一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法及其应用
技术领域
本发明属于荧光共振能量转移(FRET)检测技术领域，特别涉及一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法及其应用。
背景技术
定量FRET显微术已经成为在活细胞中研究生化分子动态过程的重要工具。定量FRET检测技术不仅可以用于活细胞中分子结合与分离的实时动态研究，而且还可以用于活细胞中生物单分子结构信息比的测量。
基于三个滤光片组合的FRET显微成像术(简称3-cube FRET microscopy，E-FRET方法)。要求分别利用三个不同的荧光滤光片组对FRET样本得到三种图像：供体通道图像(IDD，通过供体激发光激发时在供体荧光探测通道探测到的供体荧光)，受体通道图像(IAA，通过受体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的受体荧光)，FRET通道图像(IDA，通过供体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的荧光)。
系统矫正参数(G因子和k因子)以及供受体消光系数比(γ)是定量FRET检测的关键参量[Zal T,Gascoigne N R J.Photobleaching-corrected FRET efficiency imagingof live cells[J].Biophysical journal,2004,6(6):3923-3939；Butz E S,Ben-JohnyM,Shen M,et al.Quantifying macromolecular interactions in living cells usingFRET two-hybrid assays[J].Nature protocols,2016,11(12):2470-2498；Ben-Johny M,Yue DN,Yue DT.Detecting stoichiometry of macromolecular complexes in livecells using FRET[J].Nature communications,2016,7(1):1-0]。G因子表示的是敏化受体发射的荧光(Fc)占由于发生FRET使供体发生淬灭的荧光的比值；k因子表示的是在没有发生FRET的情况下相同摩尔浓度的供受体荧光强度的比值；消光系数比γ指的是受体-供体在供体激发波长处的消光系数之比【εYFP(λex,D)/εCFP(λex,D)】。对于一种给定的FRET荧光团对和成像系统，矫正参数和消光系数比是一个恒量。测量获得可靠的G因子、k因子以及消光系数比γ是定量FRET测量的关键。
目前已有多种测量G因子的方法。Zal和Gascoigne[T.Zal and N.R.J.Gascoigne,“Photobleaching-corrected FRET efficiency imaging of live cells,”Biophys.J.86(6),3923–3939(2004)]提出一种基于逐渐漂白固定FRET细胞样本的受体来确定G因子的方法，该方法需要同时测量漂白前后FRET样本三个通道的图像，至少需要转换滤光片组(cube)4次。Nagy等人[Nagy,Peter,et al.“Novel calibration method for flowcytometric fluorescence resonance energy transfer measurements betweenvisible fluorescent proteins,”Cytometry Part A 67(2)86-96(2005)]通过三种供受体浓度比为1:1且E值不同的FRET串联结构来确定G值，这种方法需要的活细胞样本多，实验过程繁琐，数据处理较为困难。Chen等人[H.Chen et al.,“Measurements of FRETEfficiency and Ratio of Donor to Acceptor Concentration in living Cells,”Biophys.J.91(5),L39-L41(2006)]提出在活细胞中用两个供受体浓度比为1:1且E值未知的FRET串联结构来确定G因子，这种方法需要准备两种效率不同的FRET活细胞样本，并且两种FRET样本必须在完全相同的条件下测量。本小组[J.Zhang et al.,“Reliablemeasurement of the FRET sensitized-quenching transition factor for FRETquantification in living cells,”Micron 88,7-15(2016).]