一种利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种用于疾病体外诊断的方法策略。更具体地，涉及一种利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器及其制备方法。
背景技术
随着科学技术的快速发展及生活水平的提高，人们对身体健康越来越重视。对常见重大疾病准确的诊断，有利于疾病的早发现、早治疗，从而有力保障人民的健康。生物传感器是重大疾病体外诊断的重要方式，它主要由分子识别元件与信号转换元件构成的分析检测器件。其中，光电化学生物传感是将光电化学技术与电化学分析法有机结合而发展起来的新一代传感技术。它不仅继承了电化学生物传感具有装置简单、操作方便、花费低、易于集成化和微型化的优点，还使得背景干扰低；并且体系能够实现自供能，更易于实时快速的现场检测。
光电化学生物传感按传感类别分为阳极传感和阴极传感两种。虽然阳极光电化学生物传感输出的光电流信号明显，灵敏度较高，但由于阳极界面发生的是电子氧化反应，实际生物样品中多组分还原性物质如抗坏血酸、多巴胺、谷胱甘肽等对检测结果的准确性有一定的干扰；然而阴极界面发生的是电子还原反应，使得阴极光电化学生物传感具有优良的抗实际生物样品中多组分还原性物种干扰的能力，以致光电化学生物传感更具有在实际复杂生物样品中准确检测的潜力。然而，目前对高灵敏阴极光电化学生物传感器的研制还处于初级阶段，尤其是针对高效信号放大策略的设计和开发报道很少。
此外，胆红素氧化酶(Bilirubin Oxidase,BOD)活性中心有T1，T2，T3 四个铜离子，T1活性位点接触氧化底物并负责传递电子给受体O2，构成三角形的T2、T3活性位点负责将氧气还原为水。且高效的BOD催化氧还原，能够加速阴极光电化学传感系统的电荷流动，从而明显增强阴极光电流检测信号。虽然目前基于BOD催化氧还原在生物燃料电池领域应用较多，但利用BOD催化氧还原这种优秀的信号放大策略在阴极光电化学免疫传感领域尚无任何相关应用的报道。
因此，开发一种灵敏度高、利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器，不仅为阴极光电化学免疫传感器提供一种高效的信号放大策略，还能有效提升对抗原类疾病标志物的检测灵敏度，其对于疾病体外诊断具有十分深远的意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，提供一种灵敏度高、利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器，所述阴极光电化学免疫传感器是以P型半导体材料作为光电化学基底，将胆红素氧化酶作为信号放大元件，标记于信号抗体，通过捕获抗体探针、目标抗原和信号抗体之间的夹心免疫反应，实现阴极光电流检测信号的显著放大和对目标抗原的灵敏检测；其中将胆红素氧化酶信号放大元件负载于碳纳米管上，可提高所述胆红素氧化酶的负载量和催化氧还原反应效率。
需要说明的是，前列腺特异抗原(prostate specific antigen，PSA)是由前列腺上皮细胞分泌产生，属激肽酶家族蛋白，存在于前列腺组织和精液中，正常人血清中含量极微。PSA的主要生理功能是可防止精液凝固，具有极高的组织器官特异性，是目前诊断前列腺癌的首选标志物。因此，本发明以PSA 作为目标检测物，具有一定的代表性。
此外，胆红素氧化酶BOD在中性溶液中催化氧(O2)还原反应的活性很高，且过电位较低。同时碳纳米管(CNT)作为一维纳米材料，具有比表面积大、导电能力优异等显著优点。本发明选择CNT作为BOD的载体，能够明显增加BOD的负载量，显著提升氧还原反应催化效率。
本发明的另一目的是提供一种利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器的制备方法，具体步骤包括：
(1)制备CdSe/NiO光阴极：以宽带隙P型半导体NiO作为阴极光电化学基底，在所述基底表面修饰窄带隙敏化剂CdSe量子点QDs，制备CdSe/NiO 异质结光阴极；
(2)制备免疫传感电极：用前列腺特异抗原PSA对应的捕获抗体Ab1修饰步骤(1)制备的CdSe/NiO光阴极，并用牛血清白蛋白封闭电极活性位点，室温孵育，得到免疫传感电极；
(3)制备Ab2-BOD/CNT：将胆红素氧化酶BOD和前列腺特异抗原PSA 对应的信号抗体Ab2一起负载于碳纳米管CNT上，制备BOD/CNT标记的Ab2；
