一种受体试剂在诊断主体心肌损伤中的用途
技术领域
本发明属于化学发光检测领域，具体涉及一种受体试剂在诊断主体心肌损伤中的用途。
背景技术
心血管疾病是危害人类健康及生命的严重疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。其中，急性心肌梗死最常见、最危险。个人行为方式和生活习惯的转变，使中国人发生心血管疾病的风险迅速赶超美国等发达国家。
心血管检验是整个心血管领域中的“瓶颈”学科，因为只有在尽可能短的时间内正确诊断疾病，才能早发现、早治疗，最大程度防止致残、致死后果，改善患者预后和生活质量。近年来，对于心血管生物标志物的研究日益深入，积累了大量临床经验和证据，逐步明确了它们的临床适应症和新的研究领域，推动了他们的临床应用。生物标记物的检测可直接影响心血管疾病患者的临床诊断、危险分层、治疗方案选择和预后判断。心肌标志物全称为心脏损伤早期标志物，是指心脏损伤后6小时内血中水平升高的标志物，是临床中诊断心肌梗死、心肌缺血、心衰等心脏疾病的重要检测指标，主要包括心肌肌钙蛋白I(cTnⅠ)、肌红蛋白(MYO)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)和N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)等。随着科技不断发展，血液中的心衰标志物检测被逐步应用于临床，给心血管疾病的早期诊断、预后转归提供了方法。例如：NT-proBNP是BNP激素原分裂后没有活性的N-末端片段，与BNP相比，半衰期更长，更稳定，其浓度可以反映短暂时间内新合成的而不是贮存的BNP释放，因此更能反映BNP通路的激活。血浆NT-proBNP水平随心衰程度加重而升高。在急性心衰的诊断中，NT-proBNP有着重要意义。
目前，以上标志物已经被医院广泛接受。也有多种单独检测上述指标的试剂盒面市。但是目前采取的主流方法是非均相的测定方法(例如ELISA和磁微粒化学发光法等)。虽然能够测定上述标志物，但是存在检测速度慢、检测灵敏度低、检测成本高等缺点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种受体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途，利用所述受体试剂进行检测时既有超高的灵敏度，又具有很宽的检测量程。
为此，本发明第一方面提供了一种受体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途，其中所述方法包括：将来自主体的体液与受体试剂和供体试剂相接触，反应后生成待测混合物；用激发光至少一次激发所述待测混合物，检测由此产生的化学发光的信号强度；根据所述化学发光的信号强度定量计算所述体液中至少一种心肌标志物的浓度，从而判断主体是否患有心肌损伤；
其中，所述受体试剂包含能够与活性氧作用产生化学发光的受体颗粒，且控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5％；所述供体试剂包含在激发态下能够生成活性氧的供体颗粒
所述心肌标志物选自肌钙蛋白T、肌钙蛋白I、肌钙蛋白激酶同工酶、肌红蛋白、白介素6和乳酸脱氢中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8％；优选地，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥10％。
在本发明的一些优选的实施方式中，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤40％；更进一步优选地，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤20％。
在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布呈现多分散性。
在本发明的一些具体实施方式中，所述粒径分布变异系数C.V值是通过Gaussian分布计算得到。
在本发明的另一些具体实施方式中，利用Gaussian分布分析法，所述受体颗粒在受体试剂中Gaussian分布曲线呈现两个或两个以上的峰。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述受体试剂中包含至少两种平均粒径分布的受体颗粒。
在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒包括发光组合物和载体，所述发光组合物填充于载体中和/或附着于载体上。
在本发明的一些具体实施方式中，所述发光组合物能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号，其包含化学发光化合物和金属螯合物。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述化学发光化合物选自烯烃化合物，优选选自二甲基噻吩、双丁二酮化合物、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-N-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物，更优选选自二甲基噻吩及其衍生物。
在本发明的一些具体实施方式中，所述金属螯合物的金属是稀土金属或VIII族金属，优选选自铕、铽、镝、钐、锇和钌，更优选为铕。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂：NHA、BHHT、BHHCT、DPP、TTA、NPPTA、NTA、TOPO、TPPO、BFTA、2,2-二甲基-4-全氟丁酰-3-丁酮(fod)、2,2’-联吡啶(bpy)、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。
