一种快速检测硫熏中药中二氧化硫残留的方法
技术领域
本发明属于药物分析与中药质量评价方法领域，具体涉及一种基于SERS技术检测硫熏中药中二氧化硫残留的方法。
背景技术
表面增强拉曼光谱(SERS)技术是在拉曼光谱技术上发展起来的，通过将待测分子吸附到金银纳米粒表面使得其拉曼信号呈指数级增强，因其灵敏度高，专属性强，无荧光漂白，无需复杂前处理等优势，在化学、材料分析、环境与食品安全以及生物医药等领域有了广泛应用。
专利文献CN 104165878 A公开了一种检测葡萄酒中二氧化硫含量的方法，首先制备了一种宏观平面氧化锌纳米材料作为顶空固相萃取的吸附材料，对葡萄酒中二氧化硅进行富集后，结合表面增强拉曼光谱技术对其进行检测。
专利文献CN 108444995 A公开了一种酒中二氧化硫的现场快速检测方法，其包括以下步骤：(1)将还原石墨烯溶液、4-巯基吡啶和金纳米棒在PBS缓冲溶液中室温放置后，离心、洗涤，得到AuNRs/rGO-MPy；(2)由Anodisc滤膜过滤AuNRs/rGO-MPy，得到AuNRs/rGO-MPy滤膜，结合卡尔费休试剂，构建顶空抽样-基于纸的分析装置，利用紫外分光光度计和便携式拉曼光谱仪检测二氧化硫。
近年来我国中药市场规模不断扩大，饮片市场年均增长率领跑医药工业，然而中药质量安全问题依旧严峻。主要的质量问题包括形状不符、有效成分低、二氧化硫残留超标、重金属超标、染色、增重、掺假等，其中又以硫磺熏蒸较为突出。中药质量评价传统检测方法主要运用色谱、质谱、原子吸收光谱等技术，具有灵敏准确的优点，但样品前处理时间长，且大多依靠大型仪器，不适用于现场快速检测。
表面增强拉曼光谱(SERS)技术的高灵敏度、检测实时快速等优势使其具备用于中药质量快速检测的潜质。而分析物的拉曼信号依赖于增强基底的稳定性，开发一种适合原料药材和饮片等复杂基质样品检测的基底材料是本领域技术人员需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适用于SERS技术检测中药材中二氧化硫残留的基底材料，以实现原料药材和饮片质量的快速评价。
为实现上述目的，本发明提供了一种快速检测硫熏中药中二氧化硫残留的方法，包括以下步骤：
(1)制备Si@Ag@PEI复合膜基底：将洁净硅片置于HF溶液中去除二氧化硅氧化层，得到氢化硅片，再置于含有AgNO3和HF的混合溶液中反应得到Si@AgNPs，然后滴加支化聚乙烯亚胺水溶液使其平铺满Si@AgNPs表面，自然晾干，制得Si@Ag@PEI复合膜基底；
(2)将待测样品和提取液加入顶空提取装置中，以Si@Ag@PEI复合膜基底作为固相萃取材料，采用顶空提取法吸附目标物二氧化硫；
(3)提取结束后，取出Si@Ag@PEI复合膜基底，采用表面增强拉曼光谱技术进行检测，得到待测样品的拉曼光谱图，对照标准曲线，计算待测样品中二氧化硫残留。
所述中药包括中药药材、中药饮片。
步骤(1)中，制备Si@Ag@PEI复合膜基底作为固相萃取材料。支化聚乙烯亚胺(PEI)由于含有丰富的胺基，具有良好的酸性气体(CO2，SO2，NO2)吸附能力，且SO2特征拉曼峰位(612cm-1，910cm-1)不会被CO2(1285cm-1，1388cm-1)和NO2(810cm-1，1280cm-1)干扰，可实现SO2残留的特异性检测。
硅片采用晶型100的单面抛光硅片，依次于丙酮、无水乙醇和超纯水中超声10min，以去除硅片表面的有机物及灰尘等，得到洁净硅片。
所述HF溶液的体积百分比浓度为5％。硅片浸泡于HF溶液，一方面去除表面氧化层，另一方面形成Si-H键。
