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一种检测核因子-κB的试剂盒及其应用

2021-03-24 23:31:16

一种检测核因子-κB的试剂盒及其应用

　　技术领域

　　本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测核因子-κB的试剂盒及其应用。

　　背景技术

　　目前，严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV-2)已席卷全球，对人类健康造成了严重的危害和影响。解剖结果显示新冠肺炎(COVID-19)患者的病理特征提示急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的发生，而ARDS的病因是细胞因子风暴。当病毒侵入细胞后，核酸RNA的释放激活Toll样受体7(TLR7)并招募多个蛋白质形成复合物，进而促进转录因子(TFs)如干扰素调节因子7(IRF7)和核因子-κB(NF-κB)进入细胞核，然后激活促炎细胞因子的表达，导致免疫系统过度活跃，从而引起细胞因子风暴，这通常是危险和致命的。在这一过程中，转录因子起着极其重要的作用，因此转录因子的准确测定在生物学研究和临床诊断中具有重要意义。

　　转录因子包含一个或多个DNA结合域(DBDs)，它们与特定的DNA序列结合以调节基因转录。可以作为自然开关，将温度变化、光照、药物浓度和氧化还原状态等物理和化学信号转换为转录变化。因此，转录因子在基因表达调控的途径和网络中起着重要作用。转录因子信号失衡与癌症、发育障碍、炎症和自身免疫有关。其中NF-κB是一种重要的诱导性转录因子，几乎存在于所有细胞中。NF-κB二聚体可与基因组中的NF-κB位点结合，调节靶基因的表达，涉及免疫、炎症和癌症等许多重要的生物学过程。对于NF-κB，它已成为医学诊断和药物开发的潜在靶点。

　　由于转录因子的重要性，其检测技术越来越受到重视。目前检测转录因子的方法主要有电化学法、放射性凝胶迁移实验(EMSA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)。然而，这些方法都存在一些不足。对于电化学方法，样品消耗量大，而复杂的电极修饰过程通常耗时费力。虽然放射性凝胶迁移实验简单而敏感，但放射性同位素的应用给研究人员和周围环境带来了安全隐患。酶联免疫吸附试验由于加入了抗转录因子的特异性抗体，应用范围过于狭窄。此外，在一些典型的荧光放大策略中，可以直接检测到溶液中的转录因子。转录因子的存在可以促进DNA双链的形成，产生强烈的荧光共振能量转移(FRET)。然而，蛋白质与DNA的结合可能产生空间位阻，导致荧光信号很低。因此，还需要开发新的转录因子检测方法。

　　分子信标(MB)是一种新型的颈环结构探针，是一种由环状区、干区、荧光基团和猝灭剂组成的荧光标记寡核苷酸链。由于其高灵敏度、无毒性和高特异性，分子信标被越来越广泛地用于检测和分析溶液中特定的核酸序列或蛋白质。当分子信标单独存在时，茎上的荧光基团和猝灭剂相互接近，荧光基团的荧光被猝灭。当目标核酸出现在溶液中时，会引起分子信标在杂交过程中的构象变化。荧光基团和猝灭剂彼此分离，从而恢复荧光。因此，荧光强度的变化可以确定溶液中是否有目标核酸。在蛋白质检测中，目标核酸可以通过靶蛋白与DNA探针和工具酶的反应释放出来。通过使用分子信标检测核酸来达到检测和分析目标蛋白的目的。而目前的一些基于分子信标检测蛋白质的信号放大策略都存在灵敏度低、耗时长、设计过于复杂等缺点。因此，有必要建立一种经济、灵敏、快速、特异性强的转录因子检测方法。

　　发明内容

　　因此，目前的一些基于分子信标检测蛋白质的信号放大策略都存在灵敏度低、耗时长、设计过于复杂等缺点。本发明提供一种灵敏度高、特异性好、耗时短的检测核因子-κB的探针及其相关的产品和应用。

　　本发明提供一种检测核因子-κB的探针，所述探针为DNA双链探针；所述DNA双链探针由DNA-1和DNA-2反向互补形成；所述DNA-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述DNA-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