在本发明的一些实施方式中，所述载体选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠、粒子和微球；优选为珠和微球。
在本发明的另一些实施方式中，所述载体是磁性或非磁性粒子。
在本发明的一些实施方式中，所述载体材料选自天然的、合成或改性的天然存在的聚合物，其包括但不限于：琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯。
在本发明的另一些实施方式中，所述载体为醛基化乳胶颗粒。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述载体的平均粒径的尺寸范围为50nm-1μm；优选为100nm-500nm；更优选为150nm-400nm；最优选为190nm-300nm。
在本发明的一些实施方式中，所述载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层，其中第一多糖层与第二多糖层自发关联。
在本发明的另一些实施方式中，所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。
在本发明的一些具体实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，并且所述多糖的所述连续层通过所述连续层的所述官能团与所述前一层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。
在本发明的一些具体实施方式中，所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述胺反应性官能团是醛基或羧基。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第一多糖层自发地与所述载体相关联。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。
在本发明的一些具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种；优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地与报告分子连接，所述报告分子能够与待测目标分子特异性结合。
在本发明的一些具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地与特异性结合配对成员中的一员结合。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述特异性结合配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素组成的一对物质；优选地，所述特异性结合配对成员为生物素-亲和素。
在本发明的一些具体实施方式中，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
需要说明的是，直接地或间接地与报告分子或特异性结合配对成员中的一员连接后的受体颗粒，其在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值仍然≥5％。在本发明的一些实施方式中，上述直接地或间接地与报告分子或特异性结合配对成员中的一员连接后的受体颗粒粒径，其在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8％；优选地，粒径分布的变异系数C.V值≥10％；进一步优选地，粒径分布的变异系数C.V值≤40％；更进一步优选地，粒径分布的变异系数C.V值≤20％。在本发明的一些优选的实施方式中，所述上述直接地或间接地与报告分子或特异性结合配对成员中的一员连接后的受体颗粒的粒径分布呈现多分散性。
在本发明的一些实施方式中，所述供体颗粒直接地或间接地与报告分子连接或与特异性结合配对成员中的一员结合。
在本发明的另一些实施方式中，所述来自主体的体液利用稀释液稀释后再与受体试剂和供体试剂相接触。
在本发明的一些实施方式中，所述化学发光的检测波长为520～620nm。
在本发明的另一些实施方式中，采用600～700nm的红色激发光进行激光照射。
在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的浓度为1ug/mL-1000ug/mL；优选为10ug/mL-500ug/mL；更优选为20ug/mL-200ug/mL。
在本发明的另一些实施方式中，所述活性氧为单线态氧。
在本发明的一些实施方式中，所述体液来自主体的全血、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿液、泪液或脊髓液。
本发明的有益效果为：本发明提供一种受体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途，所述方法通过在来自主体的体液加入包含受体颗粒的受体试剂，其中受体颗粒粒径分布变异系数C.V值≥5％，使得本发明所述方法对心肌损伤标志物的检测性能较现有技术得到大幅提升，既有超高的灵敏度，又有很宽的检测量程。
附图说明
下面将结合附图对本发明作进一步说明。
图1为实施例1中制备的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布曲线图。
图2为实施例1制备的包被葡聚糖的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯乳胶微球的Gaussian分布图