所述氢化硅片与可溶性银盐反应，使得在硅片表面沉积银纳米颗粒。作为优选，所述混合溶液含有2.5mM的AgNO3和体积百分比为5％的HF，氢化硅片置于混合溶液中振荡反应1.5～10min。更为优选，氢化硅片置于混合溶液中200rpm振荡反应5min。
制得的Si@AgNPs于水中保存，避免在空气中久置后被氧化。临用时取出置于滤纸上吸收水分，并待剩余水分挥干后使用。
作为优选，所述支化聚乙烯亚胺的分子量为600～70000。更为优选，采用分子量为10000的支化聚乙烯亚胺，利用该材料合成的基底对SO2拉曼相应最强。
所述支化聚乙烯亚胺水溶液的质量百分比浓度为0.1～5％。优选的，采用浓度为0.2～2的支化聚乙烯亚胺水溶液，更为优选，所述支化聚乙烯亚胺水溶液的浓度为0.5％。
步骤(2)中，将Si@Ag@PEI复合膜基底装入便携式顶空提取装置中，Si@Ag@PEI复合膜基底作为萃取材料对待测样品中的SO2进行吸附富集。
进一步的，对提取装置稍作改造以便基底放置，具体地，以带旋盖玻璃小瓶作为提取瓶，以聚乳酸为材料3D打印“乚”型钩状提取平台，并垂直粘附于玻璃瓶旋盖内侧，用于放置Si@Ag@PEI复合膜基底。
所述提取液为体积百分比浓度为0.1％～20％的H2SO4溶液，每1g样品中加入4mL的提取液。
密封的提取瓶悬浮于水浴锅中加热提取SO2。作为优选，顶空提取的温度为30～90℃，提取时间为5min～30min。更为优选，所述顶空提取条件为：采用体积百分比浓度为5％的H2SO4溶液作为提取液，在75℃下提取15min。
步骤(3)中，提取结束后，取出Si@Ag@PEI复合膜基底，采用手持拉曼仪进行检测，得到待测样品的拉曼光谱图，通过对照SO2检测限，即可判断待测样品中是否含有SO2；或是对照标准曲线，计算待测样品中的二氧化硫含量。
所述标准曲线的绘制方法包括：配置一系列梯度浓度的Na2SO3标准溶液，按照上述步骤进行SO2顶空提取和拉曼检测，以612cm-1处SO2特征拉曼峰峰高和对应的SO2浓度值作线性回归，得到SO2标准曲线。
本发明具备的有益效果：
(1)SO2含量是中药质量安全性评价的重要指标，本发明提供的Si@Ag@PEI复合膜基底可以吸附SO2气体，在612cm-1处显示特征拉曼峰，同时增强拉曼信号强度，其检测限达到1ppm，从而实现微量SO2的特异性检测，可用于硫熏中药残留的检测与质量评价。
(2)本发明针对中药二氧化硫残留问题，设计制备功能性材料，并结合薄膜微萃取技术，将待测成分与复杂中药成分良好分离，提高定量检测能力，同时采用手持式拉曼光谱仪，使其适用于现场检测环境，从而改善传统检测方法耗时长、仪器成本高的不足，实现原料药材和饮片质量的快速评价。
附图说明
图1为Si@AgNPs合成时间优化结果；其中，(a)图为10-6M R6G溶液在不同合成时长的Si@AgNPs基底上的SERS图，(b)图为不同合成时长SERS图中1510cm-1处R6G特征峰拉曼光谱强度。Raman shift表示拉曼位移(cm-1)，Raman intensity(a.u.)表示拉曼光谱强度，下同。
图2-1为Si@AgNPs基底表面随机取点考察重复性；其中，(a)图为10-6M R6G溶液在Si@AgNPs基底上随机取点SERS图，(b)图为SERS图中1510cm-1处R6G特征峰拉曼光谱强度。
图2-2为Si@AgNPs基底批次间考察重复性；其中，(a)图为10-6M R6G溶液在不同批次Si@AgNPs基底上的SERS图，(b)图为SERS图中1510cm-1处R6G特征峰拉曼光谱强度。
图3为Si@AgNPs增强因子考察结果。
图4为Si@AgNPs稳定性考察结果；其中，(a)图为10-6M R6G溶液在放置不同时间的Si@AgNPs基底上的SERS图，(b)图为SERS图中1510cm-1处R6G特征峰拉曼光谱强度。