提出将两种转染了不同质粒的细胞放在同一个细胞培养皿中进行G值测量的方法，克服了对两皿细胞保持完全相同测量条件的限制，提高了G值测量的稳定性。该方法首先保证了表达两种FRET质粒的细胞在相同条件下测量的前提，其次只需要对一皿细胞进行数据采集，不仅提高了实验效率，而且为发展在线的统矫正参数和供受体消光系数比的测量技术成为可能。这样做带来的缺点也是存在的，如何区分表达了不同质粒的细胞，是一个亟待解决的难题。理论上不同质粒的FRET效率相差越大，测得的G因子越准确，而FRET效率相对较低或表达的不同质粒FRET效率较接近的，信号容易被埋没于其他信号中，不易区分，造成数据不完整的情况。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法。
本发明的另一目的在于提供所述同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法，包括如下步骤：
(1)串扰系数测量：
将供体质粒和受体质粒(串扰校正样本)分别转染细胞，然后分别进行E-FRET成像，获得三通道平均荧光强度IDD、IAA、IDA，并计算得到串扰系数a，b，c和d；
(2)测量FRET质粒单独转染细胞的FCi-N/IDDi-N比例值范围：
①将i种效率不同的FRET质粒分别单独转染细胞，待细胞贴壁后，从转染每种质粒的细胞中分别选取N个以上的细胞或区域进行E-FRET成像，分别获得转染第1种质粒的细胞或区域的三通道平均荧光强度IDD1-1、IDD1-2……IDD1-N，IAA1-1、IAA1-2……IAA1-N，IDA1-1、IDA1-2……IDA1-N，并计算受体敏化荧光强度FC1-1、FC1-2……FC1-N，再计算比值R，为R1-1＝FC1-1/IDD1-1、R1-2＝FC1-2/IDD1-2……R1-N＝FC1-N/IDD1-N，然后根据转染第1种质粒的N个以上的细胞或区域的全部比值R，以0.01～0.1(优选为0.1)为区间间隔作统计直方图，根据结果选择峰值的半高宽度(半峰全宽、半峰宽)作为转染第1种质粒的细胞的比值范围R1，或在统计直方图的峰值对应的R值的基础上加减0.01～0.1作为比值范围R1，或根据最大值和最小值确定比值范围R1；再采用相同的方法，分别获得转染第2种质粒至第i种质粒的细胞的比值范围，为R2、R3……Ri；其中，i≥2且为整数；N≥20且为整数；
(3)测量混合培养多种FRET质粒单转细胞的FCi′/IDDi′比例值：
将步骤(2)中的各种FRET质粒分别单独转染细胞，待转染的质粒表达成功后，将表达不同FRET质粒的细胞合并在同一个培养皿中培养，待细胞贴壁后选取m个以上的细胞或区域进行E-FRET成像，分别获得三通道平均荧光强度IDD1′、IDD2′……IDDm′，IAA1′、IAA2′……IAAm′以及IDA1′、IDA2′……IDAm′，并根据步骤(1)中得到的串扰系数a，b，c，d分别计算得到受体敏化荧光强度FC1′、FC2′……FCm′，再计算比值R1′＝FC1′/IDD1′、R2′＝FC2′/IDD2′……Rm′＝FCm′/IDDm′；其中，m≥5；
(4)细胞分类：
根据步骤(3)中得到的R1′、R2′……Rm′的大小，将其对应的细胞归类到步骤(2)的细胞类型中：如R1′在R1的范围内，即R1′对应的细胞为转染第1种质粒的细胞，如R1′在R2的范围内，即R1′对应的细胞为转染第2种质粒的细胞，如R1′在Ri的范围内，即R1′对应的细胞为转染第i种质粒的细胞；以此类推，分别将R2′……Rm′进行归类；
(5)计算或拟合得到G因子、k因子和消光系数比γ：
根据步骤(4)的归类和步骤(3)中获得的数据，在i种质粒中至少选择2种以上质粒对应的细胞的平均荧光强度和受体敏化荧光强度，记为IDD1″、IDD2″……IDDi″，IAA1″、IAA2″……IAAi″，FC1″、FC2″……FCi″，对各种转染质粒的细胞或区域计算y1＝FC1″/(a×IAA1″)和x1＝IDD1″/(a×IAA1″)，y2＝FC2″/(a×IAA2″)和x2＝IDD2″/(a×IAA2″)……yi＝FCi″/(a×IAAi″)和xi＝IDDi″/(a×IAAi″)，再以此计算G因子、k因子和消光系数比γ，分为如下两种情况：
当i＝2时：G＝(y2-y1)/(x1-x2)；k为每个细胞或区域的k因子的平均值；γ＝a/(G×k)；
当i>2时，将以x1，x2……xi为横坐标，以y1，y2……yi为纵坐标，通过最小二乘法拟合得到一条直线，该直线斜率的绝对值为G因子，直线y轴截距的倒数为消光系数比γ，最后计算k因子，即每个细胞或区域的k因子的平均值。
所述的同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法，在步骤(1)～(3)中进行E-FRET成像，测量得到供体荧光强度，受体荧光强度，FRET荧光强度时，对三个通道图像进行细胞或区域分割，将无细胞区域作为背景，进行背景扣除。
