表示和描述。
下面结合附图对本发明做进一步描述。
本发明实施例提供了一种针对离子阱的调整方法，如图1所示，包括：
101、根据碰撞模型，确定阻尼系数c；其中阻尼系数c与缓冲气体气压p的关系为：
其中ε0是真空介电常数，αp是缓冲气体分子极化率，k是玻尔兹曼常数，T是热力学温度，M是缓冲气体分子的质量，m是被检测物质的质量，z是被检测物质的带电量。
首先预先设置射频的电压值和共振激发点的位置。射频信号为正弦波信号。直流信号的电压设置为0V。
将射频信号的角频率Ω与辅助射频信号的角频率ω的比值设为固定值。该比值通常为1/2、1/3或与这2个值偏差为0.002以内的值，确定共振激发点qx的位置。
此后，对碰撞模型进行评估，选择合适的碰撞模型。
通用碰撞模型为Langevin碰撞模型和硬球碰撞模型。当检测蛋白在特定碰撞模型中的最小等效半径接近或大于其物理半径时，碰撞模型合理。由于Langevin碰撞模型在大多数情况下更符合实际碰撞效果，因此可以优先选择Langevin碰撞模型。
选择碰撞模型后，利用碰撞模型的阻尼系数公式，将c转换为实际可调控的气压值。
当采用Langevin碰撞模型时，阻尼系数c与缓冲气体气压p的关系可表示为上述公式1。
从该式可知，气压相同的情况时，不同的物质具有不同的阻尼系数。尤其对于蛋白及以上量级的物质，其阻尼系数远低于标准检测物的阻尼系数，比如reserpine。
102、确定射频扫描速度a。
具体的，根据
确定a。
其中qx是Mathieu方程的无量纲参数，Ω是主射频信号角频率。
半峰宽(Full Width at Half Maxima,FWHM)是衡量分辨率的一种直观测度指标，可表示为上述公式2。
其中a是扫描速度，单位是Hz/s。FWHM的最小值在
通过尝试多种扫描速度对半峰宽与气压变化的整体趋势进行分析研究。对主射频信号频率的扫描速度进行动态设置，从而高效利用激发时长，提高分辨率。
此后，还可以校准理论气压值，使实际气压值比理论气压值低约2mTorr至4mTorr，通常可以取值是3mTorr。将离子阱质谱仪的腔体气压值设置为校准后的气压值附近。
通过调整辅助射频信号的值，得到最佳分辨率。
103、在离子阱上以射频扫描速度a施加主射频信号。
本发明实施例还提供了一种离子阱，该离子阱包括两两相对设置的四个电极。如图2a所示，主射频信号施加在x方向的一对电极上，相互反向的辅助射频信号施加在y方向的另一对电极上。其中主射频信号按照前述实施例的调整方法来施加。
主射频信号的角频率与所述辅助射频信号的角频率比值固定。
如图2a至2c所示，x方向、y方向、z方向两两正交。
下面对理论部分进行阐述。
本发明实施例将电子倍增检测器设置在x方向的一侧，如图2c所示。因此将辅助射频信号即AC信号施加在x方向的一对电极上。共振激发点可根据以下公式3进行理论值计算：
其中，r0是离子阱的径向有效长度，Ω是主射频的角频率，V是主射频的电压幅值。
Langevin碰撞模型的碰撞截面面积可被表示为：
其中，v是离子运动速度，req是等效离子半径。为了得到σL的最小值，需要寻找到最大的离子运动速度。
碰撞会对离子速度产生随机的影响。在不考虑碰撞的情况下，离子运动轨迹可近似视为正弦运动：
u＝Acos(ω0t)(公式5)
其中，A是离子运动的振幅，ω0是离子的本征运动频率。离子本征运动角频率可被表示为：
其中βu是关于qx的函数。
对离子运动轨迹求导可以得到离子运动速度的最大值为：
vmax|＝Aω0(公式7)
由于稳定运动的离子的运动振幅不可能超过离子阱的径向有效尺寸r0，因此A的最大值为r0。离子运动的本征频率与共振激发点处的主射频的频率比值固定，因此可以根据选定的共振激发点的值对特定离子的本质频率进行估算。
以BSA为例，设置ω0/Ω＝1/3，主射频电压幅值为115V，离子阱的径向有效长度为4mm，可以通过计算得到带+14电荷的BSA和带+40电荷的BSA的有效半径分别为3.8nm和4.7nm，均不小于BSA的物理尺寸半径3.8nm，因此可以用Langevin碰撞模型对BSA的情况进行预算。
半峰宽(FWHM)是衡量分辨率的一种直观测度指标，可被表示为：
其可在
相较于传统的仅通过调整辅助射频信号的电压VAC得到最优分辨率的方法，本发明实施例通过事先得到最合适的气压范围，并将质谱仪的气压设定为修正后的预算气压值，能够进一步提高被检测物质的分辨率，特别是对于较大的蛋白样品。分辨率的提高增强了仪器对蛋白的检测性能。
