一种用于提高细胞钙流荧光检测的方法
技术领域
本发明属于细胞荧光检测领域，具体涉及一种用于提高细胞钙流荧光检测的方法。
背景技术
高通量筛选是药物发现中很重要的环节。在筛选分析过程中，细胞内钙离子的变化是广泛应用的监测细胞表面受体激活的有效指标。用于此技术的荧光标记物Calcium-6在和细胞内游离的钙离子结合后，它的荧光发射波长会发生变化。但是在实验过程中，常常会遇到荧光信号低、背景信号高等问题，严重影响结果判断。
发明内容
有鉴于此，本发明实施例期望提供一种用于提高细胞钙流荧光检测的方法，操作过程中简单，有效增强钙流信号、降低背景信号，可用于高通量筛选。
为达到上述目的，本发明采用一种用于提高细胞钙流荧光检测的方法，包括以下步骤：
a) 准备细胞板：将HEK-293-Mu细胞和HEK-293-D2细胞分别以每孔80000个细胞的密度种在96孔板中，培育16~24小时；
b) 配制含苋红缓冲液：取苋红粉末，溶解在高通量实时荧光检测缓冲液中，得含苋红缓冲液，浓度范围为0.1 mg/mL ~5 mg/mL；
c) 高通量实时荧光检测分析：将所述96孔板每个孔中加入100 μL的荧光染料溶液，放入培养箱中37℃下温浴1h~4h后，将所述96孔板中的荧光染料溶液吸干，在每孔中加入100μL的所述含苋红缓冲液，进行高通量实时荧光检测分析。
进一步地，所述96孔板为四周黑色，底部透明，预铺Poly-D-lysine。
进一步地，所述荧光染料溶液为Calcium-6溶液。
进一步地，所述步骤b)中配制含Amaranth缓冲液的浓度为0.5 mg/mL。
进一步地，所述步骤c)中放入培养箱中37℃下温浴1h。
本发明有益效果如下：本发明操作过程中简单，有效增强钙流信号、降低背景信号，可用于高通量筛选。
附图说明
图1为本发明一种用于提高细胞钙流荧光检测的方法流程示意图；
图2（A）为传统方法实施例（Calcium-6 Assay Kit）荧光强度在563-5021范围内高通量实时荧光检测分析图；
图2（B）为传统方法实施例（Calcium-6 Assay Kit）荧光强度在704-2000范围内高通量实时荧光检测分析图；
图3（A）为本发明实施例（Calcium-6 Assay Kit）荧光强度在563-5021范围内高通量实时荧光检测分析图；
图3（B）为本发明实施例（Calcium-6 Assay Kit）荧光强度在704-2000范围内高通量实时荧光检测分析图。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。
本发明一种用于提高细胞钙流荧光检测的方法流程如图1所示，包括如下：
步骤101：准备细胞板：将HEK-293-Mu细胞和HEK-293-D2细胞分别以每孔80000个细胞的密度种在96孔板中，培育16~24小时；
进一步地，所述96孔板为四周黑色，底部透明，预铺Poly-D-lysine。
步骤102：配制含苋红缓冲液，取苋红粉末，溶解在高通量实时荧光检测缓冲液中，得含苋红缓冲液，浓度范围为0.1 mg/mL ~5 mg/mL；
优选地，所述步骤102中配制含苋红缓冲液的浓度为0.5 mg/mL。
步骤103：高通量实时荧光检测分析，将所述96孔板每个孔中加入100 μL的荧光染料溶液，放入培养箱中37℃下温浴1h~4h后，将所述96孔板中的荧光染料溶液吸干，在每孔中加入100 μL的所述含苋红缓冲液，进行高通量实时荧光检测分析。
优选地，所述荧光染料溶液为Calcium-6溶液。
优选地，所述步骤103中放入培养箱中37℃下温浴1h。
至此，本发明一种用于提高细胞钙流荧光检测的方法流程结束。
下面通过列举具体实施例来阐述提高细胞钙流荧光检测的过程。
实施例1（传统方法）
步骤1：准备细胞板，将HEK-293-D2和HEK-293-Mu以每孔80000个细胞的密度种在96孔板中（孔板类型为四周黑色，底部透明，预铺Poly-D-lysine），培育16~24小时；
步骤2：高通量实时荧光检测分析，每孔加入100 μL的荧光染料溶液（Calcium-6溶液），放入培养箱中37℃下温浴1h，进行高通量实时荧光检测分析。
分析如图2（A）及图2（B）所示，其中1A-3H为HEK-293-D2细胞重复测量复孔，1A-3A为空白对照，1B至3H依次为浓度递减的多巴胺，即10 μM，2 μM， 400 nM，80 nM，16 nM，3.2nM，0.64 nM，0.0128 nM；4A-6H为HEK-293-Mu重复测量复孔，4A至6G依次为浓度递减的内啡肽，即10 μM，2 μM，400 nM，80 nM，16 nM，3.2 nM，0.64 nM，0.0128 nM，4H-6H为空白对照；图2（A）为荧光强度在563-5021范围内，图2（B）为荧光强度在704-2000范围内。
结果分析：如图2（B）所示，多巴胺在HEK-293-D2细胞上高通量实时荧光检测信号最大值为（775），内啡肽在HEK-293-Mu细胞上高通量实时荧光检测信号最大值为（1025），并且空白对照组有明显背景信号。
实施例2（本发明方法）
步骤1：准备细胞板，将HEK-293-Mu细胞和HEK-293-D2细胞分别以每孔80000个细胞的密度种在96孔板中（孔板类型为四周黑色，底部透明，预铺Poly-D-lysine），培育20小时；
步骤2：配制含苋红缓冲液，取苋红粉末，溶解在高通量实时荧光检测缓冲液中，得含苋红缓冲溶液，浓度为0.5 mg/mL；
步骤3：高通量实时荧光检测分析，将所述96孔板每个孔中加入100 μL的荧光染料溶液，放入培养箱中37℃下温浴1h后，将所述96孔板中的荧光染料溶液吸干，在每孔中加入100 μL浓度为0.5 mg/mL的含苋红缓冲液，进行高通量实时荧光检测分析。
分析如图3（A）及图3（B）所示，其中7A-9H为HEK-293-Mu重复测量复孔（苋红浓度为0.5mg/mL），7A至9A为空白对照，7B-9H依次为浓度递增的内啡肽，即13nM，41 nM，123 nM，370 nM，1.1 μM，3.3 μM，10 μM；10A-12H为HEK-293-D2重复测量复孔（苋红浓度为0.5mg/mL），10A至12A为空白对照，10B-12H依次为浓度递增的多巴胺，即0.64 nM，3.2 nM，16 nM，80 nM，400 nM，2 μM，10 μM；图3（A）为荧光强度在563-5021范围内的响应信号图，图3（B）为荧光强度在704-2000范围内的响应信号图。
结果分析：如图3（A）所示，多巴胺在HEK-293-D2细胞上高通量实时荧光检测信号最大值为（3973），内啡肽在HEK-293-Mu细胞上高通量实时荧光检测信号最大值为（4074），并且空白对照组无背景。
与传统方法对比，本发明有效增强了钙流信号、降低了背景信号，可用于高通量筛选。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非用于限定本发明的保护范围，故凡依照本发明专利范围所做的等效变化或修饰，均属于本发明专利权利要求范围内。