步骤(1)中所述的供体质粒和受体质粒是作为串扰校正样本，用于测量串扰系数，即单独转染供体质粒的细胞用于用来测量串扰系数c，d，单独转染受体质粒的细胞用于用来测量串扰系数a，b；优选为Cerulean(C)和Venus(V)，购自美国addgene质粒库。
步骤(2)中所述的i的种类为2～4种；优选为4种。
步骤(2)中所述的FRET质粒可通过调整供体和受体之间的距离，构造得到FRET效率不同的FRET质粒；FRET质粒的效率也可预先通过寿命测量方法、E-FRRT测量方法或者光谱线性分离等方法测量得到(本发明无需确切知道各个质粒的具体效率)；所述的FRET质粒包括供体和受体的个数(浓度)比为1：n或n：1的FRET质粒(C-V体系的标准质粒)，n≥1；优选为供体和受体的个数(浓度)比为1：1的FRET质粒；更优选为C5V、C17V、C32V和CTV中的至少两种。
步骤(2)中，由于转染不同质粒的细胞的表达水平不一样，所以需要对转染不同质粒的细胞进行E-FRET成像，用于提前划分Ri取值范围(Ri是一个范围值)。
步骤(2)中所述的区域可以根据实际情况进行圈定，可以是包含整个细胞，或者是细胞的一部分。
步骤(2)中所述的N的取值范围优选为N≥50(细胞或区域的数量越多越好)。
步骤(2)中所述的细胞的选择可通过如下方式实现：将装有转染质粒的细胞的培养皿放置在宽场荧光显微镜下，选择了10个以上的不同视野，然后在每个视野选择1～3个(或2～3个)细胞或区域进行测定，测定的细胞或区域的个数一般不少于20个(优选为不少于50个细胞或区域)。
步骤(2)中所述的峰值的半高宽度优选为通过如下方法得到：将获得的R1-1、R1-2……R1-N，以0.01～0.1为区间间隔进行统计，作直方图，将比值R出现的最高频率记为M，然后将M/2处所对应的左右两个R值区间的闭区间即为所述的峰值的半高宽度。
所述的区间间隔可根据实际情况进行设置，优选为0.1。
步骤(2)中所述的根据最大值和最小值确定比值范围R1适用于FRET效率相差较大的质粒。
步骤(3)中所述的m的取值范围优选为m≥8；更优选为m≥10。
步骤(1)、(2)和(3)中所述的E-FRET成像为基于三个滤光片组合的FRET显微成像术，均可通过一键操作获得定量测量结果。
步骤(3)中，进行E-FRET成像时，可以一次获取多个不同视野的图像，然后分别测定不同视野下的细胞的三通道平均荧光强度IDD、IAA、IDA，然后计算获得比值R。
步骤(4)中所述的细胞分类为用于区分转染不同质粒的细胞。
步骤(5)中所述的k因子通过如方法计算得到：分别计算每个细胞或区域的k因子k1＝(IDD1″+FC1″/G)/IAA1″、k2＝(IDD2″+FC2″/G)/IAA2″……ki＝(IDDi″+FCi″/G)/IAAi″，然后取平均值。
所述的同时自动测量FRET系统矫正参数和供受体消光系数比的方法在E-FRET检测中的应用。
本发明的基本原理如下：
本发明是基于本小组提出的基于双质粒/多质粒的G因子测定方法(称为mTP-G)[Zhang J,Zhang L,Chai L,et al.Reliable measurement of the FRET sensitized-quenching transition factor for FRET quantification in living cells[J].Micron,2016,88:7-15.]，可以实现快速可靠地测定G因子。k因子和消光系数比γ测量分别基于如下文献[T.Zal and N.R.J.Gascoigne,“Photobleaching-corrected FRETefficiency imaging of live cells,”Biophys.J.86(6),3923–3939(2004)；H.Chen etal.,“Measurements of FRET Efficiency and Ratio of Donor to AcceptorConcentration in living Cells,”Biophys.J.91(5),L39-L41(2006)；Butz E S,Ben-Johny M,Shen M,et al.Quantifying macromolecular interactions in living cellsusing FRET two-hybrid assays[J].Nature protocols,2016,11(12):2470-2498；Ben-Johny M,Yue DN,Yue DT.Detecting stoichiometry of macromolecular complexes inlive cells using FRET[J].Nature communications,2016,7(1):1-0].