图2a、图2b、图2c展示了离子阱的构造和相关参数对应的位置。图2a显示在xOy平面中，径向有效半径r0为4mm。将DC电压设置为0，那么射频信号可被表示为VRFcos(Ωt)。在y方向的一对电极上施加相同的主射频电压。在x方向的一对电极上施加互相反相的辅助射频信号,即AC信号VACcos(Ωt)。图2b中的yOz平面展示的是图2a中x方向右侧电极的结构示意图。轴向z0的长度为40mm，在中部沿z方向开有一个供离子弹射的槽口。图2c中的电子倍增检测器正对槽口，以便进行有效的离子检测。在离子阱z轴方向的前后两个端盖电极上施加相同的直流信号，实现轴向对离子运动的束缚。
下面通过仿真和实验进行分析。
实施例1
本实施例对细胞色素c进行检测。细胞色素c的质量约为12369Da，电荷分布主要位于+16至+12。将细胞色素c用纯水稀释后，加入等量的甲醇溶液，配置成100ppm的样品溶液。选用Nano-ESI离子源对样品进行离子化，离子源电压设置为-970V～-1100V之间。进样时长设置为200ms，冷却时长设置为100ms，激发时长设置为100ms。主射频信号的电压幅值为115V，频率范围设置为从600kHz扫描至200kHz，可知频率扫描速度a的值为4kHz/ms。AC信号频率与主射频频率的比值设置为1/3。优化AC信号的电压值得到最佳分辨率。
仿真参数设置与实验相同。
仿真得到的结果如图3(a-c)所示，实验得到的结果如图3(d-f)所示。在仿真过程中，并未将同位素的影响并入结果(见图3(a-c)中的单个靠底部峰形)。由于当前质谱仪的分辨率无法将间隔小于1Th的同位素峰进行分离，因此需要将细胞色素c的同位素峰对峰展宽的影响考虑其中。首先根据自然元素丰度计算得到的各同位素峰的强度，再以1/14Th的间距将同位素峰依此进行排列，见图3(a)中箭头指向的叠加峰形。将同位素峰簇的强度进行叠加，得到最终与实验结果更为接近的峰形，见图3(a-c)中的较高的峰形。因为实验中存在空间电荷效应、高阶场等多重因素的影响，而仿真是在纯净四极场的理想条件下进行的，因此会存在一些误差，但两者的变化趋势相同。仿真对于实验有着十分重要的指导意义。
根据本发明实施例前述的处理方法中的描述，纠偏后细胞色素c的最优气压值位于0～1mTorr的范围中，因此在1～10mTorr的气压范围应呈现分辨率随气压增大而降低的现象。在1mTorr、5mTorr和10mTorr这3种气压节点上，对具有+14电荷状态的细胞色素c进行仿真，得到的半峰宽分别为0.803Th、1.296Th和1.825Th。仿真结果的半峰宽随气压的增大而增大，即分辨率随气压的增大而降低，与纠偏后的理论结果相符。实验在3.79mTorr、4.65mTorr和5.52mTorr的气压环境下分别进行。带+14电荷的细胞色素c对应质谱峰的半峰宽分别为1.37Th、1.72Th和1.93Th。实验结果的变化趋势符合仿真预期，且实验半峰宽的值约为仿真结果的1.4倍。这是因为离子阱内实际气压值高于示数显示气压值，因此实验得到的半峰宽大于仿真结果。由于仿真结果与实验结果具有良好的匹配度，因此可以根据仿真结果对实验结果进行预判。
实施例2
本实例对带+14电荷的BSA进行研究。
虽然分辨率的决定性因素是主射频频率的扫描速度，但在能实现的最佳扫描速度条件下，寻找最佳气压值点仍是提高分辨率的关键性因素。BSA的质量约为66430Da，带电状态受到溶液中pH的影响，例如在Native状态下带+1个电，在pH＝3时的带电范围主要集中在+35至+60。本次实施例选取BSA带+14电荷的状态，以便更清晰地观察到FHWM随气压变化的转折部分的完整曲线。
在仿真中设置主射频的电压值为115V，主射频的频率扫描速度a的值为4kHz/ms。AC信号频率与主射频频率的比值设置为1/3。理论计算得到的FWHM随气压变化的曲线如图4中光滑曲线所示。图4中，折线上的节点是仿真在优化Vac值后得到的最佳FWHM。通过理论计算，纠偏后得到带+14电荷的BSA约在17mTorr时取得最优值。在仿真过程中进行VAC值的优化，寻找FWHM最小值，得到最佳分辨。图4展示的仿真结果中显示，BSA(+14)的FWHM在气压范围为16～18mTorr时取得最小值。当主射频的频率扫描速度a的值变为2kHz/ms时，理论结果纠偏后的最佳气压值为11mTorr，图4仿真结果中BSA(+14)在10～12mTorr时能达到FWHM的最小值。理论和仿真结果说明大蛋白更适合在高气压进行检测。