(4)将所述免疫传感电极在室温下孵育目标Ag，以使Ab1与Ag发生特异性免疫反应；随后所述免疫传感电极在室温下继续孵育所述Ab2-BOD/CNT，使得Ag与Ab2发生特异性免疫反应，以使在所述免疫传感电极上引入 BOD/CNT复合物，即得所述阴极光电化学免疫传感器。
通过采用上述技术方案，本发明的有益效果如下：
本发明公开的制备方法简单、易于操作，适于推广与应用。
优选的，所述步骤(1)中，将氧化铟锡电极插入盛有C6H12N4和Ni(NO3)2混合液的反应釜中，加热、煅烧，得到NiO修饰电极；配制CdSeQDs溶液，并将所述NiO修饰电极分别在阳离子聚合物PDDA溶液和CdSeQDs溶液中浸泡，最终得到CdSe/NiO光阴极。
需要说明的是，CdSe/NiO光阴极制备过程简单、操作方便，且阴极电流信号响应明显、光化学稳定性好。
进一步优选的，所述混合液中C6H12N4和Ni(NO3)2的摩尔比为1：1；所述CdSeQDs溶液的配制过程为：在CdCl2水溶液中加入巯基乙酸，调节pH 至10.0，通N2除氧并加入NaHSe溶液，回流制得。
优选的，所述步骤(2)中，在活化后的CdSe/NiO光阴极上滴加Ab1，低温孵育，随后用磷酸盐缓冲液冲洗干净后，滴加牛血清白蛋白溶液，室温孵育以封闭电极活性位点，最终得到免疫传感电极。
需要说明的是，上述阴极免疫传感电极制备条件温和、过程简单快速、样品消耗量小。
进一步优选的，所述Ab1低温孵育的浓度为100～250μg/mL。
优选的，所述步骤(3)中，在CNT分散液中加入EDC/NHS溶液，室温活化，随后将BOD和Ab2混合加入到活化后的CNT溶液中，低温孵育，得到BOD/CNT标记的Ab2，即Ab2-BOD/CNT。
优选的，所述步骤(4)中，所述免疫传感电极上滴加目标Ag室温孵育后，在所述免疫传感电极上继续滴加所述Ab2-BOD/CNT室温孵育1～2h，以最终在免疫传感电极上引入BOD/CNT复合物。
需要说明的是，上述本发明公开保护的BOD/CNT复合物制备方法简单、信号放大效果显著；
以及所述免疫传感电极对目标Ag的检测步骤简单、无需样品提纯，灵敏度高、准确、方便、快速。
示范性的，本发明优选的制备方案为：
(1)利用宽带隙P型半导体NiO作为阴极光电化学基底，修饰窄带隙敏化剂CdSe量子点(QDs)，制备CdSe/NiO异质结光阴极：
1)将修饰面积为0.25cm2的氧化铟锡(ITO)电极垂直插入盛有0.25M C6H12N4和0.25M Ni(NO3)2混合液的反应釜中，溶液加热至90℃反应10min 后，将电极取出、洗净，然后在300℃下煅烧30min，得到NiO修饰电极；
2)在60mL浓度为2mM的CdCl2水溶液中加入24μL巯基乙酸，用 NaOH调节pH至10.0，通N2除氧30min后，将0.84mL浓度为70mM的新制NaHSe溶液加入其中，溶液在100℃回流2h，得到CdSeQDs；
3)将NiO修饰电极依次在质量分数1％的聚二甲基二烯丙基氯化铵 (PDDA)溶液和CdSe QDs溶液中分别浸泡10min，该过程为1次覆盖，3 次覆盖后便得到CdSe/NiO光阴极。
(2)将PSA捕获抗体(Ab1)修饰于步骤(1)制备的CdSe/NiO光阴极，用牛血清白蛋白封闭电极活性位点后，完成免疫传感电极的制备：
将CdSe/NiO光阴极在10mM EDC/NHS溶液中活化30min，去离子水洗净后，在活化后的CdSe/NiO光阴极上滴加20μL 100μg/mL的Ab1，4℃冰箱中孵育过夜；随后用磷酸盐缓冲液(10mM，pH 7.4)将电极洗净后，滴加20 μL质量分数1％的牛血清白蛋白溶液，室温孵育1h，封闭电极活性位点，即完成免疫传感电极的制备。
(3)将BOD和PSA信号抗体(Ab2)一起负载于碳纳米管(CNT)上，制备BOD/CNT标记的Ab2：
在200μL 0.5mg/mL CNT分散液中加入10mM EDC/NHS溶液，室温活化30min，随后将150μL 4mg/mL BOD和150μL 400μg/mL Ab2混合加入到 200μL活化后的CNT溶液中，4℃冰箱中反应过夜，随后经离心洗涤后，即得到BOD/CNT标记的Ab2。
(4)对PSA目标抗原(Ag)的检测采用夹心免疫反应：