　　一种检测核因子-κB的试剂盒，包含上述的检测核因子-κB的探针。

　　可选地，所述试剂盒还包括独立包装的两个发夹式分子信标分别为MB-1和MB-2；所述MB-1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；所述MB-2为在SEQ ID No.4的5’末端标记荧光基团，第20位标记猝灭剂得到的。

　　可选地，所述荧光基团为cy3，所述猝灭剂为BHQ-2；或所述荧光基团为cy5，所述猝灭剂为BHQ-2；所述荧光基团为6-FAM，所述猝灭剂为BHQ-1。

　　可选地，所述试剂盒还包括独立包装的核酸外切酶III。可选的，每uL检测体系中该酶的用量为0.25U。

　　可选地，所述DNA-1、DNA-2、MB-1和MB-2的摩尔比为1：1：1：2。

　　一种检测核因子-κB的方法，将上述探针与待测样本室温下共孵育30分钟以上，然后加入核酸外切酶III、MB-1和MB-2，于37℃共孵育1小时以上，如果与阴性对照相比，共孵育后待测样本的荧光强度升高、说明待测样本中含有核因子-κB；所述阴性对照为不含有核因子-κB的样本。探针与待测样本共孵育的温度为25±2℃。

　　可选地，上述DNA-1、DNA-2、MB-1和MB-2的摩尔比为1：1：1：2。

　　上述探针或上述的试剂盒在检测核因子-κB中的应用也属于本发明的保护范围。

　　可选地，所述核因子-κB具体为NF-κBp65或NF-κBp50。

　　本发明技术方案，具有如下优点：

　　1、本发明的探针，所述探针为DNA双链探针；所述DNA双链探针由DNA-1和DNA-2组成；所述DNA-1和DNA-2反向互补；所述DNA-1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述DNA-2的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，该探针能够特异性好、灵敏度高的检测NF-κB。

　　2、本发明开发了一种简便、灵敏的核因子-κB检测方法。该方法结合了DNA结合蛋白质、核酸外切酶III(Exo-III)和等温指数扩增技术，采用分子信标依赖性扩增荧光分析技术成功地实现了信号的双重放大。与其他方法相比，该方法具有较高的特异性和较低的检测限，可直接用于癌细胞核提取液中核因子-κB的检测。

　　3、敏感度实验结果表明，本发明的方法，即将本发明探针或试剂或试剂盒与待测样本共孵育，如果与共孵育前相比，共孵育后的荧光强度升高、说明待测样本中含有核因子-κB。该方法最低检出限为2.6pm。

　　4、可行性研究结果表明，只有当核因子-κB、DNA双链探针、MB-1、MB-2和Exo-III同时存在时，荧光强度明显增强。

　　5、反应时间实验结果表明，本发明的检测方法荧光强度随时间的增加而增强，并在45分钟左右进入平台期。

　　6、内源性NF-κB p65检测试验结果表明，本发明的方法可以克服核提取液中内源成分的干扰。

　　附图说明

　　为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

　　图1是本发明分子信标依赖荧光放大法检测核因子-κB的原理；

　　图2是本发明实施例2中不同浓度(0、5、10、15、20、30、60、120、250、500和1000pM)的NF-κB p65荧光光谱；曲线从下到上依次对应NF-κB p65浓度为0、5、10、15、20、30、60、120、250、500和1000pM的检测结果；

　　图3(a)和(b)均是NF-κB p65的浓度与荧光强度的关系；横坐标为NF-κB p65的浓度，纵坐标为荧光强度；

　　图4是可行性研究实验结果；

　　图5是反应时间实验结果；

　　图6是特异性实验结果；

　　图7实施例5实验结果与标准曲线之间的比较。

　　具体实施方式

　　蛋白质结合缓冲液为：10mM Tris HCl(pH 8.0)、100mM KCl、2mM MgCl2、0.25mMDTT、10％(体积百分含量)甘油和0.1mM EDTA；