在如上设置中，带+14电荷的BSA的共振激发点对应的主射频频率值为137.3953kHz，带+15电荷的BSA的共振激发点对应的主射频频率值为142.2177kHz。为与实际可操作实验条件进行匹配，将激发时长设置为100ms，频率扫描范围设置为500kHz-100kHz。设置足够的冷却时长，使得离子在激发前已经稳定在离子阱中心附近。射频扫描的一种可选方案如图5b所示。由于BSA的最小FWHM值位于对扫速改变敏感性较高的区域，如图5a所示，因此将扫描速度尽可能地降低，能够实现这两种带电状态的BSA蛋白的最优分辨。
实施例3
本实例对3种不同状态的不同种类蛋白进行研究，展示它们在更高气压范围内FWHM随的气压变化趋势。三种蛋白分别是细胞色素c的质量为12369Da，带电荷数为+14；BSA的质量为66430Da，带电荷数为+14；Serum amyloid P质量为125kDa带+26。
在仿真中设置主射频的电压值为300V0-p，主射频的频率扫描速度a的值为4kHz/ms。AC信号频率与主射频频率的比值设置为1/3。应当注意的是，主射频电压幅值的增大有助于分辨率的提高。仿真选取的气压点分别为1mTorr、10mTorr、50mTorr、100mTorr、150mTorr、200mTorr、300mTorr、400mTorr、500mTorr和600mTorr。图6所示的3种蛋白的仿真结果呈现相似的变化趋势：在100mTorr～150mTorr以下，FWHM随气压变化的趋势符合理论计算曲线，即在主射频频率扫描速度确定的情况下，存在最优气压值，使得FWHM最小，得到最优分辨率；在超过150mTorr的情况下，FWHM呈先下降后逐渐平稳的趋势。这是因为当气压超过一定数值时，Vac的最优值变为临界状态。这意味着当Vac超过临界范围(约0.5V的范围)时，会出现能量耦合过大，使得离子在刚进入阱就被弹射的现象；当Vac低于临界范围最小值时，FWHM会随着Vac的增大而变小；只有当Vac取到临界范围内的值时，会得到最小的FWHM，使得分辨率最高。
本发明实施例提供了一种能够实现在高气压(5mTorr-500mTorr)环境下对蛋白质和微生物进行高分辨质谱检测的小型离子阱，以及进一步构成的质谱仪，将检测范围扩展至蛋白量级。主射频信号与辅助信号均采用正弦波频率扫描的方式，以共振激发模式实现离子弹射。依照理论和仿真，当主射频的频率扫描速度确定时，分辨率在特定气压值处存在最优值；超过气压最优值后，分辨率对扫速的敏感度逐渐降低。在低敏感区域使用较快扫速，在高敏感区域采用较低频率扫描速度，以实现蛋白高效而快速的检测。因此，检测含有多种带电状态的蛋白时，通过动态调整整体激发阶段的频率扫描速度，以具体场景需求为导向，实现高效的高气压蛋白检测。在高于能采用的最小扫速以上的扫速范围，通过理论公式对不同物质的最优气压范围进行预算，动态调整射频扫描速度，高效地实现特定条件下的最佳分辨率。本发明实施例在动态频率扫描的低功耗模式下，通过优化气压值和动态地调整扫速，得到小型离子阱质谱仪在高气压范围内对蛋白的高效最优检测。
本发明实施例采用幅值固定且射频频率扫描的共振激发方式实现离子弹射，降低了传统采用的射频频率固定且幅度增大的边界激发方式的能量消耗，实现了相同程度的离子弹射。同时，在特定气压环境下，对于拥有多种带电状态的检测物质，通过动态调整射频频率，以具体应用需求为导向，高效率地利用激发时长，实现被检测物的更高分辨率。本发明实施例所提供的小型离子阱蛋白检测质谱仪通过分辨率随气压的变化趋势，设计射频动态扫描方案，提高被检测物的分辨率，将质谱仪的检测质量范围扩展至蛋白、微生物量级。
虽然已经详细说明了本发明及其优点，但是应当理解在不超出由所附的权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可以进行各种改变、替代和变换。而且，本申请的范围不仅限于说明书所描述的过程、设备、手段、方法和步骤的具体实施例。本领域内的普通技术人员从本发明的公开内容将容易理解，根据本发明可以使用执行与在此所述的相应实施例基本相同的功能或者获得与其基本相同的结果的、现有和将来要被开发的过程、设备、手段、方法或者步骤。因此，所附的权利要求旨在在它们的范围内包括这样的过程、设备、手段、方法或者步骤。