将步骤(2)制备的免疫传感电极孵育20μL不同浓度的待测目标Ag1h，让Ab1与Ag发生特异性免疫反应；随后免疫传感电极继续在室温下孵育20μL 步骤(3)制备的BOD/CNT标记的Ab21h，让Ag与Ab2发生特异性免疫反应，从而在免疫传感电极上引入BOD/CNT复合物，即得所述阴极光电化学免疫传感器。
本发明还有一个目的，就是提供上述利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器在体外诊断产品中的应用。
进一步的，所述阴极光电化学免疫传感器的测试环境是pH为6.5～7.5的缓冲溶液，并以溶解氧作为电子受体。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明提供了一种利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器及其制备方法与应用，具有如下优异效果：
1)传感器具有装置简单、操作方便、花费低、背景干扰低、体系自供能的显著特点，同时具有对目标Ag检测光电流信号响应明显、灵敏度高、抗干扰能力强的独特优势。
2)本发明公开利用胆红素氧化酶高效的催化氧还原反应活性，能够加速阴极光电化学传感系统的电荷流动，从而明显增强阴极光电流检测信号，其不仅为阴极光电化学免疫传感器提供一种高效的信号放大策略，还能有效提升对抗原类疾病标志物的检测灵敏度，适于市面推广与应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为不同CdSeQDs覆盖次数对应CdSe/NiO光阴极的光电流响应图。
图2为不同Ab1孵育浓度对应Ab1修饰光阴极的光电流响应图。
图3为不同Ab2-BOD/CNT孵育时间对应免疫传感电极的光电流响应图。
图4为NiO纳米膜的扫描电子显微镜图。
图5为CdSeQDs的高分辨透射电子显微镜图。
图6为CdSe/NiO光阴极的扫描电子显微镜图。
图7为CdSe/NiO光阴极的X射线光电子能谱图。
图8为阴极光电化学免疫传感电极制备过程的光电流响应图。
图9为Ab2-BOD/CNT的扫描电子显微镜图。
图10为阴极光电化学免疫传感器对目标Ag检测的光电流信号图。
图11为阴极光电化学免疫传感器对目标Ag检测的标准曲线图。
图12为阴极光电化学免疫传感器的抗干扰实验数据图。
具体实施方式
下面将结合本发明说明书附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例公开了一种灵敏度高、以P型半导体材料作为光电化学基底并利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器。
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
下面，将结合具体实施例，对本发明的技术方案进行进一步的说明。
实施例1
因CdSe/NiO光阴极的光电流输出大小对最终制备的阴极光电化学免疫传感器的检测灵敏度有重要影响，所以下述对CdSe/NiO光阴极的制备工艺参数进行了优化：
且因CdSeQDs的覆盖次数可以反映其在电极上的修饰量，所以对CdSe QDs的覆盖次数进行优化，具体如下：
将NiO修饰电极依次在质量分数1％的聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA) 溶液和CdSeQDs溶液中分别浸泡10min，该过程为1次覆盖。分别执行1次、2 次、3次、4次、5次覆盖后，得到不同修饰量的CdSe/NiO光阴极。
通过进行光电流表征测试可得，如附图1所示，当CdSeQDs的覆盖次数为3次时，CdSe/NiO光阴极的光电流响应最佳，因此选择CdSeQDs的覆盖次数为3次作为最佳的制备工艺参数。
实施例2：
因免疫传感电极上PSA捕获抗体探针(Ab1)的修饰量，对阴极光电化学免疫传感器的定量检测范围有显著影响，所以对修饰Ab1的制备工艺参数进行了优化：
且因Ab1在免疫传感电极上的修饰量，可以通过其在电极上的孵育浓度体现，所以下述对Ab1的孵育浓度进行了优化，具体如下：
将优化的CdSe/NiO光阴极在10mM EDC/NHS溶液中活化30min，去离子水洗净后，在活化后的CdSe/NiO光阴极上滴加浓度分别为50μg/mL、100 μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL的PSA捕获抗体探针(Ab1)，在4℃冰箱中孵育过夜，并用磷酸盐缓冲液(10mM，pH7.4)将电极洗净后，得到Ab1修饰光阴极。