具体理论公式如下：
Fc＝IDA-a(IAA-cIDD)-d(IDD-bIAA) (1)
式中，n为供体受体浓度比(如本发明中的标准质粒C5V、C17V、C32V和CTV的供体受体浓度比都是1：1)。
其中用分别单独转染了Cerulean(简称C)和Venus(简称V)的细胞测量四个光谱串扰系数：
a＝IDA(A)/IAA(A) (5)
b＝IDD(A)/IAA(A) (6)
c＝IAA(D)/IDD(D) (7)
d＝IDA(D)/IDD(D) (8)
a是受体激发串扰系数，b是受体发射串扰系数，c是供体激发串扰系数，d是供体发射串扰系数；A为供体，D为受体。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明提供了一种利用表达不同供受体FRET质粒的同一皿细胞完成自动在线测量G因子、k因子和消光系数比γ的技术。该技术对于实时采集到的细胞图像不仅能够进行细胞分割和表达不同质粒的细胞分类，而且还可以基于这种细胞种类自动分类的同时自动测量G因子、k因子和消光系数比γ。基于该技术可以实现一键式自动在线测量系统G因子、k因子和消光系数比γ，具有很高的稳定性和可靠性。
附图说明
图1是分别表达了CTV和C17V质粒的样本在一个皿中的一个成像视野，按不同细胞进行处理得到的两种质粒的R值的统计图(图中1-6为用圈区域的方法圈取了不同细胞的5个不同区域和1个背景区域，最终得到每个区域的平均灰度值，并用来计算相关中间量和最终结果)。
图2是分别表达了CTV、C5V、C17V和C32V四种质粒的样本在一个皿中的成像图、R值的统计图以及通过最小二乘法拟合得到的直线图；其中，a为分别表达了CTV、C5V、C17V和C32V四种质粒的样本在一个皿中的成像视野(图中1-9为用圈区域的方法圈取了不同细胞的8个不同区域和1个背景区域，最终得到每个区域的平均灰度值，并用来计算相关中间量和最终结果)；b为不同细胞区域按表达了不同质粒进行区分的R值的统计图；图c为该视野细胞中得到的不同质粒的数据，通过最小二乘法拟合得到的直线，根据这条直线，可以拟合计算出G因子、k因子和消光系数比γ。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。
实施例1
1.质粒
给定的供体受体对：供体为Cerulean(简称C)，受体为Venus(简称V)。
FRET串联质粒结构C5V：由5个氨基酸的连接序列将C和V链接组成的FRET串联质粒结构。
FRET串联质粒结构C17V：由17个氨基酸的连接序列将C和V链接组成的FRET串联质粒结构。
FRET串联质粒结构C32V：由32个氨基酸的连接序列将C和V链接组成的FRET串联质粒结构。
FRET串联质粒结构CTV：由229个氨基酸的连接序列将C和V链接组成的FRET串联质粒结构。
来源：供体质粒Cerulean(C)、受体质粒为Venus(V)、C5V、C32V和FRET参照质粒C17V、CTV均购于美国addgene质粒库。
2.宽场光谱显微成像系统
宽场荧光显微镜产自德国卡尔蔡司公司，型号为Axio Observer7。光源是LumenDynamics公司的X-Cite120Q。物镜是放大倍数为40、数值孔径为1.3(40×1.3NA)的油镜，一个装有六个cube(每个cube中可安装激发片、分光片、发射片各一个)的转轮，外接一个CCD相机。激发光波长通过转动cube转轮进行选择。
3、细胞培养以及质粒转染
