诊断C3NeF介导的膜增生性肾小球肾炎的方法
本发明涉及诊断受试者中C3NeF介导的膜增生性肾小球肾炎的方法。该方法包括:
a)在板的至少两个孔中固定C3b;
b)在所述孔中形成表示替代途径的C3转化酶的C3bBb复合物,其中所述复合物的所述形成是通过在因子B(FB)、因子D(FD)、牛血清白蛋白(BSA)、镁离子的存在下,添加从患者和/或健康受试者分离的生物样品中纯化的IgG介导的;
c)使所形成的复合物脱离;
d)在变性条件下对所述复合物进行电泳并转移到膜上;
e)检测感兴趣的蛋白质Bb,其是C3转化酶的两种组分C3b和Bb之一;
其中,测量的在所述孔中的每个收集的样品中的Bb带的强度之比表示所述受试者中C3NeF活性。
背景技术
膜增生性肾小球肾炎(MPGN)是一种慢性进行性肾病,在肾病综合征的范畴中并以肾小球滤过膜病变和肾小球细胞高度增殖为特点。
肾病的原因是补体替代途径的过度激活,由补体基因的遗传改变(遗传形式)或由由于称为C3肾炎因子(C3NeF)的自身抗体的存在而导致的获得性改变(获得性或自身免疫形式)而引起。约50-80%的MPGN患者有C3NeF。
在MPGN中,观察到由替代补体途径激活而引起的,由于此因子的消耗,血浆C3水平较低。
替代途径的激活导致C3转化酶的形成,其负责C3到C3b的裂解。在正常情况下,循环C3的裂解以非常慢的速度发生,伴有极少量的C3b形成。如果它仍在循环中,这被丝氨酸蛋白酶因子I迅速失活为iC3b;然而如果它结合于外来细胞表面,例如细菌细胞,则它可以与称为因子B(FB)的血浆蛋白联接。C3b结合于FB形成酶原C3前体转化酶C3bB。在此复合物中,FB容易被称为因子D的循环蛋白酶裂解产生Ba片段。残余片段Bb仍结合于C3b构成C3bBb复合物,代表替代途径的活性C3转化酶C3bBb。C3转化酶代表替代补体途径的关键酶,因为它能够将大量的C3裂解成C3b和C3a,导致替代补体途径的激活过程的快速扩增,(C3转化酶的形成的扩增环)。为了避免补体替代途径的过度激活,在生理条件下,此级联由一系列调节物严格维持在控制下,这些调节物既循环又结合于人体自身细胞的膜。因子H(FH)是一种血浆蛋白,在调节循环中和细胞表面上的替代补体途径中具有重要作用。FH决定C3转化酶的解联接(FH介导的衰变),并在失活C3b(iC3b)中作为因子I的辅助因子。
替代补体途径的唯一正调节物是由备解素代表,一种血浆蛋白,其通过结合于C3bBb复合物,使其稳定,增加其半衰期。
C3NeF是针对C3bBb上表达的抗原决定簇的IgG自身抗体。C3NeF结合C3bBb,且此结合使C3bBb复合物稳定化。结合于C3转化酶的C3NeF防止了自发衰变和FH加速衰变二者。C3NeF的存在及其稳定复合物的能力是诊断MPGN的参数。从技术角度看,C3NeF的分析仍然存在很大的问题。传统上用于评估C3NeF存在和活性的方法基于在补体因子和从患者中分离的IgG的存在下的绵羊红细胞溶血作用(Fremeaux-Bacchi V等人Nephrology DialysisTransplantation,9(1994)1747–1750)。它是一种功能测试,评估补体系统激活的最终效果,且不允许研究激活机制。
Jin Seino等人,在Journal of Immunological Methods 159(1993)221-227中,公开了基于ELISA法测定C3NeF的方法。该方法包括将C3b固定在ELISA板中,在镍离子存在下形成C3bBb复合物。将测试样品血清加入孔中以测定C3NeF的活性,随血清样品中被结合于板上预先形成的C3bBb复合物的IgG的量而变化。该方法的限制是使用文献中已知的镍离子来稳定以上所有的C3前体转化酶C3bB,并仅在较小程度上稳定C3转化酶C3bBb。用这种ELISA方法,不可能区分有多少IgG结合于C3bB以及有多少结合于C3bBb。
Paixao Cavalcante等人,在Kidney International 82(2012)1084–1092中,公开了一种ELISA方法来评估IgG/C3NeF有限地对C3转化酶形成的影响,即他们以C3NeF强阳性样品作为参考,评估有多少IgG引起或多或少转化酶形成。此方法不评估C3NeF对酶复合物半衰期的影响。所述方法也不区分C3前体转化酶和C3转化酶的形成,其中两者都是通过相同的抗FB抗体用单信号检测到的。
Bettoni等人,在J Immunol 199(2017)1021-1040中,公开了一种将微板和蛋白质印迹组合的方法。由于电泳分离,该方法允许区分C3前体转化酶的形成(显示为93kDa的整个FB的带)和C3转化酶的形成(显示为60kDa的Bb的带)。然而,报道的方法没有描述C3转化酶衰变的评估。