图5为Si@Ag@PEI复合膜基底合成中PEI浓度优化结果；其中，(a)图为SO2在不同浓度PEI所合成的基底上的SERS图，(b)图为SERS图中612cm-1处SO2特征峰拉曼光谱强度；Concentration(PEI，％)表示PEI浓度(％)。
图6为Si@Ag@PEI复合膜基底合成中PEI分子量优化结果；其中，(a)图为SO2在不同分子量PEI所合成的基底上的SERS图，(b)图为SERS图中612cm-1处SO2特征峰拉曼光谱强度；M.W.(PEI)表示PEI分子量。
图7-1为Si@AgNPs扫描电子显微镜表征图；其中，(a)图为放大1000倍下的SEM图，(b)图为放大10000倍下的SEM图。
图7-2为Si@Ag@PEI扫描电子显微镜表征图。
图8为顶空膜吸附法检测SO2含量的提取条件优化结果；其中，(a)图为不同温度下提取的SO2在Si@Ag@PEI基底上的SERS图，Temperature(℃)表示提取温度(℃)；(b)图为不同提取时间的SO2在Si@Ag@PEI基底上的SERS图，Time(min)表示提取时间(min)；(c)图为不同浓度H2SO4提取的SO2在Si@Ag@PEI基底上的SERS图，H2SO4表示提取液浓度(％)。
图9为Si@Ag@PEI复合膜基底检测SO2含量的检测限和线性范围考察结果；其中，(a)图为SO2标准溶液在Si@Ag@PEI基底上的SERS图，(b)图为痕量浓度SO2标准溶液在Si@Ag@PEI基底上的SERS图，(c)图为SERS图中612cm-1处SO2特征峰拉曼光谱强度与SO2浓度的拟合曲线，Concentration(SO2，ppm)表示SO2浓度(ppm)。
图10为Si@Ag@PEI复合膜基底检测SO2含量的稳定性考察结果；其中，(a)图为SO2溶液在放置不同天数的Si@Ag@PEI基底上的SERS图，(b)图为SERS图中612cm-1处SO2特征峰拉曼光谱强度，Time(day)表示放置时间(day)。
图11为人参、丹参、苦杏仁和山药片等中药材中SO2含量检测结果。
图12-1为中药材苦杏仁SO2加标与检测结果；其中，SO2(mg/kg)表示SO2加标浓度(mg/kg)。
图12-2为中药材人参SO2加标与检测结果。
图12-3为中药材丹参SO2加标与检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实施例1
合成Si@AgNPs，步骤如下：
晶型100的单面抛光硅片，依次于丙酮、无水乙醇和超纯水中超声10min，以去除硅片表面的有机物及灰尘等；将洁净硅片浸于5％HF溶液30min，去除表面二氧化硅氧化层，并形成Si-H键；氢化硅片放入装有2.5mM AgNO3和5％HF混合溶液的小培养皿中200rpm振摇5min，更换超纯水溶液终止反应，得到Si@AgNPs，并置于水中保存，避免在空气中久置后被氧化；临用时取出置于滤纸上吸收水分，并待剩余水分挥干后使用。
实施例2
考察反应时间对Si@AgNPs合成效果的影响：
重复实施例1中Si@AgNPs的合成过程，振摇时间分别为1.5min、3min、5min、10min。将不同反应时间下的Si@AgNPs基底浸泡于10-6M罗丹明6G(R6G)溶液中2h，取出后先用清水洗去表面多余的R6G分子，于便携式拉曼光谱仪下扫描拉曼光谱，并根据R6G特征峰峰高判断不同反应时间下基底SERS增强效果并作为反应时间的选择依据。拉曼光谱参数条件：功率300mW，积分时间2s，积分次数1次。
考察结果如图1所示。由图1可见，Si@AgNPs反应时间为5min时拉曼增强性能较好。
实施例3
考察Si@AgNPs性能的重复性：
