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神经酰胺抗肿瘤药及其制备方法

2020-11-13 11:11:04

  神经酰胺抗肿瘤药及其制备方法

  技术领域

  本发明属于医药技术领域,具体涉及一种神经酰胺抗肿瘤药及其制备方法。

  背景技术

  当前癌症仍以化疗为主要手段,副作用明显,而且导致大部分病患因化疗无效死亡。最近寻找低毒、有效的抗癌先导分子已成为目前的热点。具有生物活性的鞘脂类在调节和影响许多重要的生物进程中的作用越来越明确,这些脂类和癌症发病机理和治疗存在紧密联系。越来越多的研究表明,神经酰胺含量的异常和一些鞘脂代谢过程中的酶的表达与癌症的产生、发展、增值、入侵和转移都有一定的关系,因此使用小分子神经酰胺类似物或神经酰胺代谢酶抑制剂是癌症治疗的新方法。神经酰胺被认为是一种可以抑制肿瘤细胞的脂质。神经酰胺类似物具有膜渗透性的,其优点在于可以对某一具体区域的癌细胞发起攻击,杀灭区域明确,且不会使健康细胞受到损伤。

  近年来发现魔芋中含有神经酰胺的分子结构,而且,近年来,魔芋的种植面积和加工生产量都在飞速发展,在生产的同时产生的大量副产品,由于副产品抗营养且含有异味,一般都废弃不用,不仅浪费,而且污染环境。但是,其副产品中神经酰胺的含量达0.15%~0.20%,与大豆、小麦等其他来源相比,含量相对较高。所以从魔芋副产品中提取神经酰胺是一个很好的增加经济效益和社会效益的途径,但如何提取还是一大难题。

  发明内容

  基于上述技术背景,本发明的目的在于解决现有技术的不足,提供了一种无毒副作用且抗肿瘤效果好的神经酰胺抗肿瘤药及其制备方法。

  为了实现上述发明目的,本发明提供如下技术方案:

  神经酰胺抗肿瘤药制备方法,具体包括如下步骤:

  (1)原料处理:将去皮魔芋在80℃-90℃的烘箱内烘干后,去除杂质,然后粉碎并过筛备用。

  (2)发酵培养:将菌种种子液与魔芋原料粉按一定质量比混合后放入发酵罐内,一定温度下培养发酵。

  (3)匀浆破壁:培养发酵结束后,将发酵物加入蒸馏水中混合,混合均匀后,加入高压均质机,经高压均质后获得破壁匀浆物。

  (4)将步骤(3)所得破壁匀浆物装入超临界萃取釜中,采用CO2超临界流体萃取分离,所获含萃取物的超临界CO2流体,经减压解析分离出萃取产物,收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品。

  (5)将步骤(4)所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中,采用CO2超临界流体进行二次萃取分离,加入夹带剂,所获含萃取物的超临界CO2流体,经减压解析分离出萃取产物,收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品。

  (6)将步骤(5)中所制得神经酰胺纯品添加药物赋形剂制成药物剂型。

  进一步的,步骤(1)中粉碎后原料过20-40目筛。

  进一步的,步骤(2)中培养温度为28~35℃。

  进一步的,步骤(2)中培养时间为5-7天。

  进一步的,步骤(2)中发酵罐内空间氧浓度为0.02mol/L。

  进一步的,步骤(2)中将菌种种子液与魔芋原料粉质量比为3:1。

  进一步的,步骤(2)中菌种可以为桑黄菌或乳酸菌。

  进一步的,步骤(2)中菌种种子液制备方法如下:

  (a)菌种活化:用接种钩将菌种从斜面上切1cm2带培养基的斜面菌丝接入固体培养基中部,30℃培养5天;

  (b)种子液制备:用接种钩将带有培养后菌种的固体培养基捣碎,然后加入适量无菌水,得到桑黄种子液;

  进一步的,步骤(3)中发酵物与蒸馏水的质量比为1:1。

  进一步的,步骤(3)中经常温、70Mpa高压均质5次。

  进一步的,步骤(4)中萃取温度为30℃,萃取压力15MPa,萃取时间为0.5小时,CO2流速为10L/h。

  进一步的,步骤(4)中分离温度30℃,分离压力为5MPa。

  进一步的,步骤(5)中所述夹带剂为体积百分比85%的乙醇水溶液,萃取压力30MPa,萃取温度为35℃,萃取时间为1小时,CO2流速为10L/h,分离压力为5MPa,分离温度35℃。进一步的,步骤(6)中所述赋形剂包括阿拉伯胶、淀粉、糖浆、乙基纤维素醇溶液。