Hela细胞来自中国广州暨南大学，用DMEM培养基加入10％(v/v)的新生牛血清放在含有5％(v/v)二氧化碳的37℃的培养箱中培养。细胞用胰蛋白酶消化，转到细胞培养皿中，培养24小时后，当细胞生长至70～90％时，用体外转染试剂TurbofectTM将质粒短暂转入细胞。转染的具体步骤如下：
(1)取一只灭菌的EP管，先向其中加入100μL无血清的DMEM培养基，然后向其中加入1～2μL的转染试剂，再向其中加入1～2μL(500～600ng/μL)的质粒，轻轻吹打6～8次后静置20分钟；
(2)20分钟后，再将100μL的无血清的DMEM培养基加入到EP管中，轻轻混匀；
(3)用无血清的DMEM培养基或PBS清洗培养皿中细胞2～3次，主要洗去死细胞等脏污，然后把上述步骤(2)中的混合物移到培养皿中，把培养皿重新放回培养箱中4～6小时；
(4)对于一个培养皿的细胞中包含单个质粒的样本，在完成步骤(3)4～6小时后，吸去转染液，然后用无血清的DMEM培养基或PBS清洗培养皿中细胞2～3次，再往培养皿中加入含有新生牛血清的DMEM培养基，培养24～48小时即可用于实验。
(5)对于一个培养皿的细胞中包含多质粒的样本，其制备方法为：分别将所需的单独转染质粒的细胞在完成步骤(3)4～6小时后，吸去转染液，然后用用无血清的DMEM培养基或PBS清洗培养皿中细胞2～3次，再往培养皿中加入含有新生牛血清的DMEM培养基，培养16～40小时后使用100μL胰酶细胞消化液将不同培养皿中的转染了不同质粒的细胞消化下来，吸走消化液，然后用100μL无血清的DMEM培养基将轻轻吹打细胞2～3次，将不同培养皿中吹打下的细胞悬浊液放入同一只EP管中，混匀2～3次，再重新放入新的培养皿中，以DMEM培养基比胎牛血清为10：1(体积比)的比例，加入胎牛血清，再培养8小时即可用于实验。
4.测量样本
4.1按上述质粒转染步骤分别单独转染C样本、V样本以及FRET串联参照样本CTV、C5V、C17V和C32V进入Hela细胞，在测量一个培养皿的细胞中包含多质粒的样本时需提前8个小时，将转染不同质粒的细胞消化后混匀到一个培养皿中。本实验制作了如下两个串扰系数校正样本，四个单转FRET串联参照样本和两个实验样本：
串扰校正样本1：单独转染C样本，用来测量串扰系数c，d。
串扰校正样本2：单独转染V样本，用来测量串扰系数a，b。
CTV参照样本：单独转染CTV样本，用来测量RCTV(R为受体敏化荧光强度FC与供体荧光强度的比值)的范围。
C5V参照样本：单独转染C5V样本，用来测量RC5V的范围。
C17V参照样本：单独转染C17V样本，用来测量RC17V的范围。
C32V参照样本：单独转染C32V样本，用来测量RC32V的范围。
实验样本1：CTV+C17V双质粒样本，即将单独转染CTV的细胞和单独转染C17V的细胞消化后混匀到一个培养皿中。
实验样本2：CTV+C5V+C17V+C32V四质粒样本；即将单独转染CTV的细胞、单独转染C5V的细胞、单独转染C17V的细胞和单独转染C32V的细胞、消化后混匀到一个培养皿中。
4.2具体测量过程如下：
宽场荧光显微镜进行如下配置：采用436±12.5nm、510±8.5nm的光分别作为Cerulean和Venus的激发光，采用480±11nm、530±15nm的通道分别作为Cerulean和Venus荧光的探测通道。
注：如无特殊说明，本实验中的三通道荧光强度均为平均荧光强度。
(1)用串扰系数校正样本进行串扰系数测量：