将实施例1制备的Si@AgNPs基底浸泡于10-6M R6G溶液中2h并用清水润洗后，于便携式拉曼光谱仪下扫描拉曼光谱。通过对同1片基底随机取10个点扫描光谱考察基底随机取点重复性；对不同批次5片基底分别扫描光谱，其中每1片随机10个点并取平均值，考察基底批次间重复性。
考察结果如图2-1和图2-2所示。由图2-1可见，Si@AgNPs基底随机取点重复性良好；由图2-2可见，Si@AgNPs基底批次间重复性良好。
实施例4
计算Si@AgNPs的增强因子：
在实施例1制备的Si@AgNPs基底上滴加10μL 10-6M R6G分子，同时在空白硅片上滴加10μL 0.1M R6G分子，2h后在相同参数条件下测量拉曼光谱。根据公式EF＝(ISERS/NSERS)/(Ibulk/Nbulk)，以1510cm-1处的拉曼峰强度计算基底的拉曼增强因子。
结果如图3所示。根据图3可计算得到，Si@AgNPs基底的增强因子为1.6×106。
实施例5
考察Si@AgNPs性能的稳定性：
按照实施例1的方法制备数批Si@AgNPs基底，先取3片基底浸泡于10-6M R6G溶液24h后扫描拉曼光谱，记为Day 1，此后每隔3、5或10天按前述操作进行基底拉曼光谱采集，分别考察Si@AgNPs基底在放置1、3、5、10、15、20、30天时的拉曼增强性能稳定性。拉曼光谱参数条件：功率150mW，积分时间1s，积分次数1次。
考察结果如图4所示。由图4可见，Si@AgNPs基底的SERS检测性能在30天内保持稳定。
实施例6
合成Si@Ag@PEI复合膜基底，步骤如下：
滴加10μL浓度为0.5％的PEI水溶液使平铺满Si@AgNPs表面，自然晾干，即得所述基于SERS的Si@Ag@PEI复合膜基底。
实施例7
顶空膜吸附法检测SO2含量，步骤如下：
将容积为20mL的带旋盖玻璃小瓶稍作改造，作为便携式顶空提取装置：以聚乳酸为材料3D打印平台直径1cm的“乚”型钩状提取平台，并垂直粘附于玻璃瓶旋盖内侧，用于放置Si@Ag@PEI基底。
往顶空提取瓶中加入4mL系列浓度为5％H2SO4溶液，再加入1mL事先配置好的100ppm Na2SO3标准溶液，将Si@Ag@PEI基底放置于提取台上并旋紧瓶塞，并把提取瓶插入自制带孔的泡沫板悬浮于水浴锅中加热提取，提取温度为75℃，提取时间为15min。
顶空提取后取出Si@Ag@PEI基底，放置于便携式拉曼检测台上，扫描拉曼光谱，每片基底随机取3个点，平行检测3次。拉曼光谱参数：150mW，积分时间2s，积分次数1次。
实施例8
考察PEI浓度对Si@Ag@PEI复合膜基底合成效果的影响：
重复实施例6中Si@Ag@PEI的合成过程，其中分别滴加浓度为0、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、3％、5％的PEI分子。对SO2顶空提取吸附，根据拉曼检测选择最优条件。
考察结果如图5所示。由图5可见，PEI分子浓度为0.5％时所合成的基底对SO2拉曼响应最强，故选用浓度稀释为0.5％的PEI作为SO2吸附材料。
实施例9
考察PEI分子量对Si@Ag@PEI复合膜基底合成效果的影响：
重复实施例6中Si@Ag@PEI的合成过程，其中滴加的PEI分子浓度为0.5％，PEI分子量分别更换为600、10k、25k、70k。对SO2顶空提取吸附，根据拉曼检测选择最优条件。
考察结果如图6所示。由图6可见，PEI分子量为10k时所合成的基底对SO2拉曼响应最强，故选用分子量为10k的PEI作为SO2吸附材料。
实施例10
Si@AgNPs和Si@Ag@PEI基底的SEM表征：