　　DNA反应缓冲液为：50mM Tris-HCl，100mM NaCl，1mM EDTA，pH8.0。

　　试剂和仪器

　　PAGE纯的寡核苷酸购买于Genscript公司(寡核苷酸序列在下表1中列出),

　　Threo-1，4-二巯基-2，3-丁二烯(DTT)和Exo III购自于生工生物工程(上海)股份有限公司(中国，上海)；Exo III的货号为B300061-0004。

　　培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和抗生素购自Life Technologies(美国纽约格兰德岛)；

　　核提取试剂盒购自Active Motif(美国，加利福尼亚州，货号为40010)其他化学试剂购买于国药集团化学试剂有限公司(中国，上海)；

　　本研究所使用超纯水均由电阻率18MΩcm的Milli-Q纯化系统(美国，马塞诸塞州，比尔利卡)制备而得。

　　所有荧光光谱均在多功能酶标仪(SpetraMax M5；分子装置，美国加州桑尼维尔)上获得。

　　实施例1

　　将溶解于DNA反应缓冲液中的DNA-1(SEQ ID No.1)和溶解于DNA反应缓冲液中的DNA-2(SEQ ID No.2)混合，得到浓度为5μM双链探针储备液。将分子信标MB-1(SEQ IDNo.3)和MB-2(SEQ ID No.4的5’末端标记有Cy3，第20位标记有BHQ-2)分别溶解在DNA反应缓冲液中制成MB-1和MB-2浓度均为5μM的储备液。将所有溶液在95℃下加热5分钟，然后缓慢地冷却到室温并静置至少4小时。

　　检测NF-κB p65时，20uL蛋白质结合缓冲液体系中，加入NF-κB p65，然后与加入双链DNA探针溶液40μL，室温孵育45min。然后加入20μL浓度为2.5U/μL Exo III，40μL MB-1和80μL MB-2，该体系的总体积为200μL，该体系中双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，并在37℃下孵育1h，下文简称检测NF-κB p65的方法。

　　检测核提取物中的转录因子NF-κB时，将细胞核提取物20μL与双链DNA探针溶液40μL混合，室温孵育45min；然后加入Exo III(2.5U/μL，20μL)、40μL MB-1和80μL MB-2，该体系中双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，并在37℃下孵育1h，下文简称细胞核提取物检测方法。

　　表1

　　在DNA-1和DNA-2中，粗体碱基是NF-κB p65的结合位点。DNA-2和MB-1中带下划线的碱基是互补序列。在MB-1和MB-2中，粗体碱基表示相互补序列以形成发夹探针的茎序列。MB-1和MB-2中的斜体碱基是互补序列。

　　实验原理

　　图1展示了分子信标依赖荧光放大法检测核因子-κB的原理。本发明设计了反向互补DNA-1和DNA-2来获得DNA双链探针，并在探针上设计了一个能够与NF-κB p65结合的位点。根据Exo-III的特性，它可以作用于DNA双链的3′端，在3′到5′方向逐渐催化单核苷酸的去除，但对单链DNA没有活性。此外，本发明还设计了MB-1和MB-2两款发夹式分子信标。MB-1包含了与DNA-2互补的碱基序列和与MB-2互补的碱基序列。MB-2含有5′端修饰的Cy3荧光基团和在相应互补碱基上修饰的黑洞猝灭剂(BHQ-2)

　　当溶液中没有NF-κB p65时，DNA双链同时被Exo-III从3'端消化。当NF-κB p65存在时，DNA-2受到NF-κB p65与DNA双链探针结合的保护。而DNA-1仍能被Exo-III消化，最终保留的DNA-2可以反映NF-κB p65的含量。然后，MB-1识别位于DNA-2上的特定互补序列并与之结合形成一个新的DNA双链，这会触发Exo-III的消化机制并开始新一轮的消化。当MB-1被部分消化后，释放出一个完整的DNA-2和一个报告DNA(MB-1的一部分)。DNA-2将继续与新的MB-1结合，并重复上述步骤形成一个循环，从而产生更多的报告DNA。另一方面，报告DNA与MB-2杂交，打开发夹结构，使MB-2和报告DNA形成一个新的DNA双链，触发Exo-III的消化机制，经消化后会释放出Cy3-DNA片段，荧光基团(Cy3)摆脱了猝灭剂(BHQ-2)并恢复荧光，释放的报告者DNA与新的MB-2杂交并重复上述步骤形成一个循环。最后，每个DNA-2和报告DNA可以经历多个循环，导致更多的MBs被消化，产生大量cy3-DNA片段。当激发波长设置为546nm时，cy3-DNA片段在566nm处有荧光发射。