图3为实施例1制备的平均粒径在250nm左右的受体颗粒的Gaussian分布图。
图4为实施例1制备的粒径在110nm左右的受体颗粒的Gaussian分布图。
图5为实施例1制备的粒径在110nm左右的受体颗粒的Nicomp分布图。
图6为实施例1制备的粒径在350nm左右的的受体颗粒的Gaussian分布图。
图7为实施例1制备的粒径在350nm左右的的受体颗粒的Nicomp分布图。
图8为实施例2中混合受体颗粒粒径分布的Gaussian分布图。
图9为实施例2中混合受体颗粒粒径分布的Nicomp分布图。
具体实施方式
为使本发明容易理解，下面将详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在提供了数值范围的情况下，应当理解所述范围的上限和下限和所述规定范围中的任何其他规定或居间数值之间的每个居间数值均涵盖在本发明内。这些较小范围的上限和下限可以独立包括在较小的范围中，并且也涵盖在本发明内，服从规定范围中任何明确排除的限度。在规定的范围包含一个或两个限度的情况下，排除那些包括的限度之任一或两者的范围也包含在本发明中。
除非另有定义，本文使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。
Ⅰ.术语
本发明所述用语“活性氧”是指机体内或者自然环境中由氧组成，含氧并且性质活泼的物质的总称，主要为一种激发态的氧分子，包括氧的一电子还原产物超氧阴离子(O2·-)、二电子还原产物过氧化氢(H2O2)、三电子还原产物羟基自由基(·OH)以及一氧化氮和单线态氧(1O2)等。
本发明所述用语“供体颗粒”是指含有通过能量或者活性化合物的激活后能够产生与受体颗粒反应的诸如活性氧的活性中间体的敏化剂的颗粒。供体颗粒可以是光活化的(如染料和芳香化合物)或者化学活化的(如酶、金属盐等)。在本发明一些具体实施例中，所述供体颗粒为填充有光敏剂的高分子微球，所述光敏剂可以是本领域已知的光敏剂，优选相对光稳定且不与单线态氧有效反应的化合物，其非限定性的例子包括例如美国专利US5709994(该专利文献在此全文引为参考)公开的亚甲基蓝、玫瑰红、卟啉、酞菁和叶绿素等化合物，以及这些化合物的具有1-50个原子取代基的衍生物，所述取代基用于使得这些化合物更具有亲脂性或更具有亲水性、和/或作为连接至特异性结合配对成员的连接基团。本领域技术人员已知的其他光敏剂的例子也可以在本发明中使用，例如美国专利US6406913中记载的内容，该专利文献并入本文以供参考。
本发明所述用语“受体颗粒”是指含有能够与活性氧反应可以产生可检测信号的化合物的颗粒。供体颗粒被能量或者活性化合物诱导激活并释放高能态的活性氧，该高能态的活性氧被近距离的受体颗粒俘获，从而传递能量以激活所述受体颗粒。在本发明的一些具体实施方式中，所述受体颗粒包含发光组合物和载体，所述发光组合物填充于载体中和/或包被于载体表面。本发明所述“载体”选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠、粒子和微球，其可以是本领域技术人员所公知的微球或微粒，其可以是任何尺寸的，其可以是有机的或是无机的，其可以是可膨胀或不可膨胀的，其可以是多孔的或非多孔的，其具有任何密度，但优选具有和水接近的密度，优选能漂浮于水中，且由透明、部分透明或不透明的材料构成。所述载体可以有或没有电荷，当带有电荷时，优选是负电荷。所述载体可以是乳胶颗粒或是含有有机或无机聚合物的其他颗粒、脂双层如脂质体、磷脂囊泡、小油滴、硅颗粒、金属溶胶、细胞和微晶染料。
本发明中，所述“化学发光化合物”即一种被称作为标记物的化合物，可进行化学反应以便引起发光，比如通过被转化为在电子激发态下形成的另一种化合物。激发态可以是单线态或是三重激发态。激发态可弛豫到基态直接发光，或者是通过将激发能量传递到发射能量受体，从而自身恢复到基态。在此过程中，能量受体颗粒将被跃迁为激发态而发光。
本发明中，所述“能够直接或间接地结合”是指指定的实体物能够特异地结合到实体物上(直接地)，或者指定的实体物能够特异性地结合至特异性结合配对成员上(间接地)。
本发明所述“特异性结合配对成员”是指能够相互特异性结合的一对物质。
本发明所述“粒径分布变异系数C.V值”是指在纳米粒度仪的检测结果中，粒径在高斯分布中的变异系数。变异系数的计算公式为：C.V值＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％。
本发明所述用语“Nicomp分布”是指美国PSS纳米粒度仪NICOMP中的一种算法分布。相对于Gaussian单峰算法，Nicomp多峰算法对于多组分、粒径分布不均匀液态分散体系的分析以及胶体体系的稳定性分析具有独特优势。
本发明所述用语“来自主体的体液”是指待测的含有或疑似含有心肌标志物的一种混合物。所述体液来自主体的全血、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿液、泪液或脊髓液。来自主体的体液可以在使用前根据需要利用稀释液进行稀释。例如，为了避免HOOK效应，可以在上机检测前使用稀释液对来自主体的体液进行稀释后再在检测仪器上进行检测。
本发明所述用语“抗体”以最广含义使用，包括任何同种型的抗体，保留对抗原的特异性结合的抗体片段，包括但不限于Fab、Fv、scFv、和Fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体、和包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白的融合蛋白。在任何需要的情况下，抗体可以进一步与其它部分，诸如特异性结合配对成员中的一员，例如生物素或亲和素(生物素-亲和素特异性结合配对成员中的一员)等缀合。
本发明所述用语“抗原”是指能够刺激机体产生免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应的物质。