将经过反应条件优化的Si@AgNPs和Si@Ag@PEI基底通过干燥喷金预处理后，用双面胶粘在扫描电镜样品台上，于电镜中观察基底形貌。电镜型号为ZEISS GeminiSEM 300场发射扫描电子显微镜，电压3.00kV，放大倍数分别为1k和10k。
表征结果如图7-1和图7-2所示。图7-1为Si@AgNPs的SEM图，可看到AgNPs均匀地分布在硅片表面；图7-2为Si@Ag@PEI的SEM图。
实施例11
优化SO2顶空提取条件：
重复实施例7中顶空膜吸附法检测SO2含量的方法，提取温度分别为30、45、60、75、90℃，根据拉曼检测选择最优条件。
重复实施例7中顶空膜吸附法检测SO2含量的方法，提取时间分别为5、10、15、20、30min，根据拉曼检测选择最优条件。
重复实施例7中顶空膜吸附法检测SO2含量的方法，顶空提取瓶中加入的H2SO4溶液浓度分别为0.1％、1％、5％、10％、20％，根据拉曼检测选择最优条件。
优化结果如图8所示。由图8可见，提取温度为75℃时拉曼信号最强；提取时间大约15min时拉曼放大信号趋于平缓；H2SO4溶液浓度为5％时拉曼信号最强。故最终的提取条件为用浓度5％的H2SO4在75℃下提取15min。
实施例12
方法线性范围和检测限考察：
采用优化的H2SO4溶液浓度、提取时间和温度等提取条件，对SO2检测线性范围和检测限进行考察。称取Na2SO3 0.2000g，溶于40mL超纯水中，得到500ppm的Na2SO3储备液，并依次稀释到100、50、10、5、1、0.5ppm。对系列梯度浓度的Na2SO3溶液进行SO2顶空提取和拉曼检测，平行检测3份。因SO2分子质量约为Na2SO3的1/2，则SO2浓度近似计为250、50、25、5、2.5、0.5、0.25ppm。以612cm-1处SO2特征拉曼峰峰高和对应的SO2浓度值作线性回归，得到SO2检测线性范围，同时得到拟合曲线的斜率k；将Na2SO3溶液换为水溶液作为空白对照，平行测定9份拉曼光谱，计算在612cm-1处拉曼峰高的标准偏差σ；按照公式LOD＝3σ/k计算得到检测限LOD。
考察结果如图9所示。根据图9(a)、(b)中不同SO2浓度的拉曼信号，作出图9(c)的拟合曲线，得到SO2的线性范围为2.5～250ppm；检测限为1ppm。
实施例13
考察Si@Ag@PEI基底的稳定性：
制备数批Si@Ag@PEI基底，并分别在0、7、14、21天时各取3片进行相同条件下的SO2提取检测。
考察结果如图10所示。由图10可见，Si@Ag@PEI基底的SERS检测性能可稳定保持20天以上。
实施例14
中药材中SO2的检测：
重复实施例7中顶空膜吸附法检测SO2含量的方法，顶空提取瓶中分别加入1.0g山药片、苦杏仁、剪成短节的人参或丹参，不加Na2SO3溶液。拉曼检测结果与SO2检测限比较判断是否有SO2残留。
检测结果如图11所示。山药片和白术在612cm-1处有明显峰型，而西洋参和苦杏仁在该位置几乎无峰。分析结果如下表所示。
表1 市售药材SO2残留检测
实施例15
中药材SO2加标与检测：
重复实施例7中顶空膜吸附法检测SO2含量的方法，顶空提取瓶中分别加入1.0g苦杏仁、剪成短节的人参或丹参，分别均匀滴加200μL浓度为1000、250、50ppm的Na2SO3溶液，放置30min，得到SO2加标浓度分别为100、25、5ppm的药材样品。每种药材各加标浓度平行操作3份，并计算回收率。
检测结果如图12-1、图12-2、图12-3所示。分析结果如下表所示，3种药材的加标回收率在81.2％～110.5％范围内，RSD均小于20％。
表2 药材SO2加样回收检测
应当指出，对于本领域的普通人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，也应视为本发明的保护范围。
