大豆中D-松醇的检测方法
技术领域
本发明属于化学分析及仪器分析技术领域，具体涉及一种大豆中D-松醇的检测方法。
背景技术
D-松醇，又名右旋肌醇甲醚、甲基肌醇、咳宁醇、山扁豆醇、3-甲基肌醇、蒎立醇，是多元环肌醇3位单甲醚化产物的一种异构体，广泛存在于松属植物、豆类、苜蓿类及许多植物的花和叶中。D-松醇具有类胰岛素作用，能起到降低调节机体血糖平衡、缓解胰岛素抵抗的作用，是一种新型的降血糖功能物质。此外，D-松醇还具有止咳、祛痰作用，以及抗炎和抗水肿活性，并且能够促进人体对肌酸的吸收，近年来被广泛应用作为医药原料和保健品添加剂。
由于D-松醇在紫外光下无吸收，因而无法采用液相色谱-紫外检测器检测。目前，测定D-松醇的方法基本都是高效液相色谱-示差折光检测法、高效液相色谱-蒸发光散射检测法以及气相色谱-质谱法。作为本行业公认的常识，高效液相色谱-示差折光检测法虽然具有样品前处理简单，操作方便的优点，但检测灵敏度低，对温度敏感，且不能用于梯度洗脱。高效液相色谱-蒸发光散射检测法同样检测灵敏度相对较低，且流动相必须是挥发性的，不能用非挥发性的缓冲盐和表面活性剂。气相色谱-质谱法需要复杂的衍生化操作，对仪器设备要求较高。
因此，建立一种简单方便、准确可靠、灵敏度高以及分析时间短的检测D-松醇的方法具有十分重要的意义。
离子色谱-脉冲安培检测法(IC-PAD)目前用于多种成分的检测，例如：
采用离子色谱-积分脉冲安培检测法(IC-IPAD)测定D-核糖，采用Carbo PacTMPA10色谱柱进行分离，60mmol/L NaOH溶液为淋洗液，流速0.6m L/min，柱温30℃，ED3000安培检测器，Au工作电极，Ti对电极，Ag/Ag Cl复合参比电极。以外标法定量D-核糖质量浓度为3.60～43.2mg/L范围内峰面积呈良好的线性关系(R2＝0.9999)，检出限及定量限分别为0.200、0.620ng，精密度实验的相对标准偏差(RSD)为0.524％,平均回收率为101％。
在线渗析-双柱串联离子色谱法直接检测婴幼儿乳粉中的肌醇建立了在线渗析-双柱串联离子色谱(IC)法直接检测婴幼儿乳粉中肌醇的方法。样品经蛋白沉淀后，通过在线渗析，采用Metrosep Carb 1(150×4.0mm,5μm)和Metrosep A SUPP 5(250×4.6mm,5μm)两根不同分离性质的色谱柱进行分离，流动相为10mmol/L NaOH溶液，等度洗脱,流速为0.5mL/min，安培检测器(金电极)直接测定婴幼儿乳粉中的肌醇。方法的线性范围为1.0～100.0mg/kg,方法检出限为0.5mg/kg，加标回收率为92.1％～103.8％；相对标准偏差RSD为2.1％～3.5％。
D-松醇与D-核糖、肌醇存在着特性等本质的区别，因此，目前尚未有利用IC-PAD进行大豆中D-松醇的检测。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种简单快速、灵敏度高的大豆中D-松醇含量的检测方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种大豆中D-松醇含量的检测方法，包括以下步骤：
(1)利用D-松醇标准品配制成工作液，采用离子色谱-脉冲安培检测法(IC-PAD)，得到一系列的D-松醇标准色谱图；
绘制D-松醇的浓度与色谱峰面积的关系曲线图(并得到校准曲线)；
(2)大豆样品前处理：
在0.5g大豆粉末中加入80mL乙腈水溶液(v/v:1/1)，超声提取(30±10)min后，用去离子水定容至100mL，摇匀，离心，8000±1000r/min离心8～12min，离心后的上清液经稀释、过滤后作为样品待检液；
所述乙腈水溶液中，乙腈：水＝1:1的体积比；
(3)、将样品待检液按照步骤(1)的离子色谱-脉冲安培检测法进行检测，得到D-松醇峰面积；
带入步骤(1)所得的关系曲线图(校准曲线)中，获得样品待检液中D-松醇的浓度，最终获得大豆中D-松醇的浓度。
注：将样品待检液按照步骤(1)的离子色谱-脉冲安培检测法进行检测，根据标准色谱图和样品色谱图的保留时间确定大豆样品中的D-松醇，得到其色谱峰面积，根据校准曲线计算大豆中D-松醇的含量。
作为本发明的大豆中D-松醇的检测方法的改进：步骤1)的离子色谱-脉冲安培检测法的条件为：