本发明所述用语“结合”指由于例如共价、静电、疏水、离子和/或氢键等相互作用，包括但不限于如盐桥和水桥等相互作用引起的两个分子间的直接联合。
本发明所述用语“特异性结合”，是指两种物质之间的相互辨别和选择性结合反应，从立体结构角度上说就是相应的反应物之间构象的对应性。在本发明公开的技术思想下，特异性结合反应的检测方法包括但不限于：双抗体夹心法、竞争法、中和竞争法、间接法或捕获法。
Ⅱ.实施方式
下面将结合实施例更详细地说明本发明。
现有的常识为：微球的粒径尺寸越均一，利用该微球进行的均相化学发光检测的性能就越好。因此目前针对均相化学发光中采用的微球的研究趋于获得更均一粒径的微球。本申请的发明人通过研究后发现，采用粒径尺寸均一的微球进行均相化学发光检测时，检测结果的灵敏度和检测量程不能同时保障。但是通过采用粒径尺寸均一性合适的微球(如微球粒径分布的变异系数＞5％)，既能保障光激化学发光检测的灵敏度，又能拓宽检测量程。
本发明的发明人通过控制受体试剂中受体颗粒的粒径分布，进而控制每个受体颗粒表面报告分子(如，抗体/抗原)的量(小粒径微球比表面积大，单位质量微球表面报告分子的量多，大粒径微球比表面积小，单位质量微球表面报告分子的量少)。受体颗粒在受体试剂中的粒径分布的变异系数越大，不均一程度越高，相当于体系中存在各种尺寸不一的受体颗粒，从而使得本发明所述方法既有较高的灵敏度，又有很宽的检测量程。
因此，本发明第一方面所涉及的受体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途，其中所述方法包括：将来自主体的体液与受体试剂和供体试剂相接触，反应后生成待测混合物；用激发光至少一次激发所述待测混合物，检测由此产生的化学发光的信号强度；根据所述化学发光的信号强度定量计算所述体液中至少一种心肌标志物的浓度，从而判断主体是否患有心肌损伤；
其中，所述受体试剂包含能够与活性氧作用产生化学发光的受体颗粒，且控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5％；所述供体试剂包含在激发态下能够生成活性氧的供体颗粒；
所述心肌标志物选自肌钙蛋白T(troponinT)、肌钙蛋白I(troponinI)、肌钙蛋白激酶同工酶(CK-MB)、肌红蛋白(MYO)、白介素6和乳酸脱氢中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8％；优选地，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥10％。
在本发明的一些优选的实施方式中，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤40％；更进一步优选地，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≤20％。
值得注意的是，本发明所述的受体颗粒粒径分布变异系数C.V值指的是受体颗粒包被上所需的物质后的粒径分布变异系数C.V值。
在本发明的一些具体实施方式中，控制所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值为5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％和40％等。
在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的粒径分布呈现多分散性。
在本发明的一些具体实施方式中，所述粒径分布变异系数C.V值是通过Gaussian分布计算得到。
在本发明的另一些具体实施方式中，利用Gaussian分布分析法，所述受体颗粒在受体试剂中Gaussian分布曲线呈现两个或两个以上的峰。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述受体试剂中包含至少两种平均粒径分布的受体颗粒。
在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒包括发光组合物和载体，所述发光组合物填充于载体中和/或附着于载体上。
在本发明的一些具体实施方式中，所述发光组合物能够与活性氧反应产生可检测的化学发光信号，其包含化学发光化合物和金属螯合物。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述化学发光化合物选自烯烃化合物，优选选自二甲基噻吩、双丁二酮化合物、二氧杂环己烯、烯醇醚、烯胺、9-亚烷基苍耳烷、9-亚烷基-N-9,10二氢化吖啶、芳基乙醚烯、芳基咪唑和光泽精以及它们的衍生物，更优选选自二甲基噻吩及其衍生物。
在本发明的一些具体实施方式中，所述金属螯合物的金属是稀土金属或VIII族金属，优选选自铕、铽、镝、钐、锇和钌，更优选为铕。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述金属螯合物包含选自下列的螯合剂：4’-(10-甲基-9-蒽基)-2,2’:6’2”-联三吡啶-6,6”-二甲胺]四乙酸(MTTA)、2-(1’,1’,2’,2’,3’,3’-七氟-4’,6’-己二酮-6’-基)-萘(NHA)、4,4’-二(2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基)-邻-三联苯(BHHT)、4,4’-二(1”,1”,1”,2”,2”,3”,3”-七氟-4”,6”-己二酮-6”-基)-氯代磺基-邻-三联苯(BHHCT)、4,7-联苯-1,10-菲咯啉(DPP)、1,1,1-三氟丙酮(TTA)、3-萘酰-1,1,1-三氟丙酮(NPPTA)、萘基三氟丁二酮(NTA)、三辛基氧化膦(TOPO)、三苯基氧化膦(TPPO)、3-苯甲酰-1,1,1-三氟丙酮(BFTA)、2,2-二甲基-4-全氟丁酰-3-丁酮(fod)、2,2’-联吡啶(bpy)、联吡啶基羧酸、氮杂冠醚、氮杂穴状配体和三辛基氧化膦以及它们的衍生物。