  基于上述方法制备的神经酰胺抗肿瘤药,其特征在于所述抗肿瘤药可以为片剂、针剂、胶囊、滴丸、颗粒、注射剂。

  本发明有益效果为:真正的从魔芋中提取了神经酰胺,提取率高,提取成本较现有技术中方法低;所制备药物抗癌效果好,无毒副作用。

  附图说明

  图1为胰腺癌细胞数量对比图;

  图2为不同浓度神经酰胺用药后肿瘤大小对比图。

  具体实施方式

  为了便于理解,下面结合附图,通过实施例对本发明作进一步详细说明。

  实施例1

  一种发酵法从魔芋中制备神经酰胺的方法,所述方法具体包括:

  (1)原料处理:将去皮魔芋在80℃的烘箱内烘干后,去除杂质,然后粉碎并过20-40目筛;

  (2)菌种活化:用接种钩将桑黄菌从斜面上切1cm2带培养基的斜面菌丝接入固体培养基中部,30℃培养5天;

  (3)种子液制备:用接种钩将带有桑黄菌的固体培养基捣碎,然后加入适量无菌水,得到桑黄种子液;

  (4)发酵培养:将桑黄种子液与魔芋原料粉按质量比3:1的比例混合,放入发酵罐内,30℃条件下培养5天,控制发酵罐内空间氧浓度为0.02mol/L;

  (5)匀浆破壁:发酵结束后,将发酵物加入等重量的蒸馏水,混合均匀后,通过高压均质机,常温,70Mpa,高压均质5次,获得破壁匀浆物;

  (6)将步骤(5)所得破壁匀浆物装入超临界萃取釜中,采用CO2超临界流体萃取分离,萃取温度为30℃,萃取压力15MPa,萃取时间为0.5小时,CO2流速为10L/h;所获含萃取物的超临界CO2流体,经减压解析分离出萃取产物,分离温度30℃,分离压力为5MPa,收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品A。

  (7)将步骤(6)所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中,进行二次萃取分离,加入30%的夹带剂(夹带剂为体积百分比85%的乙醇水溶液),萃取压力30MPa,萃取温度为35℃,萃取时间为1小时,CO2流速为10L/h;所获含萃取物的超临界CO2流体,经减压解析分离出萃取产物,分离压力为5MPa,分离温度35℃,收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品1。

  本发明所述方法利用灵芝菌发酵米糠,不仅能显著提高米糠中神经酰胺的溶出,而且灵芝菌也会产生一定量的神经酰胺,故不需要任何衍生化过程,操作简单,提取方便;发酵周期短、见效快,且不受地区气候限制;利用本发明工艺生产神经酰胺,能大幅减少有机溶剂的用量,减少环境影响,降低经济成本。

  实施例2

  一种发酵法从魔芋中制备神经酰胺的方法,所述方法具体包括:

  (1)原料处理:将去皮魔芋在80℃的烘箱内烘干后,去除杂质,然后粉碎并过20-40目筛;

  (2)菌种活化:用接种钩将桑黄菌从斜面上切1cm2带培养基的斜面菌丝接入固体培养基中部,35℃培养5天;

  (3)种子液制备:用接种钩将带有桑黄菌的固体培养基捣碎,然后加入适量无菌水,得到桑黄种子液;

  (4)发酵培养:将桑黄种子液与魔芋原料粉按质量比3:1的比例混合,放入发酵罐内,35℃条件下培养5天,控制发酵罐内空间氧浓度为0.02mol/L;

  (5)匀浆破壁:发酵结束后,将发酵物加入等重量的蒸馏水,混合均匀后,通过高压均质机,常温,70Mpa,高压均质5次,获得破壁匀浆物;