(1)色谱柱：Thermo Scientific CarboPac MA1保护柱(50mm×4mm i.d.)+分析柱(250mm×4mm i.d.)，7.5μm；
(2)柱温：30℃；
(3)流速：0.4～0.5mL/min；
(4)进样量：25μL；
(5)淋洗液：0.5mol/L NaOH；
(6)脉冲安培检测：金工作电极，pH-Ag/AgCl复合参比电极，Ti对电极；
(7)检测池温度：35℃；
(8)检测电位波形：
脉冲安培检测电位波形
作为本发明的大豆中D-松醇的检测方法的进一步改进，步骤1)为：
称取D-松醇标准品，用去离子水配制成浓度为1.0mg/mL的标准储备液，用去离子水逐级稀释，从而相应配制成浓度为0.1mg/L～100mg/L的标准工作液，将D-松醇标准工作液采用离子色谱-脉冲安培检测，得到D-松醇标准色谱图，并绘制D-松醇的浓度与色谱峰面积的关系曲线图。
作为本发明的大豆中D-松醇的检测方法的进一步改进，步骤1)为：配制成0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100mg/L这8种不同浓度的标准工作液。
作为本发明的大豆中D-松醇的检测方法的进一步改进，步骤(2)中，离心后的上清液经稀释15～25倍(体积倍)、采用0.22μm滤膜过滤。
作为本发明的大豆中D-松醇的检测方法的进一步改进，步骤(1)所得的线性方程为y＝4.3667x+2.8948，x为浓度(mg/L)，y为峰面积。
本发明提供了一种大豆中D-松醇含量的检测方法，本发明提供的离子色谱-脉冲安培检测方法克服了D-松醇在紫外光下无吸收，因而无法用液相色谱紫外检测器检出的问题，解决了液相色谱-示差折光和液相色谱-蒸发光散射检测灵敏度低的问题，以及解决了气相色谱需要衍生化复杂操作的问题。
本发明提供的检测方法简单方便快速，经过线性关系实验、重复性实验和加样回收实验等方法学验证，线性范围为0.1mg/L～100mg/L，线性方程为y＝4.3667x+2.8948，线性相关系数r为0.9994，加标回收率为92.4％～98.6％，相对标准偏差RSD为1.78％，证明该方法线性范围宽，准确可靠，重复性好，分离效果好，灵敏度高(检出限为6.59μg/L)。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为浓度为10.0mg/L的D-松醇标准溶液的色谱图。
图2为D-松醇浓度与色谱峰面积关系标准曲线图。
图3为大豆样品色谱图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1、一种大豆中D-松醇的检测方法，具体实施步骤如下：
1)、配制D-松醇标准溶液并进行离子色谱-脉冲安培检测(IC-PAD)。
精确称取D-松醇标准品100mg置于100mL容量瓶中，用去离子水超声溶解定容至刻度作为标准储备液；将此标准储备液用去离子水逐级稀释，分别配成D-松醇标准溶液浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100mg/L的8种标准工作液。
将上述不同浓度的标准溶液(标准工作液)分别进行离子色谱-脉冲安培检测，并得到标准色谱图，色谱条件：
(1)色谱柱：Thermo Scientific CarboPac MA1保护柱(50mm×4mm i.d.)+分析柱(250mm×4mm i.d.)，7.5μm；
(2)柱温：30℃；
(3)流速：0.5mL/min；
(4)进样量：25μL；
(5)淋洗液：0.5mol/L NaOH；
(6)脉冲安培检测：金工作电极，pH-Ag/AgCl复合参比电极，Ti对电极；
(7)检测池温度：35℃；
(8)检测电位波形：见表1；
表1、脉冲安培检测电位波形
其中浓度为10.0mg/L的标准溶液的色谱图如图1所示，其他浓度结果基本同图1。
绘制D-松醇浓度与色谱峰面积关系曲线图；图2为D-松醇的浓度与色谱峰面积关系标准曲线图。
D-松醇的保留时间为7.167min，线性范围为0.1mg/L～100mg/L，线性方程为y＝4.3667x+2.8948，x为浓度(mg/L)，y为峰面积；线性相关系数r为0.9994，方法检出限为6.59μg/L，定量限为22.40μg/L。
2)、大豆样品前处理及离子色谱-脉冲安培检测