在本发明的一些实施方式中，所述载体选自带、片、棒、管、孔、微滴定板、珠、粒子和微球；优选为珠和微球。
在本发明的另一些实施方式中，所述载体是磁性或非磁性粒子。
在本发明的一些实施方式中，所述载体材料选自天然的、合成或改性的天然存在的聚合物，其包括但不限于：琼脂糖、纤维素、硝化纤维素、醋酸纤维素、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚(4-甲基丁烯)、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、尼龙、聚丁酸乙烯或聚丙烯酸酯。
在本发明的另一些实施方式中，所述载体为醛基化乳胶颗粒。
在本发明的一些优选的实施方式中，所述载体的平均粒径的尺寸范围为50nm-1μm；优选为100nm-500nm；更优选为150nm-400nm；最优选为190nm-300nm。
在本发明的一些实施方式中，所述载体的表面包被至少两个连续多糖层的涂层，其中第一多糖层与第二多糖层自发关联。
在本发明的另一些实施方式中，所述连续多糖层中的每一层自发地与前一多糖层中的每一层相关联。
在本发明的一些具体实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，所述连续多糖层的所述官能团与所述前一多糖层的所述官能团所带电荷相反。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述多糖具有侧基官能团，并且所述多糖的所述连续层通过所述连续层的所述官能团与所述前一层的所述官能团之间的反应与所述前一多糖层共价连接。
在本发明的一些具体实施方式中，所述连续多糖层的所述官能团在胺官能团和胺反应性官能团之间交替。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述胺反应性官能团是醛基或羧基。
在本发明的一些具体实施方式中，所述第一多糖层自发地与所述载体相关联。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层具有至少一个侧基官能团。
在本发明的一些具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团选自醛基、羧基、巯基、氨基、羟基和马来胺基中的至少一种；优选选自醛基和/或羧基。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地与报告分子连接，所述报告分子能够与待测目标分子特异性结合。
在本发明的一些具体实施方式中，所述涂层的最外一层多糖层的侧基官能团直接地或间接地与特异性结合配对成员中的一员结合。
在本发明的另一些具体实施方式中，所述特异性结合配对成员选自抗体、抗体片段、配体、寡核苷酸、寡核苷酸结合蛋白、凝集素、半抗原、抗原、免疫球蛋白结合蛋白、抗生物素蛋白、亲和素或生物素组成的一对物质；优选地，所述特异性结合配对成员为生物素-亲和素。其中，所述亲和素选自卵白亲和素、链霉亲和素、卵黄亲和素、中性亲和素及类亲和素，优选为中性亲和素和/或链霉亲和素。
在本发明的一些具体实施方式中，所述多糖选自含有三个或更多个未修饰或修饰的单糖单元的碳水化合物；优选选自葡聚糖、淀粉、糖原、菊粉、果聚糖、甘露聚糖、琼脂糖、半乳聚糖、羧基葡聚糖和氨基葡聚糖；更优选选自葡聚糖、淀粉、糖原和聚核糖。
需要特别说明的是，直接地或间接地与报告分子或特异性结合配对成员中的一员连接后的受体颗粒，其在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥5％。在本发明的一些实施方式中，上述直接地或间接地与报告分子或特异性结合配对成员中的一员连接后的受体颗粒粒径，其在受体试剂中的粒径分布变异系数C.V值≥8％；优选地，粒径分布的变异系数C.V值≥10％；进一步优选地，粒径分布的变异系数C.V值≤40％；更进一步优选地，粒径分布的变异系数C.V值≤20％。在本发明的一些优选的实施方式中，所述上述直接地或间接地与报告分子或特异性结合配对成员中的一员连接后的受体颗粒的粒径分布呈现多分散性。
在本发明的一些优选的实施方式中，先将所述来自主体的体液与受体试剂接触后，再与供体试剂接触。
在本发明的一些实施方式中，所述供体颗粒直接地或间接地与报告分子连接或与特异性结合配对成员中的一员结合。
为进一步提高最终检测结果的准确性和待测样品的稳定性，在本发明的另一些实施方式中，所述来自主体的体液利用稀释液稀释后再与受体试剂和供体试剂相接触。
在本发明的一些实施方式中，所述化学发光的检测波长为520～620nm；优选为610～620nm，更优选为615nm。
在本发明的另一些实施方式中，采用600～700nm的红色激发光进行激光照射；优选采用640-680nm的红色激发光进行激光照射；更优选采用660nm的红色激发光进行激光照射。
在本发明的一些实施方式中，所述受体颗粒在受体试剂中的浓度为1ug/mL-1000ug/mL；优选为10ug/mL-500ug/mL；更优选为20ug/mL-200ug/mL。
在本发明的另一些实施方式中，所述活性氧为单线态氧。
在本发明的一些实施方式中，所述体液来自主体的全血、血清、血浆、痰液、淋巴液、精液、阴道粘液、粪便、尿液、泪液或脊髓液。
Ⅲ.实施例
实施例1：偶联抗体Ⅰ(cTnI抗体)的受体颗粒溶液的制备
(一)平均粒径在250nm左右的偶联抗体的受体颗粒的制备
1.1醛基聚苯乙烯乳胶微球的制备及表征过程
1)准备100ml的三口烧瓶，加入40mmol苯乙烯、5mmol丙烯醛、10ml水，搅拌10min后通N2 30min；