用单独转染C的Hela细胞(即串扰校正样本1)和单独转染V的Hela细胞(即串扰校正样本2)分别进行三通道荧光成像，采集供体荧光强度IDD、受体荧光强度IAA、FRET荧光强度(通过供体激发光激发时在受体荧光探测通道探测到的荧光)IDA三通道平均荧光强度(IDD C＝0.78730、IDA C＝0.48561、IAA C＝0.00378；IDD V＝0.0530、IDA V＝0.6666、IAA V＝4.8164)，并根据公式(5)～(8)计算得到串扰系数a＝0.1384，b＝0.0110，c＝0.0048，d＝0.6168。
(2)测量参照样本CTV、参照样本C5V、参照样本C17V和参照样本C32V：
①对转染不同参照样本的细胞分别进行三通道荧光成像，采集供体荧光强度IDD、受体荧光强度IAA、FRET荧光强度IDA三通道平均荧光强度(分别为IDD CTV＝1.796、IDA CTV＝1.976、IAA CTV＝3.433；IDD C5V＝0.306、IDA C5V＝1.143、IAA C5V＝1.069；IDD C17V＝1.438、IDA C17V＝4.143、IAA C17V＝4.314；IDD C32V＝2.140、IDA C32V＝4.690、IAA C32V＝5.302)，根据这三通道的平均荧光强度及步骤(1)中计算得到的串扰系数a，b，c，d和公式(1)，取细胞的部分区域计算受体FRET敏化荧光强度FC(FC CTV＝0.418、FC C5V＝0.814、FC C17V＝2.689、FC C32V＝2.674)，再计算受体敏化荧光强度FC与供体荧光强度的比值R值(分别为RCTV＝FC CTV/IDD CTV＝0.233、RC5V＝FC C5V/IDD C5V＝2.659、RC17V＝FC C17V/IDD C17V＝1.870、RC32V＝FC C32V/IDD C32V＝1.249)。
②按照上述步骤①的方法，对不同参照样本分别测定至少20个细胞或区域(最好50个细胞或区域以上，本实验选择了约20个不同视野，每个视野选择2-3个典型的细胞或区域进行测定，这里的圈定的区域可大可小，如细胞中的一部分区域或含有细胞的区域)，相应计算得到每个细胞或区域的R值，然后通过如下方式确定R值的取值范围：将获得的每个细胞或区域的R值作直方图，其中直方图为将上述获得的全部R值以0.1的间隔进行区间划分(横坐标)，获得相应区间内R值的频率(即R出现在这个区间的个数)(纵坐标)，将R值出现的最高频率记为M，R值的取值范围为M/2处所对应的左右两个R值区间的闭区间(即峰值的半高宽度)，然后根据统计结果选择峰值的半高宽度作为R值的取值范围，即：-0.25≤RCTV≤0.25、0.75≤RC32V≤1.25、1.55≤RC17V≤2.05、2.15≤RC5V≤2.65。当然，也可以采用其他的方式确定R值的取值范围，如根据上述获得的每个细胞或区域的R值的最大值和最小值确定(适用于FRET效率相差较大的质粒，如本实施例中的质粒；对于一些FRET效率相差不大的质粒，在进行细胞分类时容易导致错分)；还可以是±Δ的方式确定R值的取值范围，其中±Δ为上述峰值(最高频率)的对应的R值的基础上加减0.01～0.1获得的区间值即为R值范围。上述三种方法中，选择能够用于后续区分不同细胞内转染的不同质粒即可。
(3)对实验样本1和实验样本2进行G因子，k因子和消光系数比γ的测量：