通过进行光电流表征测试可得，如附图2所示，Ab1的孵育浓度需要大于等于100μg/mL，这样才能保证Ab1在传感电极上的充分固定，以获得最佳的定量检测范围，因此选择大于等于100μg/mL的Ab1作为最优孵育浓度。
实施例3：
因Ab2-BOD/CNT在免疫传感电极上的修饰量，对阴极光电化学免疫传感器的信号放大效果具有显著影响，所以对Ab2-BOD/CNT在免疫传感电极上的孵育参数进行了优化：
且因Ab2-BOD/CNT在免疫传感电极上的修饰量，可以通过其在电极上的孵育时间体现，所以下述对Ab2-BOD/CNT的孵育时间进行了优化，具体如下：
将所述免疫传感电极孵育20μL不同浓度的待测目标Ag1h，让Ab1与 Ag发生特异性免疫反应。随后，免疫传感电极继续在室温下孵育20μL所述 Ab2-BOD/CNT，孵育时间分别为20min、40min、60min、80min、100min、 120min，让Ag与Ab2发生特异性免疫反应，从而在免疫传感电极上引入 BOD/CNT复合物，即得所述阴极光电化学免疫传感器。
通过进行光电流表征测试可得，如附图3所示，Ab2-BOD/CNT的孵育时间需要大于等于1h，这样才能保证Ab2-BOD/CNT在传感电极上的充分固定，以获得最佳的信号放大效果，因此选择大于等于1h作为Ab2-BOD/CNT的最优孵育时间。
本发明内容不仅限于上述各实施例的内容，其中一个或几个实施例的组合同样也可以实现本发明目的。
为了进一步验证本发明的优异效果，发明人还进行了如下实验：
首先需要说明的是，本发明下述实验中光电流信号是在光电化学系统上测试完成的，150W氙灯作为激发光源，光强度约为300mW/cm2，每10s开 /关光源一次，光电流的记录由电化学工作站完成。
且使用的三电极体系为：修饰面积为0.25cm2的传感电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极；以及系统外加电压为0.0 V。
实验例一：
(1)NiO纳米膜修饰电极的制备，具体制备步骤如下所示：
将洗净的ITO电极垂直插入盛有0.25M C6H12N4和0.25M Ni(NO3)2混合液的反应釜中，溶液加热至90℃反应10min后，将电极取出、洗净，然后在 300℃下煅烧30min，自然冷却至室温。
其中，扫描电子显微镜如附图4所示，NiO纳米膜为由高密度厚约10-12 nm光滑纳米片组成的内部互联三维多孔结构。
(2)CdSe量子点(QDs)的合成，具体制备步骤如下所示：
在60mL浓度为2mM的CdCl2水溶液中加入24μL巯基乙酸，用NaOH 调节pH至10.0，继续通N2除氧后，将0.84mL浓度为70mM的新制NaHSe 溶液加入其中，溶液在100℃回流2h，得到CdSeQDs。
其中，高分辨透射电子显微镜如附图5所示以及尺寸分布如其插图所示， CdSeQDs颗粒尺寸均匀，平均直径约2.72nm。
实验例二：
CdSe/NiO光阴极的制备步骤如下：
将实验例一制备的NiO纳米膜修饰电极依次在质量分数1％的PDDA溶液和CdSeQDs溶液中分别浸泡10min，该过程为1次循环，3次循环后得到所需的CdSe/NiO光阴极。
其中，扫描电子显微镜如附图6所示，大量的微小纳米颗粒较为均匀地分布在NiO纳米膜片面结构上，表明CdSe QDs在NiO修饰电极上成功修饰。
X射线光电子能谱如附图7所示，CdSe/NiO光阴极包含Ni、O、C、Cd、 Se这些特征元素，其中C 1s是测试仪器使用的内标，用来矫正结合能。
且由上述图7中，典型的X射线光电子能谱元素特征峰Ni 2p、O 1s、Cd 3d、Se 3d的出现，表明了CdSe/NiO光阴极成功制备。
在CdSe/NiO光阴极上滴加20μL含有10mM EDC/NHS的水溶液，电极在室温活化30min后，用纯水洗净；然后，在电极上滴加20μL 100μg/mL 的PSA捕获抗体(Ab1)，在4℃冰箱中孵育过夜；用磷酸盐缓冲液(PBS， pH 7.4，10mM)将电极洗净后，滴加20μL质量分数1％的牛血清白蛋白(BSA) 溶液，室温孵育1h后，完成传感电极构建。
其中，光电流响应如附图8所示，NiO修饰电极具有较小的阴极光电流响应(曲线a)；修饰CdSe QDs后，阴极光电流显著增加(曲线b)，这是由于CdSe QDs对NiO纳米膜的敏化作用；依次修饰Ab1和BSA后，光电流逐渐减小(曲线c和d)，这是由于Ab1和BSA是蛋白质属性，它们的空间位阻阻碍了电荷交换反应。由此证明了阴极光电化学免疫传感电极成功制备。