2)称取0.11g过硫酸铵和0.2g氯化钠，溶于40ml水中配置成水溶液。将该水溶液加入到步骤1的反应体系中，继续通N2 30min；
3)将反应体系升温至70℃，反应15小时；
4)将反应完成后的乳液冷却至室温，用合适的滤布过滤。得到的乳液用去离子水过次离心沉降清洗，直至离心初的上清液的电导率接近去离子水，然后用水稀释，以乳液形式保存；
5)由纳米粒度仪测得此时乳胶微球粒径的Gaussian分布平均粒径为204.7nm，变异系数(C.V.)＝5.01％，Gaussian分布曲线如图1所示。由电导滴定法测得该乳胶微球醛基含量为268nmol/mg。
1.2发光组合物的填埋过程及表征
1)准备25ml的圆底烧瓶，加入0.1g二甲基噻吩衍生物和0.1g铕(Ⅲ)配合物(MTTA-EU3+)，10ml 95％乙醇，磁力搅拌，水浴升温至70℃，获得配合物溶液；
2)准备100ml的三口烧瓶，加入10ml 95％乙醇、10ml水和10ml浓度为10％、步骤1.1中获得的醛基聚苯乙烯乳胶微球，磁力搅拌，水浴升温至70℃；
3)将步骤1)中的配合物溶液缓慢滴加至步骤2)中的三口烧瓶中，70℃反应2小时后停止搅拌，自然冷却；
4)将上述乳液离心1小时，30000G，离心后弃去上清液，得到填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球。
1.3受体颗粒的表面包被葡聚糖
1)取50mg氨基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中，加入5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液，30℃避光搅拌溶解；
2)取100mg已制备好的填埋有发光组合物的醛基聚苯乙烯微球，加入到氨基葡聚糖溶液中搅拌2小时；
3)将10mg硼氢化钠溶于0.5mL50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中，30℃避光反应过夜；
4)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液，加入50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液定容，使其终浓度为20mg/ml；
5)取100mg醛基葡聚糖固体于20mL圆底烧瓶中，加入5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液，30℃避光搅拌溶解；
6)将上述微球加入到醛基葡聚糖溶液中搅拌2小时；
7)将15mg硼氢化钠溶于0.5mL 50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液后滴加到上述反应液中，30℃避光反应过夜；
8)将反应后的混合液30000G离心后弃去上清液，加入50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液超声分散。重复离心清洗三次后用50mM/pH＝10碳酸盐缓冲液定容，使其终浓度为20mg/ml。
9)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径为241.7nm，变异系数(C.V.)＝18.40％(如图2所示)。
1.4抗体的偶联过程
1)将配对抗体Ⅰ透析至PH值＝10的50mM CB缓冲液，测得浓度为1mg/ml。
2)在2ml离心管中加入0.5ml(3)中获得的受体颗粒以及0.5ml步骤1)获得的配对抗体Ⅰ，混匀后加入100μl 10mg/ml NaBH4溶液(50mM CB缓冲液)，2-8℃反应4小时。
3)反应完毕后加入0.5ml 100mg/ml BSA溶液(50mM CB缓冲液)，2-8℃反应2小时。
4)反应完毕后将离心45min，30000G，离心后弃去上清液，用50mM MES缓冲液重新悬浮。重复离心清洗四次，并稀释至终浓度为100μg/ml，获得偶联抗体Ⅰ的受体颗粒溶液。
5)由纳米粒度仪测得此时微球粒径的Gaussian分布平均粒径值为249.9nm，变异系数(C.V值)＝11.60％(如图3所示)。
(二)平均粒径在110nm左右的偶联抗体的受体颗粒的制备
制备方法同上述(一)中平均粒径为250nm左右的受体颗粒的制备过程，由纳米粒度仪测得该受体颗粒粒径的Gaussian分布(如图4所示)平均粒径值为108.2nm，变异系数(C.V.)＝7.5％。Nicomp分布为单峰(如图5所示)。
(三)平均粒径在350nm左右的偶联抗体的受体颗粒的制备
制备方法同上述(一)中平均粒径为250nm左右的受体颗粒的制备过程，由纳米粒度仪测得该受体颗粒粒径的Gaussian分布(如图6所示)平均粒径值为345.4nm，变异系数(C.V.)＝4.0％，Nicomp分布为单峰(如图7所示)。
实施例2：利用本发明受体试剂对cTnI标志物进行检测的灵敏度和检测上限
定义灵敏度点为当浓度Cx的信号高于两倍浓度C0的信号，即RLU(Cx)>2RLU(C0)，则对应的检测试剂灵敏度为Cx。定义检测上限点为使用美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)评价方案(EP)系列6的文件中的方法确定的范围上限。
(1)将cTnI抗原稀释到1pg/ml、2pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、30pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml、5000pg/ml、10000pg/ml、50000pg/ml、1000ng/ml的系列浓度，将实施例1中制备的分别包含不同平均粒径(110nm和350nm)偶联cTnI抗体Ⅰ的受体颗粒的受体试剂(浓度为100ug/ml)，与相同的生物素标记的cTnI单抗2(稀释到2ug/ml)和通用液(含供体颗粒的试剂)检测上述浓度系列cTnI抗原，利用博阳生物科技(上海)有限公司开发的光激化学发光分析系统检测灵敏度和检测上限如表1所示。