　　实施例2敏感度实验

　　按照实施例1中的方法，检测NF-κB p65时，20uL蛋白质结合缓冲液体系中，加入NF-κB p65，然后加入双链DNA探针溶液40μL，室温孵育45min。然后加入20μL 2.5U/μL的ExoIII，40μL MB-1和80μL MB-2，该体系中双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，并在37℃下孵育1h。

　　用多功能酶标仪检测不同浓度(0、5、10、15、20、30、60、120、250、500和1000pM)的NF-κB p65在556-660nm范围内的荧光光谱，结果见图2。从图2中可以看出荧光信号随着NF-κB p65浓度的增加而增强(图2中曲线从下到上依次对应NF-κB p65浓度为0、5、10、15、20、30、60、120、250、500和1000pM的检测结果)。如图3所示(激发波长为546nm，发射波长为566nm)，荧光信号以浓度依赖的方式增加，这意味着释放的Cy3-DNA片段的荧光强度与NF-κB p65的浓度成正比。NF-κB p65浓度在60pm以下时，与荧光强度呈线性关系。相关方程为Y＝210.07+10.92X(R2＝0.9879)，其中X为NF-κB p65浓度，Y为荧光强度。通过计算3倍标准差与标准曲线斜率的比值(3σ/斜率)，得出该方法的最低检出限为2.6pm。

　　实施例3可行性研究

　　分为4组：

　　a组：按照实施例1的方法，20uL蛋白质结合缓冲液体系中，加入40μL双链DNA探针溶液，室温孵育45min；然后加入40μL MB-1和80μL MB-2，并用DNA反应缓冲液该体系补充到200μL，该体系中双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，在37℃下孵育1h，检测该体系在556-660nm范围内的荧光光谱；结果见图4曲线a；

　　b组：按照实施例1的方法，20uL蛋白质结合缓冲液体系中，加入NF-κB p65，然后加入双链DNA探针溶液40μL，室温孵育45min。加入40μL MB-1和80μL MB-2,并用DNA反应缓冲液该体系补充到200μL，该体系中NF-κB p65终浓度为250pM，该体系中双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，并在37℃下孵育1h；检测该体系在556-660nm范围内的荧光光谱；结果见图4曲线b；

　　c组：按照实施例1的方法，20uL蛋白质结合缓冲液体系中，加入1μM双链DNA探针溶液40μL，室温孵育45min；然后加入20μL浓度为2.5U/μL Exo III、40μL MB-1和80μL MB-2，该体系中双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，并在37℃下孵育1h；检测该体系在556-660nm范围内的荧光光谱；结果见图4曲线c；

　　d组：按照实施例1的方法，20uL蛋白质结合缓冲液体系中，加入NF-κB p65，然后加入双链DNA探针溶液40μL，室温孵育45min。然后加入20μL浓度为2.5U/μL Exo III、40μLMB-1和80μL MB-2，该体系的总体积为200μL，NF-κB p65终浓度为250pM，双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，并在37℃下孵育1h。检测该体系在556-660nm范围内的荧光光谱；结果见图4曲线d。图4表明，a、b、c组的荧光强度均处于较低水平。而当核因子-κB和Exo-III同时存在时(d组)，荧光强度明显增强，比未加NF-κB p65的c组高644.2％。

　　实施例4反应时间实验

　　按照实施例1的方法，20uL蛋白质结合缓冲液体系中，加入NF-κB p65，然后加入双链DNA探针溶液40μL，室温孵育45min。然后加入20μL浓度为2.5U/μL Exo III，40μL MB-1和80μL MB-2，该体系的总体积为200μL，NF-κB p65终浓度为250pM，双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，并在37℃下孵育1h。