称取0.5g(精确至0.001g)大豆粉末样品(试样)于100mL容量瓶中，加入80mL乙腈水溶液(v/v:1/1)，超声提取30min后，用去离子水定容至100mL，摇匀，8000r/min离心10min，离心后的上清液经稀释20倍(即，在上清液中加入上清液19体积倍的去离子水)，经0.22μm滤膜过滤；取滤液进行离子色谱-脉冲安培检测。
离子色谱-脉冲安培检测条件同上述步骤1)，从而直接从离子色谱仪器的软件工作站上获得大豆样品色谱图和大豆样品中D-松醇峰面积数据。
3)、大豆样品中的D-松醇含量的确定。
根据样品色谱图的保留时间确定D-松醇，将其色谱峰面积代入上述步骤1)所得的标准曲线方程(线性方程)，得到样品溶液中D-松醇的浓度。
再根据以下公式(1)计算大豆样品中D-松醇的含量。
式中：
X—试样中D-松醇的含量，单位为毫克每千克(g/kg)；
C—试样中D-松醇响应值对应的浓度(即，样品溶液中D-松醇的浓度)，单位为毫克每升(mg/L)；
V—试样定容体积，单位为毫升(mL)；
m—试样的质量，单位为克(g)；
f—稀释倍数。
采用离子色谱-脉冲安培检测法测得大豆中D-松醇的含量为2.56g/kg。
验证实验、将实施例1的大豆样品采用本行业公认的检测精度高的气相色谱-质谱法进行D-松醇浓度的检测，所得结果为2.53g/kg。
实验1、加样回收实验
添加D-松醇标准溶液至大豆样品中(即，大豆样品中D-松醇的添加浓度为2.5g/kg)，设置3个重复；测得大豆样品中D-松醇的加标回收率为92.4％～98.6％，相对标准偏差RSD为1.78％，说明本方法能保证检测结果的准确性和重复性，符合检测要求，适合大豆中D-松醇的检测。
实验2、线性关系实验
精确称取D-松醇标准品100mg置于100mL容量瓶中，用去离子水超声溶解定容至刻度作为标准储备液；将此标准储备液用去离子水逐级稀释，分别配成D-松醇标准溶液浓度为0.1mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100mg/L的8种标准工作液。将上述不同浓度的标准溶液注入离子色谱仪，分别进行离子色谱-脉冲安培检测，从仪器软件工作站并得到标准色谱图和D-松醇峰面积，绘制D-松醇浓度与色谱峰面积关系曲线图，由此可得知线性范围为0.1mg/L～100mg/L，线性方程为y＝4.3667x+2.8948，线性相关系数r为0.9994，方法检出限为6.59μg/L，定量限为22.40μg/L
因此得知线性范围为0.1mg/L～100mg/L。
对比实验1-1、将实施例1中的淋洗液由“0.5mol/L NaOH”改成“0.2mol/L NaOH”，其余等同于实施例1。由于淋洗液浓度降低，D-松醇在60min内未能出峰，极大地延长了分析时间。因此，无法实现本发明的快速检测的要求。
对比实验1-2、将实施例1中的淋洗液由“0.5mol/LNaOH”改成“1mol/L NaOH”，其余等同于实施例1。由于淋洗液浓度太高，D-松醇出峰时间接近系统杂质出峰时间(4.5min)，大豆样品中的基质对D-松醇的测定造成干扰。导致无法实现大豆中D-松醇含量的有效检测。
对比实验2-1、将实施例1中的色谱柱改为Thermo Scientific CarboPac PA10，按照该色谱柱的要求，淋洗液采用浓度为10mmol/L的NaOH溶液或者更低浓度的淋洗液，其余等同于实施例1。D-松醇在该色谱柱上不保留，无法实现其测定。
对比实验2-2、将实施例1中的色谱柱改为Metrosep Carb 1或Metrosep A SUPP5，按照该色谱柱的要求，淋洗液采用浓度为10mmol/L的NaOH溶液，其余等同于实施例1。D-松醇在该色谱柱上不保留，无法实现其测定。
对比实验3-1、将实施例1中的乙腈水溶液由乙腈：水的体积比由“1/1”改成“80:20”，或者其余等同于实施例1。并带入其对应的关系曲线图中，所得结果为大豆中D-松醇的含量约为2.2g/kg。
对比实验3-2、将实施例1中的乙腈水溶液由乙腈：水的体积比由“1/1”改成“60:40”，其余等同于实施例1。并带入其对应的关系曲线图中，所得结果为大豆中D-松醇的含量约为2.25g/kg。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