表1
从表1可知，在110nm平均粒径的受体颗粒的检测上限较高，但是灵敏度较差；而350nm平均粒径的受体颗粒有最佳的灵敏度，但是检测上限较低。
(2)将平均粒径110nm偶联cTnI抗体Ⅰ的受体颗粒溶液与平均粒径350nm偶联cTnI抗体Ⅰ的受体颗粒溶液混合后，得到新的受体试剂。新的受体试剂中，受体颗粒粒径的测定结果如下：
Gaussian分布平均粒径318.1nm，粒径分布变异系数(C.V值)＝37.5％(如图8所示)；
Nicomp分布为双峰：#1：平均粒径102.9nm变异系数(C.V值)＝121％；#2：平均粒径328.4nm，粒径分布变异系数(C.V值)＝13.0％(如图9所示)。
将上述新的受体试剂与生物素标记的cTnI单抗2(稀释到2ug/ml)和通用液(含供体颗粒的试剂)检测上述浓度系列cTnI抗原，利用博阳生物科技(上海)有限公司开发的光激化学发光分析系统检测灵敏度和检测上限如表2所示。
表2
从表2可知，通过增加受体试剂中受体颗粒的粒径分布的变异系数，即适当增加受体颗粒粒径的不均一性，所述方法的检测性能得到明显提升。
实施例3：一系列平均粒径在250nm左右的、粒径分布的变异系数不同的偶联抗体Ⅰ的受体颗粒溶液的制备
按照实施例1中(一)所述方法，获得粒径分布的变异系数不同的偶联抗体Ⅰ(cTnI抗体)的受体颗粒溶液。
具体为：
受体颗粒1：Gaussian分布平均粒径为250.2nm，粒径分布变异系数C.V值＝4.5％；Nicomp分布为单峰。
受体颗粒2：Gaussian分布平均粒径为251.3nm，粒径分布变异系数C.V值＝5.0％；Nicomp分布为单峰。
受体颗粒3：Gaussian分布平均粒径为249.8nm，粒径分布变异系数C.V值＝6.0％；Nicomp分布为单峰。
受体颗粒4：Gaussian分布平均粒径为250.6nm，粒径分布变异系数C.V值＝11.0％；Nicomp分布为单峰。
受体颗粒5：Gaussian分布平均粒径为253.2nm，粒径分布变异系数C.V值＝15.8％；Nicomp分布为单峰。
受体颗粒6：Gaussian分布平均粒径为251.7nm，粒径分布变异系数C.V值＝36.8％；Nicomp分布为双峰。
实施例4：利用本发明受体试剂对cTnI标志物进行检测的灵敏度和检测上限
定义灵敏度点为当浓度Cx的信号高于两倍浓度C0的信号，即RLU(Cx)>2RLU(C0)，则对应的检测试剂灵敏度为Cx。定义检测上限点为使用NCCLS EP-6文件中的方法确定的范围上限。
将cTnI抗原稀释到1pg/ml、2pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、30pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml、5000pg/ml、10000pg/ml、50000pg/ml、1000ng/ml的系列浓度，分别采用实施例3中制备的包含偶联cTnI抗体Ⅰ的受体颗粒的受体试剂(浓度为100ug/ml)，与相同的生物素标记的cTnI单抗2(稀释到2ug/ml)和通用液(含供体颗粒的试剂)检测上述浓度系列cTnI抗原，利用博阳生物科技(上海)有限公司开发的光激化学发光分析系统检测灵敏度和检测上限如表3所示。
表3
从表3可知，当所述受体颗粒粒径分布的变异系数大于等于5％时，加入含有上述受体颗粒的受体试剂的方法既有较合适的灵敏度，又有很宽的检测量程。
实施例5：cTnI标志物标准物的检测
将cTnI抗原稀释到1pg/ml、2pg/ml、5pg/ml、10pg/ml、20pg/ml、30pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、1000pg/ml、5000pg/ml、10000pg/ml、50000pg/ml、1000ng/ml的系列浓度，采用不同粒径(50nm、80nm、110nm、140nm、170nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm)受体颗粒包被cTnI单抗1的受体试剂(浓度为100ug/ml，C.V值均在10％左右)，与相同的生物素标记的cTnI单抗2(稀释到2ug/ml)和通用液(供体颗粒溶液)检测上述浓度系列cTnI抗原，利用博阳生物科技(上海)有限公司开发的光激化学发光分析系统检测灵敏度和检测上限如表4所示。
表4
从表4的cTnI项目检测结果可知，粒径为50nm、80nm的受体颗粒的检测上限很高，但是灵敏度较差，而粒径为300nm的受体颗粒有最佳的灵敏度，但是检测上限较低。将粒径为50nm和80nm的受体颗粒分别与粒径为300nm受体颗粒混合，形成受体试剂，检测加入含相应的受体试剂的方法的灵敏度和检测上限，结果如表5示。
表5
从表5可知，加入通过将平均粒径较小的受体颗粒和平均粒径较大的受体颗粒组合后形成的受体试剂，该方法同时具有高灵敏度和高检测上限(宽检测量程)，展现出大粒径受体颗粒和小粒径受体颗粒的优势，与单一平均粒径分布的受体颗粒相比含有两种以上平均粒径的受体颗粒的受体试剂的性能得到极大的提高。
实施例6：正常人与疑似患有心肌损伤患者的cTnI的临床检测
本实施例检测40份的临床样本(13个阴性样本和27个阳性样本)，所用的cTnI定量测定检测试剂盒(光激化学发光法)由包含第一抗cTnI单克隆抗体包被的受体颗粒的试剂1(R1)、包含生物素标记的第二抗cTnI单克隆抗体的试剂2(R2)组成，另外包括含有供体颗粒的通用液(R3)。其中，R1是利用实施例3中受体颗粒4(粒径分布变异系数C.V值＝11％)制备得到的受体试剂(浓度为100ug/ml)。