  (6)将步骤(5)所得破壁匀浆物装入超临界萃取釜中,采用CO2超临界流体萃取分离,萃取温度为30℃,萃取压力12MPa,萃取时间为1小时,CO2流速为10L/h;所获含萃取物的超临界CO2流体,经减压解析分离出萃取产物,分离温度30℃,分离压力为5MPa,收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品A。

  (7)将步骤(6)所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中,进行二次萃取分离,加入30%的夹带剂(夹带剂为体积百分比85%的乙醇水溶液),萃取压力25MPa,萃取温度为35℃,萃取时间为1.5小时,CO2流速为10L/h;所获含萃取物的超临界CO2流体,经减压解析分离出萃取产物,分离压力为5MPa,分离温度35℃,收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品。

  实施例3

  一种发酵法从魔芋中制备神经酰胺的方法,所述方法具体包括:

  (1)原料处理:将去皮魔芋在80℃的烘箱内烘干后,去除杂质,然后粉碎并过20-40目筛;

  (2)发酵培养:将乳酸菌与魔芋原料粉按质量比3:1的比例混合,放入发酵罐内,30℃条件下培养5天,控制发酵罐内空间氧浓度为0.02mol/L;

  (3)匀浆破壁:发酵结束后,将发酵物加入等重量的蒸馏水,混合均匀后,通过高压均质机,常温,70Mpa,高压均质5次,获得破壁匀浆物;

  (4)将步骤(3)所得破壁匀浆物装入超临界萃取釜中,采用CO2超临界流体萃取分离,萃取温度为30℃,萃取压力15MPa,萃取时间为0.5小时,CO2流速为10L/h;所获含萃取物的超临界CO2流体,经减压解析分离出萃取产物,分离温度30℃,分离压力为5MPa,收集所得的萃取产物即为神经酰胺粗品A。

  (5)将步骤(4)所得神经酰胺粗品再次装入超临界萃取釜中,进行二次萃取分离,加入30%的夹带剂(夹带剂为体积百分比85%的乙醇水溶液),萃取压力30MPa,萃取温度为35℃,萃取时间为1小时,CO2流速为10L/h;所获含萃取物的超临界CO2流体,经减压解析分离出萃取产物,分离压力为5MPa,分离温度35℃,收集所得的萃取产物即为神经酰胺纯品1。

  下面通过实验来验证本发明技术方案:

  实验1:离体实验,用于验证神经酰胺对体外培养的人胰腺癌细胞的增殖抑制作用。

  实验方法包括如下步骤:

  1、将人胰腺癌细胞株按常规方法传代培养,收集对数生长期细胞,调节细胞悬液浓度。

  2、将细胞悬液加入96孔培养板中,每个孔加入180ul,加入37度恒温培养箱中24h。

  3、将神经酰胺用癌细胞培养液配成梯度浓度的溶液,将不同浓度神经酰胺的癌细胞细胞溶液加入96培养板中,并设有空白孔(只加入癌细胞培养液)用于对照。

  4、在37度恒温培养箱中48h后统计各孔中癌细胞的数量。统计胰腺癌细胞数量见图1。

  实验2:小鼠活体实验,用于验证神经酰胺对癌细胞裸鼠移植瘤的抑制作用。

  实验动物:2个月龄的BALB/c雄性裸鼠(购自上海斯克莱实验动物公司),共15只。

  实验方法:按以下方法建立在体裸鼠胰腺癌模型:裸鼠靠近右大腿皮下注射胰腺癌细胞株,2周后,待可见50mm3实体肿瘤后,根据腹腔内给药量的不同,将裸鼠按每组5只分成3组,分别为不给药的对照组,神经酰胺剂量为3mg/kg的为一组,神经酰胺剂量为5mg/kg的为一组。

  按前10天每天给药一次,后10天每2天给药一次的方式进行给药,共进行20天。每次记录裸鼠存活率、体重及肿瘤大小,共记录8周,记录肿瘤大小结果见图2。

  实验结果显示:神经酰胺能够抑制肿瘤的生长,并延长裸鼠的存活时间。神经酰胺浓度越大,抑制肿瘤的效果越好,小鼠存活率越长。

  上述实施例只是对本发明技术方案的举例说明或解释,而不应理解为对本发明技术方案的限制,显然,本领域的技术人员可对本发明进行各种修改和变型而不脱离本发明的精神和范围。倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也包含这些修改和变型在内。

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