　　平行设置9组实验，分别在37℃孵育的第0，5，10，15，30，45，60，75，90分钟时进行荧光检测，将上述实验重复3次，取检测到的荧光强度平均值，并绘制曲线，如图5所示。从图5中可以看出荧光强度随时间的增加而增强，并在45分钟左右进入平台期。

　　实施例5特异性实验

　　按照实施例1的方法，20uL蛋白质结合缓冲液体系中，然后与加入DNA探针溶液40μL，室温孵育45min。然后加入20μL浓度为2.5U/μL Exo III、40μL MB-1和80μL MB-2，该体系的总体积为200μL，该体系中NF-κB p65的终浓度为250pM，双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM，并在37℃下孵育1h。

　　将上述体系中的250pM NF-κB p65分别替换为1mM人凝血酶(Human thrombin)、1mM甲胎蛋白(AFP)、1mM人免疫球蛋白G(人IgG)、1mM牛血清白蛋白(BSA)，并设置一组空白对照(Control)。

　　检测上述各个反应体系的其荧光强度(激发波长为546nm，发射波长为566nm)，结果如图6所示，即使在很高浓度(1mM)下，人凝血酶、甲胎蛋白、人IgG或牛血清白蛋白的荧光强度仍然很低，远远弱于250pM时的NF-κB p65的荧光强度。说明该方法对NF-κb p65具有较高的特异性。

　　实施例5内源性NF-κB p65检测

　　将A549细胞培养在含有10％胎牛血清、青霉素(100μg/mL)和链霉素(100μg/mL)的DMEM培养液中，在37℃含5％二氧化碳的细胞培养箱中培养。用Petroff-Haussercell计数器(美国)测量细胞数，将5×107个细胞置入EP管，用PBS(0.1M，pH7.4，4℃)冲洗2次，并与20ng/mL肿瘤坏死因子α(TNF-α)孵育35min(此步骤目的是激活NF-κB信号通路，使NF-κB转入细胞核)。使用核提取试剂盒收集细胞核提取物，即得细胞核提取液，-80℃保存待测。如表2所示，核提取物中NF-κB p65的回收率为95.78-110.02％，在可接受的最大回收率范围内(80％-120％)[Cordell RL,White IR,Monks PS.Validation of an assay for thedetermination of levoglucosan and associated monosaccharide anhydrides forthe quantification of wood smoke in atmospheric aerosol.Analytical andbioanalytical chemistry2014；406:5283-92.https://doi.org/10.1007/s00216-014-7962-x]。

　　在检测核抽提物等复杂样品中含有的目标时，通常会受到许多内源成分的干扰，从而产生很强的荧光干扰，这大大降低了常用生物传感器的效率。为了验证实施例1中的方法检测复杂样品中特定蛋白的能力，检测了含有不同浓度NF-κB p65的稀释核提取液。

　　取7份核提取液，分别标记为1-7号样品，第1份样品的检测体系中加入NF-κB p65浓度为0pM；第2份样品中加入NF-κB p65浓度为5pM；……，其余每份样品中加入NF-κB p65具体见表2第2列。

　　每份样品均按如下方法检测：将加入了NF-κB p65的细胞核提取物20μL与双链DNA探针溶液40μL混合，室温孵育45min；然后加入Exo III(2.5U/μL，20μL)、40μL MB-1和80μLMB-2，形成检测体系，该体系中双链DNA探针的浓度为1μM，MB-1的浓度为1μM，MB-2的浓度为2μM并在37℃下孵育1h。

　　取浓度分别为0，5，10，15，20，30，60pM的NF-κB p65纯品，按照实施例1中的检测NF-κB p65的方法制作标准曲线(图7标准曲线)。

　　检测上述7份加入了NF-κB p65后的检测体系的荧光强度，并制作曲线(见图7实验结果曲线)。图7显示了实验结果与标准曲线之间的比较。已知如果核提取液中不存在内源性干扰，则两条曲线的斜率应趋于一致。结果表明，该方法可以克服核提取液中内源成分的干扰。

　　表2