检测过程是在博阳生物科技(上海)有限公司开发的全自动光激化学发光分析系统上完成并输出检测结果，具体检测步骤包括：
a.在反应孔中加入临床样本；
b.在反应孔中依次加入R1和R2；
c.温育；
d.在反应孔中加入R3；
e.温育；
f.激光照射反应孔并计算每孔发光光子量；
g.计算待测样本中的cTnI浓度。
当临床样本中存在cTnI标志物时，cTnI同时与包被第一抗cTnI单克隆抗体的受体颗粒以及生物素标记的第二抗cTnI单克隆抗体特异性结合，并于受体颗粒表面形成双抗体夹心复合物；此时，如加入链霉亲和素修饰的供体颗粒，生物素与链霉亲和素结合而使得两种颗粒相互靠近，在激发光源的激发下，供体颗粒释放单线态氧，在溶液中碰到受体颗粒后产生化学发光，从而更进一步激发同一个颗粒上的荧光基团产生级联放大反应产生荧光。此时，存在的cTnI标志物含量越多，则荧光强度越强，根据发光的强弱定量检测患者血清中cTnI的量，具体检测结果如下表6所示：
表6
经数据比对，Abbott测值与本实施例6上述测值相关性为0.9973，斜率为1.0495。样本1-13号为正常体检病人，分布范围1.77pg/ml～25.3pg/ml，中值为6.77pg/ml；样本14-40号为鉴定有心肌损伤病人，分布范围30.94pg/ml～29896.88pg/ml，中值为450.54pg/ml。
心肌肌钙蛋白I(cTnI)在健康人的血清或血浆中浓度较低，患者胸痛发作后4-8小时，坏死的心肌细胞大量释放cTNI进入血液循环系统，12-48小时达峰值，严重心梗病人数天后cTnI仍然维持在较高水平，是诊断心肌损伤和心肌梗死的最优标志物。根据本发明的实施6的数据可以表明，将本发明所述的受体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途具有可行性，利用发明所述的受体试剂以及相应的方法测定主体体液中cTnI标志物的定量结果可用于诊断心肌损伤和心肌梗死。
实施例7：正常人与疑似患有心肌损伤患者的CKMB的临床检测
本实施例检测40份的临床样本，所用的CKMB定量测定检测试剂盒(光激化学发光法)由包含第一抗CKMB抗体包被的受体微粒的试剂1(R1’)、包含生物素标记的第二抗CKMB抗体的试剂2(R2’)组成，另外包括含有供体颗粒的通用液(R3’)。其中，R1是利用实施例3中受体颗粒4(粒径分布变异系数C.V值＝11％)制备得到的受体试剂(浓度为200ug/ml)。
具体实验步骤如下：
1.挑选40份的临床样本，平衡至室温，混匀；
2.在8×12的白板中分别加入混匀的样本、已配制的R1’和R2’；
3.将加好样的白板放入LiCA HT仪器中反应，采用的反应模式如下；
(1)将40ul样本、15ul R1’和15ul R2’混匀；
(2)37℃温育8min；
(3)加入160ul通用液(R3’)；
(4)37℃温育2min；
(5)激发读数，具体检测结果如下表7所示。
表7
经比对，Roche测值与博阳测值相关性为0.9877，斜率为0.9192。样本1-13号为正常体检病人，分布范围0.23ng/ml～3.88ng/ml，中值为1.27ng/ml；样本14-40号为鉴定有心肌损伤病人，分布范围6.53ng/ml～150.90ng/ml，中值为41.88ng/ml。
肌酸激酶同工酶(CK-MB)是WHO推荐的判断心肌梗死三个标准之一。CK-MB是肌酸激酶的三个二聚体同工酶之一，在心肌中比例较高，心肌细胞坏死时进入血液循环，心梗患者发病后3-4小时后浓度升高，18-24小时达峰，72小时内可恢复正常。根据本发明的实施7的数据可以表明，将本发明所述的受体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途具有可行性，利用发明所述的受体试剂以及相应的方法测定主体体液中CK-MB标志物的定量结果可用于诊断心肌损伤和心肌梗死。
实施例8：正常人与疑似患有心肌损伤患者的MYO的临床检测
本实施例检测40份的临床样本，所用的MYO定量测定检测试剂盒(光激化学发光法)由包含第一抗MYO抗体包被的受体微粒的试剂1(R1’)、包含生物素标记的第二抗MYO抗体的试剂2(R2’)组成，另外包括含有供体颗粒的通用液(R3’)。其中，R1是利用实施例3中受体颗粒4(粒径分布变异系数C.V值＝11％)制备得到的受体试剂(浓度为200ug/ml)。
具体实验步骤如下：
1.挑选40份的临床样本，平衡至室温，混匀；
2.在8×12的白板中分别加入混匀的样本、已配制的R1’和R2’；
3.将加好样的白板放入LiCA HT仪器中反应，采用的反应模式如下；
(1)将40ul样本、15ul R1’和15ul R2’混匀；
(2)37℃温育8min；
(3)加入160ul通用液(R3’)；
(4)37℃温育2min；
(5)激发读数，具体检测结果如下表8所示。
表8
经比对，Roche测值与博阳测值相关性为0.994，斜率为0.954。样本1-13号为正常体检病人，分布范围23.36ng/ml～84.08ng/ml，中值为38.93ng/ml；样本14-40号为鉴定有心肌损伤病人，分布范围81.3ng/ml～1495.59ng/ml，中值为382.48ng/ml。
肌红蛋白(MYO)存在于心肌和骨骼肌中，体积小，心肌细胞坏死时能迅速扩散入血，1-2小时浓度就可升高，是急性心肌梗死的早期指标。心梗病人发病后24小时，MYO浓度可恢复正常，因此MYO可以用于诊断再发心肌梗死。根据本发明的实施8的数据可以表明，将本发明所述的受体试剂在制备用于体外诊断主体是否患有心肌损伤的方法所使用的试剂盒中的用途具有可行性，利用发明所述的受体试剂以及相应的方法测定主体体液中MYO标志物的定量结果可用于诊断心肌损伤和心肌梗死。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