①对实验样本1(CTV+C17V双质粒样本)的Hela细胞进行三通道荧光成像，选择不同视野下的不同细胞或区域进行(选定的细胞个数或区域越多越好，最好大于10个细胞或区域)，扣除背景及曝光时间归一化获得三通道的平均荧光强度，然后分别计算每个细胞或区域的受体敏化荧光强度FC′和R′值(FC′/IDD′)，并取R′的平均值，再根据R′的平均值以及步骤(2)中的R值的范围确定对应的细胞为转染何种质粒的细胞，这里可以是先在每个细胞中圈一个区域计算R值，得到R值后，确定这个细胞里转染了哪种质粒，然后再从这个细胞中多圈几个区域进行测量，得到多组数据再进行后续计算；如需要较大的数据量，可以先圈取同一培养皿中的不同视野的多个区域，计算得到相应的R值后再进行细胞分类，确定这些细胞对应是转染了哪种质粒，最后将这些数据代入公式进行后续计算。
对于实验样本1，先选定视野进行三通道荧光成像(如图1中DD，DA，AA为三通道所成的细胞荧光像)，在所成的像中圈取区域(这里圈了5个细胞的区域和1个背景区域)，计算每个区域的R值以确定对应的区域转染了哪一种质粒，例如这里区域1、区域2转染了CTV，区域3、区域4、区域5转染了C17V。计算过程如下：
(i)计算所圈区域的R值：这里计算的圈取了区域1和区域3的三通道的每个通道的平均荧光强度：IDD1′＝1.708、IDA1′＝4.961、IAA1′＝5.141；IDD3′＝1.453、IDA3′＝1.377、IAA3′＝2.704，并根据步骤(1)中计算得到的串扰系数a，b，c，d和公式(1)，计算得到受体敏化荧光强度FC1′＝3.232和FC3′＝0.126，再计算比值R1′＝FC1′/IDD1′＝1.892和R3′＝FC3′/IDD3′＝0.087。
(ii)区分所圈区域转染了哪种质粒：根据步骤(2)中的R′值的范围：R1′∈RC17V(即R1′在RC17V的范围内)，R3′∈RCTV，即R1′对应的细胞为转染了C17V质粒的细胞，R3′对应的细胞为转染了CTV质粒的细胞。
(iii)按质粒区分好的区域数据代入公式：将这两种质粒的IDD′、IAA′、FC′值代入(2)(3)(4)式，最终求得G因子(G＝2.84)，k因子(k1＝(IDD1′+FC1′/G)/IAA1′＝0.554，k2＝(IDD3′+FC3′/G)/IAA3′＝0.554，取两者的平均值k＝0.554)和消光系数比γ(γ＝0.088)；其中，对于k因子，一般是按每一个细胞(或区域)分别计算k值，再取所有k值的平均值，即为所需要的k因子。
同时，计算y1＝FC1/(a×IAA1)和x1＝IDD1/(a×IAA1)，以及y2＝FC2/(a×IAA2)和x2＝IDD2/(a×IAA2)，根据计算结果可知，当样本的质粒种类为2时，G因子G＝(y2-y1)/(x1-x2)(G＝2.84)，再根据公式(3)和(4)可以计算得到k因子和消光系数比γ。
图1是分别表达了CTV和C17V质粒的样本在一个皿中的一个成像视野得到不同细胞的R值的统计图。
②对实验样本2(CTV+C5V+C17V+C32V四质粒样本)的Hela细胞，先选定视野进行三通道荧光成像(如图2，DD，DA，AA为三通道所成的细胞荧光像，针对圈区域得到的数据，扣除背景及曝光时间归一化获得三通道的荧光强度)，在所成的像中圈取区域(这里圈了8个细胞的区域和1个背景区域)，计算每个区域的R值以确定对应的区域转染了哪一种质粒，这里计算得到区域1、区域2、区域3转染了CTV，区域8转染了C5V、区域6、区域7转染了C17V，区域4、