实验例三：
CNT负载BOD(BOD/CNT)标记的Ab2(Ab2-BOD/CNT)的制备步骤如下所示：
1)配置100mL浓硫酸和浓硝酸(3:1，V/V)的混合液，向其中加入200 mg CNT，超声2h后，静置过夜，用去离子水洗涤浓酸处理后的CNT，直至溶液呈中性，随后50℃干燥，得到酸化后的CNT；
2)称取0.5mg酸化后的CNT粉末，将其分散于1mL去离子水中，超声20min后得到0.5mg/mL CNT分散液；
3)取200μL 0.5mg/mL CNT分散液，向其中加入10mM EDC/NHS溶液，室温活化CNT30min，随后将150μL 4mg/mL BOD和150μL 400μg/mL Ab2混合并加入到200μL活化后的CNT溶液中，4℃冰箱中反应过夜；经离心洗涤后，即得到CNT负载BOD(BOD/CNT)标记的Ab2(Ab2-BOD/CNT)；并将所得的Ab2-BOD/CNT分散到1.0mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH＝7.4)中， 4℃保存备用。
具体地，扫描电子显微镜如附图9所示，原来表面光滑、直径约20nm 的碳纳米管(CNT)，经BOD及Ab2负载后，表面变粗糙且直径增加至30nm 左右，表明了Ab2-BOD/CNT成功制备。
实验例四：
基于BOD催化信号放大对PSA目标抗原(Ag)的检测：
将实验例二制备的阴极光电化学免疫传感电极首先在室温下孵育20μL 不同浓度的目标Ag1h，磷酸盐缓冲液(10mM，pH＝7.4)清洗后，将传感电极继续在室温下孵育20μL实验例三制备的Ab2-BOD/CNT1h，使得Ag与 Ab2发生特异性免疫反应，以最终在免疫传感电极上引入BOD/CNT复合物，即得所述阴极光电化学免疫传感器。
最终的免疫传感电极在含有溶解氧(O2)的磷酸盐缓冲液(pH 7.4，0.1M) 中进行光电流信号测量。
检测结果表明：随着目标Ag浓度的增加，阴极光电流信号逐渐增强，如附图10所示；
且在目标Ag浓度为1pg/mL到1ng/mL范围内，阴极光电流信号变化值与目标Ag浓度的对数成线性关系，如附图11所示，线性相关系数为0.9989，实验最低检测限为1pg/mL，得以表明通过本发明公开制备的利用胆红素氧化酶放大检测信号的阴极光电化学免疫传感器对目标检测物质具有较高的灵敏度。
实验例五：
为了证明上述阴极光电化学免疫传感器具有优良的抗干扰能力，包括对生物大分子的干扰以及对还原性小分子的干扰，而选择常见的其他疾病标志物抗原：癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、白介素6(IL-6)，以及常见的还原性小分子：抗坏血酸(AA)、多巴胺(DA)、葡萄糖(Glu)、半胱氨酸(Cys)作为典型的干扰物，具体操作如下：
取100pg/mL的CEA、AFP、IL-6和20mM的AA、DA、Glu、Cys分别加入含有100pg/mL PSA标准样品的稀释10倍的血清中。并利用本发明制备的阴极光电化学免疫传感器按上述方法分别检测，光电流信号响应如附图12 所示。
结果表明，存在潜在干扰物质如CEA、AFP、IL-6、AA、DA、Glu、Cys 的测试结果与仅有目标物PSA的光电流信号没有明显差距，误差保持在6％以内。由此证明了本发明制备的阴极光电化学免疫传感器不仅具有高灵敏度，亦同时具有抗生物大分子及还原性小分子干扰的能力，在实际复杂生物基质中具有优良的应用潜力。
此外，为了进一步验证上述阴极光电化学免疫传感器的正确性及实用性，取已知浓度分别为50pg/mL、200pg/mL的标准样品加入稀释10倍的血清中，利用本发明制备的阴极光电化学免疫传感器按上述方法分别检测、计算各样品的浓度，结果依次为52.6pg/mL、192.8pg/mL，通过数值对比，可以得到对50pg/mL、200pg/mL的标准样品的回收率分别为105.2％、96.4％，检测结果的误差范围均在6％以内，由此进一步证明了本发明制备的阴极光电化学免疫传感器对目标Ag能够实现快速、灵敏、准确及高效的检测。
对所公开的实施例及实验例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