强烈需要的是,在尽可能接近生理情况的环境中,不仅对C3NeF水平还要对C3NeF在C3转化酶衰变方面的活性进行正确评估的有效测定法,以允许对病理学做出准确的诊断。
发明内容
本发明涉及一种用于评估从患者血清分离的C3NeF对替代补体途径的C3转化酶的稳定作用的组合的板-蛋白质印迹方法。
附图说明
图1:表示根据本发明的方法的第一实施方式的WB图像和信号的相对量化。
图2:表示根据本发明的方法的第二实施方式的WB图像和信号的相对量化。
图3:表示根据本发明的方法的第三实施方式的WB图像和信号的相对量化。
具体实施方式
根据本发明的方法包括在孔中形成C3bBb复合物、其脱离以及通过蛋白质印迹分析评估对应于C3转化酶形成的Bb带的强度。通常使用96孔板的孔。
特别地,所述方法包括在孔中形成C3bBb复合物,其中在镁离子的存在下所述复合物的形成发生,从而获得限定的基线值。为了评估C3NeF对C3转化酶的稳定作用,在另外的孔中,在IgG/C3NeF存在下形成的C3转化酶复合物在没有(自发衰变)或存在FH(FH介导的衰变)的情况下孵育。在所述复合物从孔中脱离以及其电泳后,评估所述C3bBb复合物衰变前(基线)和衰变后Bb强度之比,测定C3NeF的稳定活性。
在第一实施方式中,根据本发明的方法包括:
a)将C3b固定在板孔中,优选96微孔板;
b)在FB、FD、BSA和镁离子存在下,向所述孔中添加从患者和/或健康受试者分离的生物样品中纯化的IgG以形成C3bBb复合物;
c)使所形成的复合物脱离;
d)所述复合物进行电泳,由于变性条件(存在SDS),C3转化酶的两种组分C3b和Bb解离,并将其转移到膜上;
e)检测感兴趣的蛋白质Bb,以获得限定的基线值
其特点在于,在添加纯化的IgG的所述步骤b)之后,在一个或多个孔中,在洗涤步骤后,在存在或没有FH的情况下进一步孵育,其中在经受所述进一步孵育的样品中,Bb带的测量强度与基线Bb带之比指示C3NeF活性。
当在所述进一步孵育后记录的Bb带强度值等于相对于同一样品的基线测量的值的至少34%或至少35%,优选至少37%,和/或在进一步孵育后Bb带强度的值在FH的存在下等于作为同一样品的基线测量的值的至少9%或至少10%,优选至少12%时,所述方法指示被测试的受试者的阳性。
优选地,使用在PBS缓冲液中稀释的纯化的人C3b(Complement Technology,USAUSA),在4℃下孵育过夜(ON)来进行所述固定步骤a)。用PBS洗涤后,通常在37℃下于PBS、1%BSA、0.1%吐温中孵育1小时,封闭非特异性位点,随后用洗涤缓冲液(8.1mM Na2HPO4、1.8mM NaH2PO4、0.1%吐温20、25mM NaCl和10mM MgCl2)洗涤。
优选地,在所述步骤b)中具有固定的C3b的孔在含有8.1mM Na2HPO4、1.8mMNaH2PO4、0.1%吐温20、0.5%BSA、10mM MgCl2和75mM NaCl的缓冲液中,在25℃下与IgG 100μg/ml、FB 1000ng/ml、FD 10ng/ml一起孵育12分钟。
优选地,在所述步骤c)中所述复合物通过在室温(RT)下在10mM EDTA、1%SDS中孵育1小时来脱离。
选地,步骤d)的所述电泳在添加0.1%SDS(变性条件)的10%聚丙烯酰胺凝胶上并在用3%β-巯基乙醇获得的还原条件下进行。电泳结束时,蛋白质被转移到膜上,且所述膜是PVDF膜(Biorad,Inc.USA)。该蛋白质用在补充有5%脱脂牛奶和0.1%吐温20的tris缓冲液(TBS)(阻断缓冲液)中1:10000稀释的山羊抗人FB一级抗体(Quidel)突出,在4℃下孵育过夜,然后在室温下与二级抗体结合1小时,该二级抗体由与HRP缀合的抗山羊IgG组成(Vector Laboratories,1:10000)。通过ECL系统(Amersham)读取信号。
使用NIH ImageJ软件(National Institutes of Health,USA)估算了对应于Bb蛋白质的60kDa的带强度(密度分析)的量化。
为了评估纯化的IgG对C3bBb复合物衰变的影响,一些孔也在缓冲液存在下孵育,优选32分钟,以评估自发衰变,或在FH存在下,优选2.640ng/mL,以评估FH介导的衰变。在用洗涤溶液洗涤后,我们按以上指示进行脱离剩余的复合物并进行电泳分离以及随后的带检测。基线样品和经受随后孵育的样品在有或没有FH下在相同凝胶上运行。从衰变后和衰变前60kDa带强度比获得的结果指示测试的样品中C3NeF活性。