区域5转染了C32V，按质粒的类型CTV、C5V、C17V、C32V区分好圈取的区域后，本实验选取区域1、区域4、区域6和区域8四组三通道的数据，每组中每个通道的平均荧光强度数据如下：IDD1″＝2.825、IDA1″＝2.948、IAA1″＝5.186；IDD4″＝2.227、IDA4″＝4.778、IAA4″＝5.488；IDD6″＝0.290、IDA6″＝0.732、IAA6″＝0.783；IDD8″＝0.188、IDA8″＝0.598、IAA8″＝0.577，并根据步骤(1)中计算得到的串扰系数a，b，c，d和公式(1)，计算得到受体敏化荧光强度FC1″＝0.525、FC4″＝2.684、FC6″＝0.451、FC8″＝0.406，再计算比值R1″＝FC1″/IDD1″＝0.186、R4″＝FC4″/IDD4″＝1.205、R6″＝FC6″/IDD6″＝1.556、R8″＝FC8″/IDD8″＝2.161。因此，根据步骤(2)中的R值的范围：R1″∈RCTV，R4″∈RC32V，R6″∈RC17V，R8″∈RC5V。即R1″对应的细胞为转染了CTV质粒的细胞，R4″对应的细胞为转染了C32V质粒的细胞，R6″对应的细胞为转染了C17V质粒的细胞，R8″对应的细胞为转染了C5V质粒的细胞。
这里获得受体敏化荧光强度与供体荧光强度的比值R″时，可以参考上述步骤(2)②的方式，选定多个不同视野内的数个典型细胞(细胞个数或区域越多越好，最好大于10个细胞或区域)进行测定，再根据R′以及步骤(2)中的R值的范围确定对应的细胞为转染何种质粒的细胞。
对于上述实验样本2，对区域1、区域4、区域6和区域8的细胞计算y1＝FC1″/(a×IAA1″)和x1＝IDD1″/(a×IAA1″)，y4＝FC4″/(a×IAA4″)和x4＝IDD4″/(a×IAA4″)，y6＝FC6″/(a×IAA6″)和x6＝IDD6″/(a×IAA6″)，y8＝FC8″/(a×IAA8″)和x8＝IDD8″/(a×IAA8″)，将x1，x4，x6，x8(横坐标)和y1、y4，y6，y8(纵坐标)通过最小二乘法拟合得到一条直线，该直线斜率的绝对值为G因子，直线y轴截距的倒数为消光系数比γ，最后计算k因子：k＝(IDD+FC/G)/IAA。即y1＝0.731和x1＝3.936，y4＝3.533和x4＝2.932，y6＝4.157和x6＝2.673，y8＝5.087和x8＝2.354，以xi为横坐标，yi为纵坐标进行最小二乘法拟合得到的直线y＝-2.7434x+11.535；G＝2.743，γ＝1/11.535＝0.087，k＝0.582(k1＝(IDD1″+FC1″/G)/IAA2″＝0.582；k2＝0.584；k3＝0.580；k4＝0.582；k为k1、k2、k3和k4的平均值)。
图2a为实验样本2中的一个典型视野，图2b为不同细胞区域按表达了不同质粒进行区分的R值的统计图，图2c为对实验样本2中区域1(y1，x1)、区域4(y4，x4)、区域6(y6，x6)和区域8(y8，x8)的数据，以xi为横坐标，yi为纵坐标进行最小二乘法拟合得到的直线。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，如本发明中细胞分类方法是通过定义R值来对细胞进行分类，R＝FC/IDD为分类的标准，而在实际应用中，任何使用光谱信息的改变从而可以区分不同转染质粒的细胞的方法，都包含在本发明的保护范围之内。