在第二实施方式中,根据本发明的方法提供了在衰变步骤期间添加所述纯化的IgG。在所述实施方式中,在复合物形成的所述步骤b)期间不添加所述IgG。
所述第二实施方式包括以下步骤:
a)在板的孔中固定C3b;
b)在所述孔中添加FB、FD、BSA和镁离子;
c)在所述孔的至少第一个中,复合物形成和衰变步骤包括洗涤和在没有和/或存在FH的情况下与从受试者的生物样品中纯化的IgG孵育,以及在所述孔的至少第二个中,复合物形成和衰变步骤包括洗涤和在没有和/或存在FH的情况下与从对照样品中纯化的IgG孵育;
d)使形成的复合物脱离;
e)在变性条件下对所述复合物进行电泳,使两种组分C3b和Bb解离,并转移到膜上;
f)检测感兴趣的蛋白质Bb,以获得在存在从患者分离的IgG的情况下进行衰变步骤的孔中获得的样品的值,以及获得在存在从对照中分离的IgG的情况下发生所述衰变步骤的孔中获得的样品的值。
该方法还包括测量,在有或没有FH的情况下,在存在从被测试受试者的样品IgG的情况下衰变后所述Bb带与对照IgG的存在下发生衰变后所述Bb带的强度的强度比。
在优选实施方式中,在所述步骤c)中,制备用于所测试受试者的样品的至少两个孔,其中将FH添加到两个孔中的一个孔中,以及用于对照样品的至少两个孔,其中将FH添加到两个孔中的一个孔中。
所测试受试者的样品与对照样品的所述比在没有FH的情况下(自发衰变)为至少1.6或至少1.7,优选至少1.9,并且在存在FH的情况下(FH介导的衰变)为至少2或至少2.1,优选至少2.3的样品被视为阳性。
在第三实施方式中,根据本发明的方法允许评估备解素组合效果。在此实施方式中,在根据第一实施方式的方法的所述步骤b)期间,将备解素添加到孔中。测量衰变前后Bb带的强度比,对于在没有FH的情况下高于39%或40%,优选41%或42%或在存在FH的情况下大于8%、优选9%或10%的值,认为结果为阳性。
权利要求书限定了本发明的保护范围。以下实施例的唯一目的是示出根据本发明的方法的一些实施方式,并且决不能被理解为限制本发明本身的保护范围。
实施例1:来自健康或病理受试者的样品中C3NeF活性的分析
在存在从MPGN患者(IgG患者)或从健康对照(IgG对照)中纯化的C3NeF-IgG的情况下,在FB、FD和MgCl2情况下,通过在25℃下将其中固定了C3b的孔孵育12分钟形成C3转化酶复合物C3bBb(Mg2+)。分别在没有或存在FH的情况下,在25℃下进一步孵育32分钟后,监测自发或FH介导的衰变。WB分析的结果示于图1中。形成的C3转化酶的量计算为衰变后Bb带的密度测量值与基线对应的带的密度测量值的比(*100)。
分析通过测试来自健康供体的35个样品获得的结果的平均值±2Dev Std,其中在不存在FH而发生所述衰变的情况下,在衰变后观察到相对于基线高于36%的残余Bb带的样品被视为阳性,,或者在存在FH而发生所述衰变的情况下,在衰变后观察到相对于基线高于11%的残余Bb带的样品被视为阳性。
实施例2:C3NeF活性的分析,其中在衰变过程期间添加IgG。
通过在25℃下将其中固定C3b的孔与FB、FD和MgCl2孵育12分钟来形成C3转化酶复合物C3bBb(Mg2+)。一旦形成,将复合物在从MPGN患者(pat A)或从健康对照(CTR)纯化的C3NeF-IgG的存在下孵育,并经受自发或FH介导的衰变,分别在没有或存在FH的情况下在25℃下进一步孵育32分钟。WB分析的结果示于图2中。形成的C3转化酶的量计算为在患者IgG的存在下衰变后Bb带的密度测量值与在对照IgG的存在下衰变后Bb带的密度测量值的比。
分析通过测试来自健康供体的35个样品获得的结果的平均值±2Dev Std,其中所测试受试者的样品与对照受试者样品的比在没有FH的情况下高于1.9以及在存在FH的情况下高于2.3的样品被认为是阳性。
实施例3:备解素的组合效果
在存在从两种MPGN患者(patA、pat B)或从健康对照中纯化的C3NeF-IgG的情况下,通过将其中固定C3b的孔与FB、FD、MgCl2和备解素在25℃下孵育12分钟形成C3b转化酶复合物C3bBb(Mg2+)。(CTR)。分别在没有或存在FH的情况下,通过在25℃下进一步孵育32分钟来监测自发或FH介导的衰变。结果示于图3中。形成的C3转化酶的量计算为衰变后Bb带的密度测量值与基线对应的带的密度测量值的比(x100)。
分析通过测试来自健康供体的35个样品获得的结果的平均值±2Dev Std,其中在不存在FH而发生所述衰变的情况下,在衰变后观察到相对于基线高于41%的残余Bb带的样品被视为阳性,,或者在存在FH而发生所述衰变的情况下,在衰变后观察到相对于基线高于9%的残余Bb带的样品被视为阳性。